بررسی اثرهای ضددیابتی و محافظت کبدی شربت

 کامبوچا در موش­های نر ویستار دیابتی­شده

با استرپتوزوتوسین

امیر آراسته^*، هانیه شیرقاسمی آلالان، سیده نگار موسوی جولندان، سعید ویسی، رضا باغبان خسرو آبادی، سیده نرگس نعیمی

باشگاه پژوهشگران جوان و نخبگان، واحد رشت، دانشگاه آزاد اسلامی، رشت، ایران

چکیده

سابقه و هدف: امروزه دیابت یکی از مشکل­های جدی در سلامت جوامع است. هم­چنین، نظریه‌های درمانی برای بیماری‌های عمومی کبد مثل سیروز، کبد چرب و هپاتیت مزمن مسئله‌ساز هستند. تأثیر کم داروها در بسیاری از بیماران، نیاز به بررسی و یافتن راه­های دیگر درمانی را اجتناب­ناپذیر ساخته است. پژوهش حاضر به بررسی اثر ضددیابتی و محافظت­کبدی شربت کامبوچا در موش­های نر نژاد ویستار پرداخته است.

مواد و روش­ها: ترکیب­های شربت کامبوچای تازه پس از 7 روز تخمیر با کروماتوگرافی گازی-طیف­سنجی جرمی و فعالیت آنتی­اکسیدانی آن با روش DPPH بررسی شد. موش­ها به پنج گروه تقسیم شده و گروه­های آزمون برای بررسی اثرهای ضددیابتی و محافظت کبدی به­ترتیب برای 14 و 32 روز، شربت کامبوچا را روزانه به­صورت خوراکی با دوزهای 2 و 4 میلی­لیتر به ازای هر کیلوگرم از وزن حیوان دریافت کردند. میزان قندخون با گلوکومتر و فعالیت آنزیم­های کبدی با کیت­های شرکت پارس­آزمون اندازه­گیری شد. نتایج با استفاده از آزمون آماری Student's T-Test و ANOVA و با استفاده از نرم­افزارSPSS  ویرایش 22 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

یافته­ها: شربت کامبوچا با 66/12 درصد گلوکورونیک­اسید و 57/4 درصد اتانول خاصیت آنتی­اکسیدانی دارد. بیش­ترین خاصیت آنتی­اکسیدانی به­میزان 58/89 درصد گزارش شد که این میزان همان درصد رادیکال­های آزاد احیاشده توسط عصاره است. قندخون در گروه­های آزمون اول و دوم ( mg/dl 160 و 112)، نسبت­به گروه کنترل منفی ( mg/dl436) کاهش معناداری نشان داد. فعالیت آنزیم­های کبدی نیز در گروه­های آزمون اول و دوم، نسبت­به گروه کنترل منفی کاهش معناداری نشان داد.

نتیجه­گیری: شربت کامبوچا با خاصیت آنتی­اکسیدانی بالا، اثرهای مفیدی در مدیریت بیماری دیابت و حفظ سلامت سلول­های کبدی در برابر ترکیب­های سمی دارد.

مقدمه

بیماری دیابت یکی از بیماری­های شایع در انسان است که طبق تخمین فدراسیون بین المللی دیابت، چهار درصد مردم مبتلا به این بیماری هستند. در این میان دسترسی به داروها و موادی که بتواند از میزان عوارض این بیماری بکاهد، بسیار حائز اهمیت است. استفاده از گیاهان دارویی و ترکیب­های سنتی از دیرباز برای کاهش عوارض بیماری­ها و پیش­گیری از بسیاری امراض مورد توجه بوده است. نوشیدنی کامبوچا یکی از این ترکیب­ها است که برای ساکنین مناطق آسیای شرقی شناخته­شده­تر است. نوشیدنی کامبوچا ترکیبی از چای معمولی و شکر است که با استفاده از قارچ­های موجود در کامبوچا تخمیر شده و ترکیب شیمیائی آن تغییر کرده است. این نوشیدنی به­طور معمول حاوی مقادیر بسیار کم اتانول بوده (بین 2/1 تا 2 درصد) و میزان اتانول آن به شرایط تخمیر بستگی دارد (1). قارچ کامبوچا یک لایه پلی­ساکاریدی حاوی انواع مخمرها و باکتری‌ها است (2). این باکتری‌ها شامل باکتریوم گزیلینوم[1]، باکتریوم گلوکونیکوم[2]، استوباکتر گزیلینوم[3]، استوباکتر کتوژنوم[4]، استوباکتر گزیلینوئیدس[5] و لاکتوباسیلوس آئروبیک[6] و مخمرها شامل ساکارومیسس سرویزیه[7]، ساکارومیسس لودویگی[8]، ساکارومیسس اپیکولاتوس[9]، شیزوساکارومیسس پومبه[10]و نیز مخمرهایی از جنس زیگوساکارومیسس[11] است (6-3). در فرایند تخمیر، ابتدا قند ساکارز موجود در محیط توسط مخمرها به گلوکز و فروکتوز تجزیه شده و فروکتوز نیز طی فرایند ایزومریزاسیون به گلوکز تبدیل می­شود. در مرحله بعد مونوساکاریدها توسط مخمرها تخمیر شده و به الکل و دی اکسیدکربن تبدیل می­شوند. حضور دی اکسیدکربن موجب گازدار شدن نوشیدنی می­شود. علاوه­بر این، رشد قارچ سیستم سلولزی مناسب برای جای­گیری باکتری­ها در یک بستر متخلخل را فراهم کرده و محلی امن برای رشد و تکثیر آن­ها ایجاد می­کند. الکل حاصله توسط باکتری­ها به­عنوان منبع کربن مصرف شده و به اسیدهایی چون اسید استیک، اسید لاکتیک، اسید گلوکونیک و اسید گلوکورونیک تبدیل می­گردد (4،7). وجود سایر متابولیت­ها به­همراه بو و عطر چای، یک نوشیدنی خوش طعم و غنی از ویتامین­های گروه (ب) را به­وجود می­آورد. این مجموعه هم­زیست، ظاهری ژله­ای و سفید دارد و پس از هر دوره تولید شربت کامبوچا، می­توان دوباره از آن برای تخمیر استفاده کرد. اگر در فرایند تخمیر اندازه ظرف تغییری نکند، قارچ کمی ضخیم­تر شده ولی استفاده از ظرف بزرگ­تر، موجب گسترش قارچ در تمام سطح محلول خواهد شد. شکل زیر قارچ کامبوچا را در فرایند تخمیر نشان می­دهد (8).

شکل 1- سیستم میکروبی هم­زیست مولد شربت کامبوچا. سیستم هم­زیست به­طور معمول به شکل ظرف خود در می­آید. (تصویر از نویسندگان)

نوشیدنی کامبوچا یک "پروبیوتیک" است که مصرف آن سیستم دفاعی بدن را تقویت­کرده (9،10) و موجب بهبود علائم بیماری­هایی چون دیابت (قند)، سرطان، فشار خون، چربی­خون، آلرژی، روماتیسم، سیاتیک، آرتروز، آرتریت روماتوئید و غیره می­شود (11،12). شربت کامبوچا محتوی مایرستین[12] است که در شرایط آزمایشگاهی اثر لیپوژنز و انتقال گلوکز از غشای سلول­ها را تقلید می­کند (13). این قارچ به‌دلیل ترکیب­های خاص و دارا بودن "اسید گلوکورونیک" نه تنها مانع از سرطانی شدن سلول‌ها می‌شود، بلکه رشد سلول‌های سرطانی را نیز متوقف می‌سازد (14،15). نوشیدنی کامبوچا سرشار از آنتی­اکسیدان هایی نظیر ویتامین­های  E و C، بتاکاروتن و سایر کاروتنوئیدهاست (15). این چای مانند چای سیاه محتوی پلی فنول­ها و سایر آنتی اکسیدان­ها است (16،17). از آنجایی­که نوشیدنی کامبوچا حاصل فرایند تخمیر است، به مراتب از چای سیاه مفیدتر بوده و مصرف آن به تنظیم متابولیسم بدن کمک می­کند (2). آزمایش روی حیوانات نشان می­دهد که این نوشیدنی با افزایش محدودیت کالری منجر به کاهش وزن می­شود (7،18). اسیدهای ارگانیک موجود در کامبوچا ترکیب­های آهن سه­ظرفیتی موجود در منابع گیاهی را به یون آهن دو ظرفیتی تبدیل می­کند که موجب در دسترس قرار گرفتن آهن­هایی با منشأ گیاهی برای سلول­ها می­شود (18). هم­چنین ویتامین C موجود در کامبوچا جذب آهن را افزایش می­دهد. محققان نوشیدن کامبوجا را به­ویژه به افراد مسن و گیاه خواران توصیه می­کنند تا با افزایش جذب آهن از فقر آهن در آن­ها جلوگیری شود (10). اما مطالعه­های اخیر نشان داده است که این قارچ، قند خون موش­های آزمایشگاهی مبتلا به دیابت را به شدت کاهش می­دهد (19، 10، 2). نتایج این تحقیقات، نوشیدنی کامبوچا را به­عنوان نامزد جدید درمان دیابت معرفی کرده است. در این مطالعه اثر شربت­کامبوچا بر میزان قند­خون موش­های دیابتی و هم­چنین اثر محافظتی آن بر سلول­های کبدی در برابر ترکیب­های سمی مثل تتراکلرید کربن در موش­های نر نژاد ویستار مورد بررسی قرار گرفته است. 

مواد و روش­ها

مواد

نمونه قارچ کامبوچا از شرکت دانش بنیان مستقر در پارک علم و فناوری گیلان تهیه شده و شربت تازه کامبوچا با استفاده از آن تهیه گردید. خوراک مخصوص موش تولیدی خوراک دام پارس و کیت­های تشخیص کمی گلوکز و آنزیم­های کبدی از شرکت پارس آزمون تهیه شدند. از دی فنیل پیکریل هیدرازیل ([13]DPPH) و استرپتوزوتوسین[14] محصول شرکت سیگما استفاده شد.

تهیه شربت کامبوچا

برای تهیه نوشیدنی کامبوچا، 20 گرم چای سیاه در 10 لیوان آب­جوش به­مدت 10 دقیقه دم کشید و پس از 10 دقیقه صاف شد. سپس محلول در یک کاسه بلوری بزرگ ریخته شد و 150 گرم شکر و 2 قاشق غذاخوری سرکه سیب به آن اضافه گردید. پس از هم­دما شدن با محیط، قارچ کامبوچا به آن اضافه شد و به برای یک هفته در محلی تاریک و گرم قرار گرفت. در این مدت به­منظور تأمین اکسیژن و جلوگیری از ورود گرد و خاک، روی ظرف با یک پارچه توری پوشیده شد. بعد از یک هفته قارچی جدید روی سطح کاسه را پوشانید و نوشیدنی کامبوچا تولید شد. قارچ به ظرف دیگری منتقل شد و نوشیدنی حاصل پس از عبور از صافی پارچه­ای در یک ظرف شیشه­ای ریخته شد و تا زمان انجام آزمایش­ها در دمای 4 درجه یخچال قرار گرفت (11).

بررسی ترکیب­های شربت کامبوچا با کروماتوگرافی گازی-طیف­سنجی جرمی (GC-Mass)

شربت کامبوچای تولید شده، پس از آبگیری دوباره در متانول حل شد و به دستگاه GC-MS تزریق گردید. برنامه‏ دمایی Oven از 100 درجه سانتی­گراد شروع و سپس با سرعت 6 درجه بر دقیقه تا 220 درجه سانتی­گراد بالا برده شد و یک دقیقه و بیست و سه ثاتیه در آن دما قرار گرفت. سپس دوباره با سرعت 10 درجه بر دقیقه به دمای 290 درجه رسانیده شد. برنامه دمایی محل تزریق 290 درجه و از فاز متحرک هلیوم با سرعت یک میلی‏لیتر بر دقیقه استفاده شد (20).

بررسی فعالیت آنتی­اکسیدانی با روش DPPH

شربت کامبوچای تولید شده با غلظت 100 میلی­گرم بر میلی­لیتر، به­عنوان استوک با حجم­های مختلف از اتانول مخلوط شد و غلظت­های مختلف نمونه (از 10 تا 100 میلی­گرم بر میلی­لیتر) تهیه گردید. سپس، آزمایش DPPH برای هر غلظت به­طور جداگانه انجام شد. لوله نمونه (S)، حاوی 5/0 میلی­لیتر شربت کامبوچا، 3 میلی­لیتر اتانول و 5/0 میلی­لیتر محلول 5/0 میلی­مولار DPPH در اتانول بود. لوله کنترل (C) نیز مشابه لوله نمونه تهیه شد، ولی به­جای شربت­کامبوچا، اتانول اضافه شد و در لوله بلانک (B) نیز به­جای محلول DPPH، اتانول ریخته شد. لوله­ها برای 60 دقیقه در دمای آزمایشگاه قرار گرفتند تا شدت رنگ از بنفش پررنگ به زرد تبدیل شود. سپس میزان جذب لوله­های کنترل و نمونه در طول موج 518 نانومتر، در مقابل محتویات لوله بلانک، خوانده شد و با استفاده از رابطه (1)، درصد فعالیت آنتی­اکسیدانی محاسبه گردید (21).  

رابطه (1)                                                                 ]

حیوانات مورد استفاده و نحوه نگه­داری آن­ها

حیوانات مورد آزمایش در این تحقیق 30 سر موش نر ویستار سفید (دیابتی) و 10 موش­نر سالم با وزن تقریبی 5 ±160 گرم و سن دو تا سه ماه و 25 موش سفید ماده با وزن تقریبی 5±280 گرم بودند. حیوانات از مرکز تحقیقات وارنا و شهید میرغنی گیلان تهیه شدند و آزمایش­ها در همان مرکز انجام شد. درجه حرارت محیط 2 ± 25 درجه سانتی­گراد بوده که در طول شبانه روز ثابت نگه­داشته می­شد و قفس­ها در دوره نوری 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی قرار گرفتند. آب و غذا در تمام طول آزمایش بدون هیچ محدودیتی در اختیار آن­ها قرار می­گرفت. قفس­های نگه­داری حیوانات از جنس پلی­کربنات در ابعاد 40 × 25 × 15 با سقف مشبک از جنس استیل بود که در هر کدام پنج سر موش نگه­داری می‌شد. کف قفس­ها با تراشه‌های چوب مفروش ‌شد و خاک اره‌های موجود در کف قفس هر روز یک­بار تعویض می‌شد. حیوانات قبل از انجام آزمایش، وزن شده تا در محدوده وزنی خاصی باشند. تعداد کل موش‌ها در هر آزمایش 25 سر بودند که به­صورت زیر به گروه­های شاهد 1 و2، کنترل و آزمون 1 و 2 تقسیم شدند. بیماری دیابت با تزریق درون صفاقی محلول حاوی 60 میلی­گرم استرپتوزوتوسین به ازای هر کیلوگرم از وزن حیوان، القا شد.

بررسی اثر ضددیابتی

برای بررسی اثر ضد­دیابتی، شربت کامبوچا روزانه به­صورت گاواژ به حیوانات خورانیده شد و میزان قند خون در نمونه خون انتهای دم همه موش­ها، قبل و بعد از پایان دوره دو هفته­ای آزمایش، با دستگاه گلوکومتر بررسی و ثبت شد (شکل 2).

شکل 2- روش گاواژ کردن (سمت راست) و خونگیری از دم موش و اندازه­گیری قندخون (سمت چپ)

موش­ها توسط ماژیک­های رنگی علامت­گذاری شدند. سپس موش­ها بر اساس قند خون در، مطابق جدول (1)، در گروه­های مختف قرار گرفتند.

جدول 1- گروه­ بندی موش­ها برای بررسی اثر ضددیابتی

گروه شاهد 1: شامل 5 موش سالم نر بودند که هر روز 2 میلی­لیتر آب مقطر به ازای هر گیلوگرم از وزن بدن از طریق گاواژ دریافت کردند.

گروه شاهد 2: شامل 5 موش سالم نر بودند که روزانه 2 میلی­لیتر شربت کامبوچا به ازای هر گیلوگرم از وزن بدن از طریق گاواژ دریافت کردند.

گروه کنترل منفی: شامل 5 موش دیابتی نر بودند که هر روز 2 میلی­لیتر آب مقطر به ازای هر گیلوگرم از وزن بدن از طریق گاواژ دریافت کردند.

گروه آزمون1: شامل 5 موش دیابتی نر بودند که روزانه 2 میلی­لیتر شربت کامبوچا به ازای هر گیلوگرم از وزن بدن از طریق گاواژ دریافت کردند.

گروه آزمون2: شامل 5 موش دیابتی نر بودند که روزانه 4 میلی­لیتر شربت کامبوچا به ازای هر گیلوگرم از وزن بدن از طریق گاواژ دریافت کردند.

بررسی اثر محافظت کبدی

برای بررسی اثر محافظت کبدی، مخلوط روغن زیتون و تتراکلرید کربن به میزان 1 میلی­لیتر به ازاء هر کیلوگرم از وزن حیوان با سرنگ به درون محفظه صفاق حیوان تزریق شد. شربت کامبوچا نیز روزانه به­صورت گاواژ به حیوانات خورانیده شد. فعالیت آنزیم­های کبدی آلانین ترانس آمیناز (ALT)، آسپارتات ترانس آمیناز (AST) و آلکالین فسفاتاز (ALP) در سرم خون پنج گروه موش ذکر شده در جدول (3)، بعد از یک دوره 32 روزه با کیت­های شرکت پارس آزمون اندازه­گیری شد. 

جدول 2- گروه بندی موش­ها برای بررسی اثر محافظت کبدی

گروه شاهد: شامل 5 موش نر بودند که هفته­ای 2 بار از روغن زیتون به­میزان 1 میلی­لیتر به ازاء هر کیلوگرم از وزن حیوان به­صورت درون صفاقی دریافت کردند.

گروه شاهد 2: شامل 5 موش نر بودند که هفته­ای 2 بار از روغن زیتون به­میزان 1 میلی­لیتر به ازاء هر کیلوگرم از وزن حیوان به­صورت درون صفاقی دریافت کردند. هم­چنین روزانه 2 میلی­لیتر از شربت کامبوچا به ازای هر گیلوگرم از وزن بدن به­صورت گاواژ دریافت نمودند.

گروه کنترل 1: شامل 5 موش نر بودند که هفته­ای 2 بار از روغن زیتون و تتراکلریدکربن (به­ نسبت 1:1) به­میزان 1 میلی­لیتر به ازاء هر کیلوگرم از وزن حیوان به صورت درون صفاقی دریافت نمودند.

گروه آزمون 1: شامل 5 موش نر بودند که هفته­ای 2 بار از زیتون و تتراکلریدکربن (به نسبت 1:1) به­میزان 1 میلی­لیتر به ازاء هر کیلوگرم وزن حیوان به­صورت درون صفاقی دریافت کردند، به­علاوه روزانه 2 میلی­لیتر از شربت کامبوچا به ازای هر گیلوگرم از وزن بدن به­صورت گاواژ دریافت نمودند. 

گروه آزمون 2: شامل 5 موش نر بودند که هفته­ای 2 بار از زیتون و تتراکلریدکربن (به­نسبت 1:1) به­میزان 1 میلی­لیتر به ازاء هر کیلوگرم وزن حیوان به­صورت درون صفاقی دریافت کردند، به­علاوه روزانه 4 میلی­لیتر از شربت کامبوچا به ازای هر گیلوگرم از وزن بدن به­صورت گاواژ دریافت نمودند.

آنالیز آماری

نتایج حاصل با استفاده از آزمون آماریStudent's T-Test  و ANOVA بیان گردیده و با استفاده از نرم­افزارSPSS  ویرایش 22 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. جهت بررسی اثر ضد­دیابتی و محافظتی شربت کامبوچا در برابر آسیب­های کبدی القا شده با تتراکلریدکربن در موش­ها از آزمون­های آنالیز واریانس بین آزمودنی، تی- تست مستقل و تی- تست زوجی استفاده شد. در بررسی آنزیم­های کبدی با توجه­به وجود یک عامل با پنج سطح از آزمون آنالیز واریانس استفاده شد و از آنجایی­که هر آزمودنی فقط یک­بار مورد آزمایش قرار می­گیرد، آنالیز واریانس از نوع بین آزمودنی یک­طرفه است و برای مقایسه­های دو به­دو از پس­آزمون Tukey استفاده شد. جهت بررسی قند­خون در دو زمان مختلف از آزمون T-Test استفاده گردید و از آنجا که هر آزمودنی دو بار مورد آزمایش قرار می­گیرد، تی- تست از نوع زوجی (تکراری) استفاده ­شد.

یافته­ها

نتایج حاصل کروماتوگرافی گازی-طیف­سنجی جرمی (GC-MS)

بر این اساس، حضور ماده فورفورال[15] به­میزان 53/3 درصد، اتانول[16] به­میزان 57/4 درصد، فوران کربوکسیلیک اسید[17] به­میزان 59/4 درصد، گلوکورونیک اسید[18] به­میزان 66/12 درصد، سوکسینیک اسید[19] به­میزان 02/3 درصد، هیدروکسی متیل فورفوال[20] به­میزان 53/23 درصد، فوران کربوکسی الدئید[21] به­میزان 73/7 درصد، گلوسیتول[22] به­میزان 97/2 درصد، فلوئورو بنزیل الکل[23] به­میزان 15/6 درصد، مرکاپتو اتانول[24] به­میزان 77/2 درصد، هگزا دکانوئیک اسید یا همان پالمیتیک اسید[25] به­میزان 65/2 درصد و اکتا دکانوئیک اسید یا همان استئاریک اسید[26] به­میزان 53/1 درصد گزارش شد. شکل (3)، نمودار کلی به­دست آمده از کروماتوگرافی گازی-طیف­سنجی جرمی و جدول (3) ترکیب­های شناسایی شده را نشان می­دهد.

شکل 3- گاز کروماتوگرام حاصل از بررسی شربت کامبوچا

جدول 3- ترکیب­های موجود در شربت کامبوچا

نتایج حاصل از روش DPPH

به­منظور بررسی اثرهای آنتی­اکسیدانی شربت­کامبوچا از آزمون مهار رادیکال آزاد دی­فنیل­پیکریل­هیدرازیل (DPPH) استفاده شد و نتایج مورد بررسی قرار گرفت. آزمایش با سه­بار تکرار برای ده غلظت مختلف (100-10 میلی­گرم بر میلی­لیتر) از شربت کامبوچا انجام شد و میانگین مقادیر محاسبه شده برای هر غلظت، برای رسم نمودار استفاده شد (شکل 4).

شکل 4- درصد فعالیت آنتی اکسیدانی شربت کامبوچا در غلظت­های مختلف

همان­طور که در شکل (4) مشاهده می­شود، با افزایش غلظت شربت­کامبوچا، میزان خاصیت آنتی­اکسیدانی تا غلظت 100 میلی­گرم بر میلی­لیتر افزایش دارد. بر این اساس، بیش­ترین درصد فعالیت آنتی اکسیدانی در غلظت 100 میلی­گرم بر میلی­لیتر از شربت کامبوچا و به­میزان 58/89 درصد محاسبه شد. با توجه ­به الگوی افزایش درصد خاصیت آنتی­اکسیدانی، این غلظت از محلول (100 میلی­گرم بر میلی­لیتر) بالاترین اثر آنتی­اکسیدانی را نشان می­دهد و در غلظت­های بالاتر نیز تغییر محسوسی مشاهده نخواهد شد.

نتایج حاصل از بررسی اثر ضددیابتی شربت کامبوچا

جهت مقایسه میزان تغییرهای قند­خون در موش­های دیابتی و تیمار شده با شربت­کامبوچا در گروه­های مختلف و هم­چنین قبل و بعد از تیمار از آزمون­های تحلیل واریانس و تی- تست استفاده شد. شایان ذکر است، در مورد داده­ها نرمال از تحلیل واریانس بین آزمودنی یک­طرفه، تی- تست مستقل و تی- تست زوجی و در مورد داده­های غیرنرمال از معادل ناپارامتری آن، یعنی آزمون­های کروسکال-والیس[27]، استفاده گردید. به­همین منظور، ابتدا با استفاده از آزمون کولموگروف –اسمیرنوف [28]، وضعیت نرمال بودن داده­ها بررسی شد.

جدول 4- بررسی نرمال بودن داده­های مربوط به تغییرهای قندخون در گروه­های مورد آزمایش

با توجه­به نتایج مندرج در جدول (4)، از آنجا که داده­های مربوط به قندخون قبل و بعد از تیمار در گروه­های مختلف، نرمال بود (05/0=P-value>α)، بنابراین جهت مقایسه اثر حفاظتی شربت کامبوچا قبل و بعد از تیمار در موش­های دیابتی، از آزمون تی- تست زوجی استفاده شد و هم-چنین از آنجا که داده­های مربوط به تغییرهای قند خون در گروه­های مختلف، نرمال بوده است (05/0=P-value>α) جهت مقایسه­ تغییرهای قند خون در گروه­های دیابتی از تحلیل واریانس بین آزمودنی یک­طرفه و برای گروه­های کنترل از آزمون تی- تست مستقل استفاده گردید. جدول (5) میزان قند خون قبل و بعد از 14 روز دریافت شربت کامبوچا در گروه­های مورد آزمایش را نشان می­دهد.

جدول 5- میزان قند خون قبل و بعد از 14 روز دریافت شربت کامبوچا در گروه­های مورد آزمایش

نتایج حاصل از بررسی قندخون، قبل و بعد از تیمار با شربت­کامبوچا نشان داد که میزان قند خون در گروه­های شاهد، قبل و بعد از تیمار تغییر معنی­داری نکرده، ولی در گروه کنترل منفی که موش­های دیابتی از شربت­کامبوچا دریافت نکرده­اند، افزایش زیادی داشته است. میزان قند­خون پس از تیمار در گروه­های آزمون 1 و 2 نسبت­به گروه کنترل منفی، کاهش معنی­داری نشان داد (شکل 5).

شکل 5- میزان قندخون قبل و بعد از دو هفته دریافت شربت­کامبوچا در گروه­های مورد آزمایش

نتایج حاصل از بررسی اثر محافظت­ کبدی شربت کامبوچا

جهت مقایسه میزان آسیب کبدی در گروه­های مختلف از آزمون تحلیل واریانس استفاده شد. شایان ذکر است، در مورد داده­ها نرمال از تحلیل واریانس بین آزمودنی یک­طرفه و در غیر این­صورت از معادل ناپارامتری آن یعنی آزمون کروسکال-والیس استفاده شد. به­همین منظور ابتدا با استفاده از آزمون کولموگروف– اسمیرنوف، وضعیت نرمال بودن داده­ها بررسی گردید.

جدول 6- بررسی نرمال بودن سطوح فعالیت سرمی ALT، AST و ALP در گروه­های مورد آزمایش

با توجه­به نتایج مندرج در جدول (6)، از آنجا که داده­های مربوط به فعالیت آنزیم­های ALT، AST و ALP در کبد آسیب دیده و تیمار شده با شربت­کامبوچا، نرمال بوده است (05/0=P-value>α)، بنابراین جهت مقایسه اثر حفاظتی آن بر کبد آسیب دیده در موش­ها، از آزمون تحلیل واریانس بین آزمودنی یک­طرفه استفاده گردید (جدول 7).

جدول 7- اثرهای حفاظتی شربت کامبوچا بر سطح سرمی فعالیت آنزیم­های کبدی 

همان­طور که در جدول (7) مشاهده می­شود، سطح سرمی فعالیت آنزیم­های کبدی در گروه شاهد 1 که فقط روغن زیتون دریافت کرده بودند، نرمال بوده و تفاوت معنی­داری با میزان گزارش شده در گروه شاهد 2 نداشت. در حالی­که، میزان فعالیت آنزیم­ها در هر سه آنزیم کبدی، در گروه­های آزمون 1 و 2 کاهش معنی­داری نسبت­به گروه کنترل منفی، که شربت کامبوچا دریافت نکرده بودند، نشان داد. نتایج به­طور مقایسه­ای در شکل (6) نشان داده شده است.

شکل 6- اثرهای حفاظتی شربت کامبوچا بر سطح سرمی آنزیم­های کبدی

بحث

شربت کامبوچا موجب کاهش قندخون می­شود 

مشخص شده که با القای استرپتوزوتوسین در موش­های رت، فعالیت NADH دهیدروژناز افزایش یافته و فعالیت سیتوکروم C اکسیداز در زنجیره تنفسی میتوکندریایی کاهش می­یابد. این موضوع سبب نشت الکترون از غشای داخلی میتوکندری و افزایش تولید رادیکال­های آزاد اکسیژن در بافت­های در معرض استرپتوزوتوسین می­شود (23، 22) که از جمله دلایل تخریب سلول­های بتای پانکراس در اثر استرپتوزوتوسین است. استرپتوزوتوسین یک آنالوگ N-استیل گلوکز آمین است که برای القاء دیابت نوع I به­طور تجربی استفاده می شود. این ترکیب، سلول­های هدف خود را به مستعد تخریب می­سازد (24).

زنجیره تنفسی میتوکندریایی محل مهم تولید رادیکال­های آزاد اکسیژن به­ویژه در مرحله کمپلکس­های NADH دهیدروژناز و سیتوکروم C اکسیداز این زنجیره است (25). اختلال در میتوکندری و کاهش بیوسنتز ATP در بیماری دیابت نوع I شناخته­شده است (27, 26). در افراد دیابتی و مسن، گلیکوزیلاسیون (اتصال آنزیمی قند) محصول­های نهایی مشتق از گلوکز افزایش می­یابد و تشکیل این محصولات گلیکوزیله با هایپرگلیسمی افزایش می­یابد. تحقیقات مختلف درباره بیماری دیابت نشان می­دهد که القای دیابت با تزریق استرپتوزوتوسین سبب افزایش معنی­داری در سطح سرمی گلوکز، کلسترول، تری گلیسرید، فاکتورهای کلیوی (اوره، اسیداوریک، کراتی­نین) و آنزیم­های عمل­کرد کبدی (AST،ALT،ALP) در موش­های دیابتی نسبت به موش­های نرمال می­شود و سطح سرمی انسولین به­طور معنی­داری کاهش می­یابد. گزارش شده است که افزایش قندخون و افزایش کراتی­نین و اوره از مارکرهای مهم اختلال کلیوی در دیابت نوع I محسوب می­شود (28). افزایش قند­خون، اتواکسیداسیون پروتئین­های گلیکوزیله شده، افزایش تولید رادیکال­های آزاد اکسیژن، کاهش عمل­کرد آنتی اکسیدان­ها، افزایش پراکسیداسیون لیپیدها و تخریب غشاها به­عنوان عامل اصلی آپوپتوز یا نکروز سلول می­باشند که در بیماری دیابت رایج هستند (30، 29). در سال 2018، Zubaideh و همکاران، اثر 4 نوع چای کامبوچا را بر قندخون و فاکتورهای چربی خون موش­های صحرایی بررسی کردند. آن­ها دریافتند که میزان قند خون در موش­های آزمون که شربت کامبوچا دریافت کرده بودند (mg/dl110) نسبت­به کنترل منفی ( mg/dl413) کاهش معناداری پیدا کرده است که با نتایج این تحقیق هم­خوانی دارد (23). Ahmad و همکاران نیز در سال 2012، به بررسی ویژگی­های کاهنده نوشیدنی کامبوچا بر قند و چربی خون در موش­های دیابتی شده با آلوکسان پرداختند. آن­ها نشان دادند که چای کامبوچا در مقایسه با چای سیاه، مهار کننده بهتر آلفا آمیلاز و فعالیت لیپاز در پلاسما و لوزالمعده و هم­چنین سرکوب­گر بهتر افزایش سطح گلوکز خون است. جالب است که کامبوچا باعث تأخیر قابل توجهی در جذب کلسترول-LDL و تری گلیسیریدها و افزایش قابل توجه در کلسترول-HDL. می­گردد (2). نتایج این تحقیق نشان داد که تجویز خوراکی شربت کامبوچا ( ml/kg4 و 2) به مدت 14 روز، سبب کاهش معنی­داری در سطح سرمی گلوکز در گروه­های آزمون اول و دوم (mg/dl 160 و 112)، نسبت­به گروه کنترل­منفی (mg/dl 436) نشان داد.

شربت کامبوچا برای سلول­های کبدی اثر محافظتی دارد

پیدا کردن یک داروی طبیعی مناسب برای درمان بیماری­های کبدی کار ساده‌ای نیست و درمان­های مؤثر مثل اینترفرون، کلشی‌سین، پنی­سیلامین و کورتیکوئید‌ها متناقص هستند (32، 31). کبد یک نقش بیوشیمیایی حیاتی و مرکزی در متابولیسم، هضم، سم­زدایی و حذف مواد از بدن دارد (34، 33). آسیب کبدی ایجاد شده با تتراکلریدکربن به­خوبی مشهود است و به­طور معمول از آن به­عنوان یک مدل مناسب برای مطالعه اثرهای حفاظت کننده کبدی داروها استفاده می­شود (37-35). تتراکلریدکربن یک ماده اکسیدکننده و سم کبدی قوی است که پس از ورود به بدن مشابه بسیاری از مواد از جمله استامینوفن، برخی آنتی­بیوتیک‌ها، اتانول و تیواستامید عمل کرده و بر سلول­های کبدی آثار هپاتوتوکسیکی دارد و توسط سیستم اکسیدکننده میکروزومی وابسته­به سیتوکروم P₄₅₀ متابولیزه می­شود و با تولید رادیکال­های آزاد و فعال تری­کلرومتیل و تری­کلروپراکسیل منجر به پراکسیداسیون اسیدهای چرب غشاءسلولی و در نهایت استرس اکسیداتیو می­گردد (40-38). در این شرایط، تعادل کلسیم در سلول­ها نیز مختل می­شود که هر دو عامل مذکور باعث مرگ سلولی می­شوند. با آسیب غشاء پلاسمای سلول­های کبدی، ترانس آمینازها که شاخص­ترین آنزیم­های کبدی هستند از سیتوزول وارد جریان خون شده و غلظت آن­ها در خون بالا می­رود (41، 35).

آنتی­اکسیدان‌ها قادرند در مقادیرکم، غشا‌های سلولی و ترکیب­های مختلف موجود زنده را در مقابل اکسیدان‌ها حفظ کنند (43، 42). در این مطالعه از تتراکلریدکربن به­عنوان عامل ایجاد هپاتوتوکسیک و از شربت کامبوچا که محتوی آنتی­اکسیدان است به­عنوان دارو در نقش عامل محافظت کننده استفاده شد. همان­طور که در جداول (6) مشاهده می­شود، تزریق تتراکلریدکربن موجب افزایش فعالیت آنزیم­های آمینو ترانسفراز کبدی در گروه کنترل منفی نسبت­به گروه­های شاهد شده است که بیانگر تخریب هپاتوسیت­ها و آزاد شدن این آنزیم ها از سیتوزول به درون پلاسماست. اما در گروه­های آزمون تجربی 1 و2 که شربت کامبوچا را به­ترتیب به­میزان ml/kg 2 و 4 دریافت نمودند، فعالیت این آنزیم­ها کاهش یافت. این کاهش به موازات افزایش دوز مصرف دارو بیش­تر نمایان شد و در مقایسه با گروه کنترل منفی، تفاوت معنی­داری را نشان داد که مبین نقش محافظتی شربت کامبوچا بر سلول­های کبدی است. در پژوهش Ahmad و همکاران نیز در سال 2012، چای کامبوچا بر عملکرد مؤثر کبد و کلیه موش­های صحرایی دیابتی اثر مشهودی بر جای گذاشت و در فعالیت آسپارتات ترانس آمیناز، آلانین ترانس آمیناز و گاما گلوتامیل ترانس­پپتیداز کاهش معناداری مشاهده گردید که با نتایج حاصل از این تحقیق مطابقت دارد (2). 

نتیجه­گیری

نتایج به­دست آمده از این پژوهش نشان می­دهد که شربت کامبوچا می­تواند به­طور معنی­داری موجب کاهش میزان قندخون و در موش­های صحرایی دیابتی شده با استرپتوزوتوسین گردد. محتوای فنولی و اسیدهای آلی موجود در شربت کامبوچا می­تواند اثرهای ضددیابت آن را توضیح دهد. هم­چنین شربت کامبوچا موجب کاهش فعالیت آنزیم­های کبدی (AST,ALT,ALP) در پلاسما می­گردد. به نظر می­رسد که اثر بخشی آن بر سمیّت ایجاد شده از تتراکلریدکربن، بیش­تر مربوط به­وجود ترکیب­های آنتی­اکسیدانی، مهار سیتوکروم P₄₅₀ و جمع­کنندگی رادیکال­های آزاد و مهار پراکسیداسیون لیپوزومال ­باشد. البته لازم­به ذکر است برای پی بردن به این­که این اثر مربوط به چه ترکیب یا ترکیب­هایی است، مطالعه­های بیوشیمیایی و فارموکولوژی بیش­تری مورد نیاز است. همه این اثرهای شربت کامبوچا را به­عنوان یک نوشیدنی کاربردی در مدیریت بیماری دیابت معرفی می­کند.

سپاسگزاری

نویسندگان از تمام همکاران و دوستانی که در انجام این پژوهش همکاری نمودند، کمال تشکر و قدردانی را دارند.