Volume 11, Issue 44 (9-2021)                   NCMBJ 2021, 11(44): 95-106 | Back to browse issues page

XML Persian Abstract Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Abbasifarid E, Bolhassani A, Irani S, Sotoodehnejadnematalahi F. Design of Eukaryotic Vector Harboring L1-E7 Polyepitope Fusion Construct of High Risk Human Papillomaviruses. NCMBJ 2021; 11 (44) :95-106
URL: http://ncmbjpiau.ir/article-1-1414-en.html
Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
Full-Text [PDF 750 kb]   (632 Downloads)     |   Abstract (HTML)  (2099 Views)
Full-Text:   (1557 Views)
Design of Eukaryotic Vector Harboring L1-E7
Polyepitope Fusion Construct of High Risk
Human Papillomaviruses
Elnaz Abbasifarid1, Azam Bolhassani*2, Shiva Irani1,
Fattah Sotoodehnejadnematalahi1
 
1. Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
2. Department of Hepatitis and AIDS, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran
Abstract:
Aim and Background: Human Papillomaviruses (HPV) infection was known to be the leading cause of cervical cancer. Cervical cancer is the fourth most common cancer among women in the world. Designing a DNA vaccine with therapeutic properties as well as prevention can have a significant impact on reducing morbidity and mortality.
Materials and Methods: Gene sequences including the immunogenic and conserved epitopes of L1 and E7 proteins of high risk papillomaviruses were designed. After synthesis of the L1-E7 fusion construct in pUC57 cloning vector, its subcloning was performed in pcDNA3.1 (-) eukaryotic vector. The concentration and purity of the recombinant pcDNA-L1E7 plasmid was determined by NanoDrop spectrophotometry.  
Results: The gene sequence after cutting from pUC57-L1E7 by BamHI/HindIII restriction enzymes, was subcloned in the same cloning site of pcDNA3.1 (-) vector. The presence of gene was confirmed by digestion with BamHI/HindIII enzymes, as a 639 bp fragment on 1% agarose gel. The recombinant pcDNA-L1E7 plasmid was purified by endotoxin-free extraction kit for isolation of bacterial lipopolysaccharide. The concentration of the purified DNA was obtained about 1474 ng/ µl.
Conclusion: Cloning of the L1-E7 fusion construct in the eukaryotic vector was successful. In the next steps, the recombinant vector will be used for gene vaccine studies in vivo
Key Words: Human papillomavirus, L1 protein, E7 protein, Eukaryotic expression vector , Iau Science.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Corresponding author:
Department of Hepatitis and AIDS, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran
Email: azam.bolhassani@yahoo.com
 
 

طراحی وکتور یوکاریوتی حامل ساختار فیوژن پلی­اپی­توپی
 L1-E7 ویروسه­ای پاپیلومای انسانی پر خطر
الناز عباسی‌فرید1، اعظم بوالحسنی*2 ، شیوا ایرانی1 ، فتاح ستوده‌نژاد نعمت‌الهی1
 
1. گروه زیست‌شناسی، واحد علوم و تحقیقات تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
2. بخش هپاتیت و ایدز، انستیتوپاستور ایران، تهران، ایران

چکیده
سابقه و هدف: آلودگی به HPV به­عنوان اصلی‌ترین دلیل سرطان دهانه رحم شناخته می‌شود. این سرطان در دنیا، چهارمین سرطان شایع در میان زنان است. طراحی DNA واکسنی که علاوه­بر پیشگیری، ویژگی‌های درمانی نیز داشته باشد می‌تواند در کاهش ابتلا و مرگ و میر تأثیر چشمگیری داشته باشد.
 
مواد و روش‌ها: توالی ژنی شامل اپی­توپ­های ایمونوژنیک و حفاظت شده پروتئین‌های L1 و E7 ویروس­های پاپیلومای انسانی پر خطر طراحی گردید. پس از سنتز ساختار فیوژن L1-E7 در وکتور کلونینگ pUC57، ساب کلون کردن آن در وکتور یوکاریوتی pcDNA3.1(-) انجام شد. غلظت و خلوص پلاسمید نوترکیب pcDNA-L1E7 توسط اسپکتروفتومتری نانودراپ تعیین شد.   
 
یافته‌ها: توالی ژنی موردنظر پس از برش از pUC57-L1E7 توسط آنزیم­های محدود الاثر BamHI/HindIII، در جایگاه مشابه وکتور pcDNA3.1(-) ساب کلون شد. تأیید حضور ژن در وکتور توسط هضم آنزیمی با BamHI/HindIII، قطعه 639 جفت بازی مربوط به ژن را روی ژل آگارز 1 درصد نشان داد. پلاسمید نوترکیب pcDNA-L1E7 توسط کیت استخراج فاقد اندوتوکسین به­منظور جداسازی لیپوپلی­ساکارید باکتری تخلیص شد. غلظت DNA تخلیص شده، حدود 1474 نانوگرم/ میکرولیتر به­دست آمد.
 
نتیجه‌گیری: کلونینگ ساختار فیوژن L1-E7 در وکتور یوکاریوتی با موفقیت انجام گرفت. در مراحل بعدی از وکتور نوترکیب برای تحقیقات درون تنی واکسن ژنی استفاده خواهد شد.
 
واژگان کلیدی: ویروس پاپیلومای انسانی، پروتئین‌ L1، پروتئین E7، وکتور بیان یوکاریوتی،.Iau Science

 
مقدمه
ـــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ
نویسنده مسئول:
بخش هپاتیت و ایدز، انستیتوپاستور ایران، تهران، ایران
پست الکترونیکی: azam.bolhassani@yahoo.com
تاریخ دریافت: 25/01/1400
تاریخ پذیرش: 01/05/1400
سرطان یکی از بیماری­هایی است که همواره زندگی بشر را محدود کرده است. براساس برآوردهای آژانس بین المللی تحقیقات سرطان (IARC)، انتظار می­رود که تا سال 2030 بار جهانی این بیماری به 4/21 میلیون مورد جدید ابتلا و 2/31 میلیون مرگ و میر افزایش یابد. سرطان دهانه رحم (Cervical Cancer) چهارمین سرطان شایع در زنان است (1). به گزارش سازمان بهداشت جهانی تنها در سال 2018، 570000 مورد جدید ابتلا تشخیص داده شده است که حدود 6/6 درصد از همه سرطان­های زنان را تشکیل می­دهد. کمابیش 90 درصد مرگ و میر ناشی از سرطان دهانه رحم در کشورهای کم درآمد و متوسط رخ می­دهد. بالا بودن آمار مبتلایان به این نوع سرطان ضرورت انجام تحقیقات بیش­تر برای پی بردن به روش­های درمانی مؤثرتر را آشکار می­سازد. با توجه­به پیچیدگی مکانیسم و وجود عوامل متعدد در ایجاد سرطان تاکنون درمان قطعی برای این بیماری یافت نشده است اما امروزه از روش­های درمانی مختلفی برای درمان سرطان دهانه رحم استفاده می­شود که مشکلات عمده روشهای موجود، تهاجمی بودن، عدم اختصاصی بودن درمان، ناکارآمدی درمان­ها در مراحل پیشرفته و کاهش جدی در کیفیت زندگی بیماران است (2،3). سرطان دهانه رحم با توجه­به شکل ظاهری سلول های سرطانی در زیر میکروسکوپ طبقه بندی می شود. انواع اصلی سرطان دهانه رحم شامل کارسینوم سلول­سنگفرشی و آدنوکارسینوما هستند. دهانه رحم از یک لایه اپیتلیوم خارجی و سلول­های اپیتلیوم استوانه­ای تشکیل شده است که موکوس را به کانال داخلی دهانه رحم ترشح می­کنند. انتقال موکوس بین این دو جمعیت سلولی توسط اتصال ماکولار صورت می­گیرد که به­شدت در معرض عفونت­های ویروسی قرار دارد. به این ترتیب تومورهایی که در بافت سطحی دهانه رحم ایجاد می­شوند اغلب از نوع کارسینوماهای مربوط به سلول­های سنگفرشی است که در اثر ابتلا به عفونت­های ویروسی ایجاد شده و حدود 80-85 درصد از سرطان­های مهاجم دهانه رحم را تشکیل می­دهند (4).
ویروس پاپیلوما یک گروه بزرگ از ویروس­های بدون پوشش هستند که توانایی القاء تومور در سلول­های پوششی را دارند و می­تواند در قسمت­های مختلف بدن زگیل­ها یا توده­هایی را ایجاد کنند. تاکنون 221 نوع از انواع HPV شناسایی شده است که این تعداد هم­چنین روبه افزایش است. ویروس HPV  45-55 نانومتر قطر دارد و ماده ژنتیکی آن به شکل DNA  دو رشته­ای و حلقوی است (5). در دهه 1980 محققان دریافتند که HPV16 و HPV18 (از نوع ویروس­های سرطان­زای پرخطر) هر دو نقش عمده­ای را در ایجاد سرطان دهانه رحم دارند و در طول دو دهه بعد نقش سرطان­زایی HPVبه­صورت گسترده­ای در انواع دیگر سرطان­ها مورد بررسی قرار گرفت و به اثبات رسید. در مجموع 15 نوع HPV پرخطر شناسایی شده­اند که شامل تایپ­های 16، 18، 31، 33، 35، 45، 51، 52، 55، 58، 59، 68، 73، 82 و 83 می­شوند (6). ژنوم ویروس HPV شامل سه بخش می­شود: ناحیه Early که50 درصد از ژنوم را در بر گرفته و شامل E1، E2، E4-E7  است.  ناحیه Late که شامل توالی کد کننده L1 (پروتئین اصلی کپسید ویروس) و L2  (جز دوم سازنده کپسید ویروس) است که حدود 40 درصد از ژنوم را اشغال کرده است و ناحیه تنظیمی که شامل 10 درصد از توالی ژنوم می­شود (7). واکسن‌هایی که هم‌اکنون برای ویروس پاپیلوما استفاده می‌شوند (گارداسیل و سرواریکس) واکسن‌های پیشگیری کننده هستند که به­صورت نوترکیب تهیه می‌شوند و در آن­ها از پروتئین اصلی کپسید یعنی L1 برای تولید ذرات شبه ویروسی (VLP) استفاده ‌می‌شود. واکسن‌هایی براساس VLP میزان زیادی از آنتی‌بادی را علیه پروتئین L1 در بدن ایجاد می‌کنند و به این طریق ایمنی علیه ویروس ایجاد می‌شود (8). در آسیب­های مربوط به دهانه رحم که به­وسیلۀ HPV ایجاد می­شوند افزایش تکثیر سلول­های اپیتلیالی به بیان انکوژن­های E6 و E7 نسبت داده می­شود. پروتئین­های E6 و E7 می­توانند سلول­ها را در محیط کشت نامیرا کنند و با فعال کردن انکوژن­ها در سلول­ها تغییرهای اساسی ایجاد کنند. بنابراین پروتئین­های E6 و E7 در سلول­های توموری می­توانند اهداف درمانی مناسبی جهت طراحی واکسن‌های درمانی علیه سرطان دهانه رحم باشند. نتایج حاصل از ایمونوتراپی با استفاده از آنتی­ژن­های HPV علیه سرطان دهانه رحم نشان داده است که ایمنی­زایی با E6 وE7 منجر به کنترل رشد تومور می­شود. این مطالعه­ها هم­چنین نشان داده است که در این روش لنفوسیت T کشنده (CTL) به­عنوان یکی از مکانیسم­های ایمنی تأثیرگذار عمل می­کند. از آنجا که CTL ها به­صورت اختصاصی علیه آنتی­ژن­های توموری عمل می­کنند، می­توانند در شرایط in vivo در بدن انسان رشد تومور را متوقف کنند (7). از سوی دیگر سلول‌های T CD4+ جهت تحریک هم­زمان برای ایجاد پاسخ مناسب از سوی سلول‌های T CD8+ مورد نیاز هستند. با درنظر گرفتن پپتیدهای مناسب می­توان اقدام به تولید واکسن‌هایی کرد که قادر هستند توسط MHC-I و MHC-II ارائه شوند و از این طریق پاسخ­های CTL و لنفوسیت T کمکی (HTL) مناسب را ایجاد کنند. به این ترتیب می­توان از این روش­های درمانی در کنار روش­های درمانی معمول برای از بین بردن آنچه از تومور به جا مانده است و جلوگیری از بازگشت تومور بهره گرفت (9،10).
واکسن‌های DNA یی مزایایی بر مدل‌های قدیمی واکسن دارند. این واکسن‌ها ایمنی و پایداری بیش­تری دارند، هم­چنین تولید آن‌ها آسان­تر است. به­وسیله‌ این واکسن‌ها می‌توان چندین آنتی‌ژن را مورد هدف قرار داد و از این طریق پاسخ ایمنی مناسب را ایجاد کرد (10،11). در مطالعه حاضر اقدام به تولید DNA وکتوری گردیده است که حامل اپی­توپ­های ایمنوژنیک پروتئین‌های L1 و E7 ویروس پاپیلومای انسانی است. توالی ارائه شده در این سازه توانایی اتصال به MHC-I و MHC-II را دارد. این سازه در آینده جهت تزریق درون تنی به­عنوان DNA واکسن مورد استفاده قرار خواهد گرفت.
مواد و روش­ها
تهیه ساختار پلی پپتید
در مطالعه قبلی ما (11) با استفاده از روش های in silico دو اپی‌توپ از پروتئین های مربوط به L1 در دو سویه کم خطر HPV (6،11) و شانزده سویه پرخطر HPV (16، 18، 31، 33، 35، 39، 45، 51، 52، 55، 58، 59، 68، 73، 82 و 83) انتخاب شدند. هم­چنین 10 اپی‌توپ از پروتئین E7 مربوط به پنج سویه پرخطر HPV (16، 18، 31، 33 و 45) که طبق داده‌های مرکز اطلاعات HPV بیش­ترین تأثیر را بر روی سرطان دهانه رحم داشتند، انتخاب شدند. اپی‌توپ‌های انتخابی قابلیت اتصال به MHC-I و MHC-II را داشتند و توسط سرویس دهنده  NetMHCpan 4.0 و NetMHCII 2.3  مورد بررسی قرار گرفتند. هم­چنین از نظر پاسخ ایمنی B cell نیز توسط نرم‌افزار Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0  بررسی شدند. موارد دیگری از قبیل آزمون حفظ شدگی توالی­ها، آزمون پوشش جمعیتی، پیش‌بینی بیوانفورماتیک تولید سایتوکاین‌ها (IL-10 و IFN- γ)، ایمنی‌زایی، آلرژی­‌زایی، آنتی ژنیسیته، توانایی همولیتیک، بررسی واکنش متقاطع با آنتی‌ژن‌های میزبان و آزمون داکینگ مولکولی در مورد اپی­توپ‌های انتخابی انجام گرفت. جهت تشکیل ساختار پلی‌­اپی­توپ از ارتباط دهنده AAY (آلانین-آلانین-تیروزین) برای اتصال اپی­توپ­های انتخابی به یکدیگر استفاده شد.  
جهت اطمینان از اپی‌توپ­های طراحی شده و نتایج به­دست آمده از بانک اطلاعاتی IEDB استفاده شد. جستجو براساس اپی‌توپ‌های خطی انجام شد. آزمون‌های مربوط به T cell و B cell مدنظر قرار داده شد. آنتی‌ژن‌های HPV در مورد پروتئین‌های L1 و E7 و محدود به MHC-I و MHC-II بررسی شدند. این جستجو در میزبان انسانی و برای هر نوع بیماری درنظر گرفته ‌شد. در نهایت توالی پپتیدی اپی­توپی فیوژن L1E7 توسط نرم­افزار آنلاین EMBOSS Backtranseq به­صورت توالی DNA ترجمه گردید.
طراحی وکتور کلونینگ pUC57-L1E7
سازه 12 اپی‌توپی از پروتئین­های L1 و E7 براساس سویه­های انتخابی و در نظر گرفته شدن اتصال­به MHC-I و MHC-II طراحی شد. جایگاه برش آنزیمی BamHI در سمت ′ 5 و جایگاه برش آنزیمی HindIII در سمت ′3 سازه جهت ساب کلون کردن به وکتور بیان یوکاریوتی در توالی طراحی شده در نظر گرفته شد. وکتور کلونینگ pUC57L1E7 با ژن مقاومت­به آمپی‌سیلین و پروموتر lac توسط شرکت بیومتیک کانادا سنتز شد.
 
کلون کردن فیوژن L1E7 در وکتور3.1  pcDNA
برای کلون کردن قطعه ژنی L1E7 در وکتور بیان یوکاریوتی pcDNA3.1(-)، ابتدا قطعه توسط آنزیم‌های BamHI/HindIII (شرکت Thermo Scientific) به روش هضم آنزیمی از pUC57-L1E7 خارج شد و به روش ساب کلون وارد وکتور pcDNA3.1(-) گردید. وکتور pcDNA3.1(-) یک وکتور بیانی یوکاریوتی، دارای پروموتر و توالی افزاینده سایتومگالوویروس است. هم­چنین این وکتور دارای ژن مقاومت­به آنتی‌بیوتیک آمپی‌سیلین است. از آنجایی که وکتور pcDNA3.1(-) دارای جایگاه برش آنزیمی BamHI/HindIII است، وکتور مورد نظر با آنزیم­های محدود کننده برش داده شد. پس از نمونه­گذاری پلاسمیدهای pcDNA3.1 و pUC57-L1E7 هضم شده در داخل چاهک ژل آگارز، پلاسمید خطی شده pcDNA3.1 و قیوژن L1E7 به روش استخراج از ژل توسط GEL/PCR Purification Mini Kit (FAVORGEN) خالص سازی شد. با استفاده از آنزیم T4 DNA Ligase (Fermentas)، قطعه L1E7 وارد وکتور تخلیص شده pcDNA3.1(-) گردید.
 
پس از الحاق، ترنسفورماسیون pcDNA-L1E7 در باکتری E.coli سویه DH5α به­منظور تکثیر وکتور نوترکیب انجام گرفت.  
 
تأیید ساب کلون کردن فیوژن L1E7 در pcDNA3.1(-)
پس از استخراج pcDNA-L1E7 توسط کیت استخراج DNA (FAVORGEN) جهت تأیید پلاسمید نوترکیب pcDNA-L1E7، ابتدا وکتور pcDNA-L1E7 تحت هضم آنزیمی دوگانه توسط BamHI/HindIII قرار گرفت. سپس الکتروفورز آگارز یک درصد برای نمونه هضم شده انجام گرفت. برای ارزیابی اندازه مولکولی قطه­های ناشی از هضم آنزیمی از شاخص اندازه مولکولی Kb۱۰ استفاده شد. بعلاوه تعیین توالی ژن به­روش سنگر توسط شرکت پیشگام انجام شد.
 
استخراج pcDNA-L1E7 فاقد اندوتوکسین در مقیاس زیاد
جهت تهیه pcDNA-L1E7 فاقد لیپوپلی­ساکارید باکتری، ابتدا یک کشت باکتری 800 میلی­لیتر LB Broth حاوی آنتی‌بیوتیک آمپی‌سیلین تهیه شد. میزان 800 میکرولیتر از کشت اولیه باکتری تحت شرایط استریل به محیط کشت اضافه شد. برای مدت 16 ساعت در انکوباتور  ºC37 با دور 300 در دقیقه قرار گرفت. در مرحله بعد رسوب‌گیری به­وسیلۀ سانتریفیوژ با دور g 5000 ، برای مدت 10 دقیقه و در دمای 4 درجه سانتی­گراد انجام شد. سپس با استفاده از کیت استخراج پلازمید عاری از اندوتوکسین (Macherey Nagel, Germany) اقدام به استخراج پلاسمید شد. غلظت و خلوص پلاسمید نوترکیب درنهایت توسط اسپکتروفتومتری نانودراپ تعیین شد. در پایان جهت اطمینان از صحت پلاسمید استخراج شده، الکتروفورز در ژل آگارز 1% انجام گرفت.   
 
نتایج
طراحی و تهیه ساختار ژنی پلی اپی ‌توپی L1-E7
براساس مطالعه­های قبلی ما (11-13)، اپی‌توپ‌هایی با بیش­ترین پوشش آللی و سویه‌ای به­عنوان اپی‌توپ‌های مناسب MHC-I و MHC-II انتخاب شدند. نشان داده شده است که نواحی زیادی از قطعه طراحی شده قابلیت پاسخ ایمنی B cell را دارند. اپی‌توپ‌های انتخابی از L1 بیش­ترین تعداد سویه‌ها را پوشش می‌دهند. پوشش جمعیتی در نقاط مختلف و به­طور کلی در جهان بررسی شد و نتایج نشان داد که اپی‌توپ‌های انتخابی حداقل 46% و حداکثر 99% جمعیت جهان را پوشش می‌دهند. نتایج پیش‌بینی تولید سایتوکاین‌ها نشان داد که تمام اپی‌توپ‌ها توانایی القاء IFN- γ را دارند و 11 اپی‌توپ القاء کننده IL-4 هستند. هم­چنین توالی‌های انتخابی آلرژی‌زا و یا سمی نبودند. داده‌ها نشان دادند که اپی‌توپ‌ها به­میزان مناسبی ایمونوژن هستند. نتایج نشان داد که پپتیدهای انتخابی همولیتیک نبوده (hemolytic probability<1) و هیچ واکنش متقاطعی با پروتئوم انسان ندارند.
  
در این مطالعه، ساختار نهایی پلی­اپی­توپی شامل 12 اپی‌توپ ایمنوژنیک و حفاظت شده L1 ، E7  (جدول 1) در نهایت طراحی و برای سنتز سفارش داده شد (شکل ۱).
 
تهیه و تأیید pUC57-L1E7  از سویه باکتری
وکتور pUC57 با ژن مقاومت به آمپی‌سیلین bp 2710 طول دارد. با اضافه شدن فیوژن L1E7 در وکتور پس سنتز، وکتوری با اندازه حدود bp 3313 ایجاد می‌شود (شکل ۲).
 
بعد از طی مراحل تکثیر pUC57-L1E7 در باکتری E.coli سویه DH5α، استخراج پلاسمید و هضم آنزیمی دوگانه بر روی وکتور توسط  BamHI/HindIII انجام شد. برش آنزیمی منجر به آشکارسازی دو قطعه به طول 2674 جفت باز مربوط به وکتور خطی شده و 639 جفت باز مربوط به قطعه الحاقی L1E7 بر روی ژل آگارز 1 درصد شد (شکل ۳).
 
کلون کردن فیوژن L1E7 در وکتور pcDNA3.1(-) و تخلیص پلاسمید نوترکیب pcDNA-L1E7 فاقد اندوتوکسین:
وکتور pcDNA3.1(-) با ژن مقاومت به آمپی‌سیلین 5427 جفت باز دارد. پس از برش قطعه ژنی از pUC57 با آنزیم‌های BamHI/HindIII و الحاق قطعه ژنی L1E7 به درون وکتور بیانی pcDNA3.1(-)، وکتوری با اندازه 6048 جفت باز ایجاد شد (شکل ۴). تکثیر و استخراج وکتور pcDNA-L1E7 از باکتری E.coli سویه DH5α به میزان زیاد و به صورت فاقد اندوتوکسین انجام شد. غلظت pcDNA-L1E7 استخراج شده توسط نانودراپ حدود 1474 نانوگرم/ میکرولیتر به­دست آمد. جهت تأیید وجود قطعه در
 
جدول 1. اپی‌توپ‌های‌ انتخابی مربوط به پروتئین‌های L1 و E7
 
پروتئین ویروسی توالی نوع MHC  متصل شونده
L1 DLDQFPLGRKFLLQ
NQLFVTVVDTTRSTN
MHC-I
MHC-II
E7 AEPDRAHYNIVTF (HPV16)
HGPKATVQDIVLHL (HPV18)
KPDTSNYNIVTF (HPV31)
RPDGQAQPATADYYI (HPV33)
RTLQQLFLSFV (HPV45)
TLHEYMLDLQPETTD (HPV16)
LRAFQQLFLNTLSFV (HPV18)
PTLQDYVLDLQPEAT (HPV31)
LKEYVLDLYPEPTDL (HPV33)
LQQLFLSTLSFVCPW (HPV45)
MHC-I
MHC-I
MHC-I
MHC-I
MHC-I
MHC-II
MHC-II
MHC-II
MHC-II
MHC-II
 
شکل 1. سازه پپتیدی پلی­اپی­توپی L1E7 و توالی DNA مربوط به آن: ۱) سازه پپتیدی L1E7 با انتهایHis-tag 6× ۲) توالی ژنی L1E7 به­همراه جایگاه­های آنزیم­های محدود کننده
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
شکل۲. طراحی وکتور حامل فیوژن pUC57-L1E7: وکتور pUC57 حامل فیوژن L1E7 با  اندازه ۳۳۱۳ جفت باز طراحی و سنتز شد.
 

شکل ۳. الکتروفورز ژل آگارز ۱٪ مربوط به وکتور     pUC57-L1E7 هضم شده با آنزیم BamHI/HindIII: ستون ۱- شاخص اندازه مولکولی kb ۱0 (فرمنتاز)، ستون 2- تأیید وکتور pUC57-L1E7 توسط هضم آنزیمی با BamHI/HindIII: باند حدود 639 جفت بازی مربوط به فیوژن L1E7 روی ژل آگارز مشاهده شد، ستون 3- وکتور تخلیص شده pUC57-L1E7.
 
 وکتور، برش آنزیمی وکتور حامل توسط BamHI/HindIII انجام شد. دو قطعه به طول 5427 جفت باز مربوط به وکتور خطی شده و 639 جفت باز مربوط به قطعه الحاقی L1E7 بر روی ژل آگارز مشخص شد (شکل ۵).
 
 
 
شکل 4. مدل شمانیک وکتور pcDNA-L1E7 با اندازه ۶۰۴۸ جفت باز
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
شکل ۵. الکتروفورز ژل آگارز ۱٪ مربوط به وکتور pcDNA-L1E7 هضم شده با آنزیم BamHI/HindIII: ستون۱- شاخص اندازه مولکولی kb  10(فرمنتاز)، ستون ۲- وکتور تخلیص شده pcDNA-L1E7، ستون ۳- تأیید وکتور pcDNA-L1E7 توسط هضم آنزیمی با BamHI/HindIII: باند حدود 639 جفت بازی مربوط به فیوژن L1E7 روی ژل آگارز مشاهده شد.
 
بحث
واکسن‌هایی که هم­اکنون برای مقابله با HPV به­طور گسترده استفاده می‌شوند شامل Gardasil (16و 18)، Cervarix (6، 11، 16 و 18) و  Gardasil-9 (6، 11، 16، 18، 31، 33، 45، 52 و 58) هستند. این واکسن‌ها با استفاده از ترکیب 360 کپی از پروتئین اصلی کپسید (L1) به­صورت ذرات شبه ویروسی (VLP) ایجاد می‌شوند. واکسن‌های موجود در بازار پروفیلاکتیک هستند و با تزریق این واکسن­ها آنتی­بادی­های خنثی کننده ویروس در بدن تولید می‌شوند (14،15). واکسن‌هایی که در حال حاضر استفاده می‌شوند قادر به مقابله با عفونت‌های پیشین نیستند و هم­چنین سلول‌های آلوده را نیز حذف نمی‌کنند. علاوه­بر این‌، تولید و انتقال این واکسن‌ها هزینه‌بر است و به­همین دلیل در کشورهایی با درآمد کم و یا فقیر کاربرد گسترده‌ای ندارند (16). از این­رو علاوه­بر در دسترس بودن برای عموم مردم، نیاز به واکسنی که درمانی باشد و قادر به ایجاد پاسخ سلول‌های T CD8+ و CD4+ باشد همواره احساس می‌شود. ژن‌های E6 و E7 اغلب تنها ژن‌های ویروسی هستند که در سلول‌های سرطانی به­طور پیوسته بیان می‌شوند، از این­رو اهداف درمانی مناسبی برای ایمونوتراپی سرطان دهانه رحم هستند (17). در این مطالعه اقدام به طراحی یک سازه بر پایه وکتور pcDNA3.1(-) شد که حاوی نواحی ایمونوژنیک پروتئین اصلی ساختاری HPV (L1) و یک پروتئین انکوژنیک HPV (E7) است. براساس نتایج به­دست آمده از بررسی‌‌های بیوانفورماتیک، این ساختار توانایی تولید B cell، CTL و HTL را دارد. در مطالعه حاضر، ابتدا سازه ژنی پلی­اپی­توپی فیوژن L1E7 در وکتور pUC57 طراحی و سنتز شد. سپس ساب کلون کردن L1E7 در وکتور بیان یوکاریوتی pcDNA3.1(-) انجام شد. درنهایت سازه pcDNA-L1E7 به­صورت فاقد اندوتوکسین باکتری تهیه شد. نتایج هضم آنزیمی وکتور نوترکیب با BamHI/HindIII حضور باند حدود 639 جفت بازی را نشان داد.
  
از آنجایی که L1 و E7 برای تولید واکسن مورد توجه قرار گرفتند، ابتدا اقدام به تولید ذرات شبه ویروسی با ترکیب این دو پروتئین صورت گرفت. Schafer و همکاران در سال 1999 اقدام به تولید CVLP (Chimeric Papilomavirus-like particles) کردند. از L1ΔCE71-55  و  L1ΔCE71-60 استفاده کردند و نتایج نشان داد که ترکیب L1 و E7 به­صورت VLP قابلیت تولید CTL و حذف سلول‌های توموری را دارد (18). در سال 2001 Kaufmann و همکاران از CVLP طراحی شده برای HPV16 به منظور القای پاسخ ایمنی در شرایط برون تنی (in vitro) استفاده کردند. در مطالعه آن­ها نشان داده شد که HPV16 L1ΔCE7 CVLPs توانایی القاء پاسخ HLA محدود به CTL را در شرایط برون تنی دارند (19). با گسترش بحث DNA واکسن‌ها، طراحی این واکسن‌ها برای HPV مورد توجه قرار گرفت.
 
مطالعه­های قبلی که به طراحی DNA واکسن‌ها در مقابله با HPV پرداخته‌اند، از پروتئین‌های ساختاری (L1، L2 و یا ترکیبی از آن‌ها) یا پروتئین‌های انکوژن (E5، E6، E7 و یاترکیبی از آن‌ها) در طراحی سازه استفاده کرده‌اند. در این مطالعه برای نخستین بار از ترکیب دو پروتئین اصلی L1 و E7 به­طور هم­زمان در طراحی ساختار DNAیی استفاده شده است. Panahi و همکاران در سال 2019 اقدام­به طراحی سازه‌های DNA به­صورت E5+E6، E6+E7، E5+E7 و E5+E6+E7 کردند. توالی‌ها از سویه‌های 16، 18، 31 و 45 انتخاب شدند. نتایج مطالعه آن­ها نشان داد که پلی‌پپتید با توالی E5+E6+E7 و هم­چنین ترکیب پلی‌پپتید و DNA به­صورت polypeptide E5+E6+E7 DNA/E5+E6+E7 بیش­ترین میزان ایمنی را در موش­های C57BL/6 حامل تومور TC-1 ایجاد کردند (12). Namvar و همکاران نیز در سال 2019 از پروتئین‌های ساختاری L1 و L2 برای طراحی پپتید واکسن استفاده کردند. نتایج مطالعه­های آن‌ها نشان داد که ترکیب پپتیدهای انتخابی L1 و L2 (L1+L2) میزان ایمنی بیش­تری ایجاد کرده و توانایی بیش­تری در کاهش و به تأخیر اقتادن رشد سلول‌های توموری دارد (13). در مطالعه حاضر، هر دو اپی­توپ­های ایمنوژنیک و حفاظت شده L1 و E7 به­صورت فیوژن در ساختار یک وکتور بیان یوکاریوتی بکار برده شدند. وکتور تخلیص شده حاصل در آینده به­عنوان واکسن DNAیی تحت شرایط درون تنی مورد استفاده قرار خواهد گرفت.
 
نتیجه‌گیری
در این مطالعه پس از انتخاب نواحی ایمونوژنیک، سازه L1-E7 طراحی و در وکتور بیانی یوکاریوتی ساب کلون شد. سازه مذکور با هدف کاربرد به­عنوان واکسن طراحی گردید. نتایج تعیین غلظت و خلوص با اسپکتروفتومتری نانودراپ نشان داد که پس از خالص سازی پلاسمید به­صورت فاقد اندوتوکسین، pcDNA-L1E7 غلظت و خلوص مناسبی دارد. در مطالعه­های آینده، از این ساختار به­عنوان DNA واکسن برای مطالعه­های درون تنی استفاده خواهد شد.

منابع
1. Hill EK. Updates in Cervical Cancer Treatment. Clinical Obstetrics and Gynecology. 2020;63(1):3-11.
2. Human Papillomavirus - World Health Organization.
3. Yang Y-C, Chang T-Y, Chen T-C, Lin W-S, Lin C-L, Lee Y-J. Replication of results from a cervical cancer genome-wide association study in Taiwanese women. Scientific Reports. 2018;8(1):15319.
4. Small Jr W, Bacon MA, Bajaj A, Chuang LT, Fisher BJ, Harkenrider MM, et al. Cervical cancer: a global health crisis. Cancer. 2017;123(13):2404-12.
5. Morshed K, Polz-Gruszka D, Szymański M, Polz-Dacewicz M. Human papillomavirus (HPV)–structure, epidemiology and pathogenesis. Otolaryngologia Polska. 2014;68(5):213-9.
6. Mühr LSA, Eklund C, Dillner J. Towards quality and order in human papillomavirus research. Virology. 2018;519:74-6.
7. Borysiewicz L, Fiander A, Nimako M, Man S, Wilkinson GWG, Westmoreland D, et al. A recombinant vaccinia virus encoding human papillomavirus types 16 and 18, E6 and E7 proteins as immunotherapy for cervical cancer. The Lancet. 1996;347(9014):1523-7.
8. Kirnbauer R, Booy F, Cheng N, Lowy D, Schiller J. Papillomavirus L1 major capsid protein self-assembles into virus-like particles that are highly immunogenic. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1992;89(24):12180-4.
9. Bagarazzi ML, Yan J, Morrow MP, Shen X, Parker RL, Lee JC, et al. Immunotherapy against HPV16/18 generates potent TH1 and cytotoxic cellular immune responses. Science translational medicine. 2012;4(155):155ra38-ra38.
10. Ma W, Melief CJ, van der Burg SH. Control of immune escaped human papilloma virus is regained after therapeutic vaccination. Current opinion in virology. 2017;23:16-22.
11. Elnaz Abbasifarid AB, Shiva Irani, Fattah Sotoodehnejadnematalahi. In silico and in vitro analysis of a multiepitope L1-E7 fusion construct for vaccine development against human papillomaviruses Letters in Drug Design & Discovery (Submitted). 2021.
12. Panahi HA, Bolhassani A, Javadi G, Noormohammadi Z, Agi E. Development of multiepitope therapeutic vaccines against the most prevalent high-risk human papillomaviruses. Immunotherapy. 2020;12(7):459-79.
13. Namvar A, Bolhassani A, Javadi G, Noormohammadi Z. In silico/In vivo analysis of high-risk papillomavirus L1 and L2 conserved sequences for development of cross-subtype prophylactic vaccine. Scientific reports. 2019;9(1):1-22.
14. Schiller J, Lowy D. Explanations for the high potency of HPV prophylactic vaccines. Vaccine. 2018.
15. Brisson M, Kim JJ, Canfell K, Drolet M, Gingras G, Burger EA, et al. Impact of HPV vaccination and cervical screening on cervical cancer elimination: a comparative modelling analysis in 78 low-income and lower-middle-income countries. The Lancet. 2020;395(10224):575-90.
16. Che Y, Yang Y, Suo J, An Y, Wang X. Induction of systemic immune responses and reversion of immunosuppression in the tumor microenvironment by a therapeutic vaccine for cervical cancer. Cancer Immunology, Immunotherapy. 2020:1-14.
17. Wick DA, Webb JR. A novel, broad spectrum therapeutic HPV vaccine targeting the E7 proteins of HPV16, 18, 31, 45 and 52 that elicits potent E7-specific CD8T cell immunity and regression of large, established, E7-expressing TC-1 tumors. Vaccine. 2011;29(44):7857-66.
18. Schäfer K, Müller M, Faath S, Henn A, Osen W, Zentgraf H, et al. Immune response to human papillomavirus 16 L1E7 chimeric virus‐like particles: induction of cytotoxic T cells and specific tumor protection. International journal of cancer. 1999;81(6):881-8.
19. Kaufmann A, Nieland J, Schinz M, Nonn M, Gabelsberger J, Meissner H, et al. HPV16 L1E7 chimeric virus‐like particles induce specific HLA‐restricted T cells in humans after in vitro vaccination. International journal of cancer. 2001;92(2):285-93.
 
 
 
Type of Study: Research Article | Subject: Cellular and molecular
Received: 2021/04/14 | Accepted: 2021/07/23 | Published: 2021/09/1

Add your comments about this article : Your username or Email:
CAPTCHA

Rights and permissions
Creative Commons License This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

© 2024 CC BY-NC 4.0 | New Cellular and Molecular Biotechnology Journal

Designed & Developed by : Yektaweb