Volume 11, Issue 44 (9-2021)                   NCMBJ 2021, 11(44): 29-40 | Back to browse issues page

XML Persian Abstract Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Najafi M, Nakhaei Moghaddam M, Najafi M, Yousefi E. Application of phenazine pigment of Pseudomonas aeruginosa isolates to prepare colored paper and candle. NCMBJ 2021; 11 (44) :29-40
URL: http://ncmbjpiau.ir/article-1-1419-en.html
Department of Biology, Faculty of Science, Damghan Branch, Islamic Azad University, Damghan, Iran
Full-Text [PDF 491 kb]   (723 Downloads)     |   Abstract (HTML)  (2843 Views)
Full-Text:   (1759 Views)

Application of phenazine pigment of Pseudomonas

aeruginosa isolates to prepare colored paper and candle

Maliheh Najafi1, Mahboobeh Nakhaei Moghaddam2*, Mahboobeh Najafi1,

Ehsan Yousefi2

1. Department of Biology, Faculty of Science, Damghan Branch, Islamic Azad University, Damghan, Iran

2. Department of Biology, Faculty of Science, Mashhad Branch, Islamic Azad University, Mashhad, Iran

Abstract

Aim and Background: Microorganisms are more important than other sources in dye production because microorganisms have advantages such as rapid growth, higher yields, and easier extraction. Natural pigments are healthier than chemical types and their use is useful in various industries. The aim of this study was to isolate and extract the pyocyanin pigment from Pseudomonas aeruginosa isolates in order to preparation of colored paper and candle.

Material and Methods: In this study, sampling was performed from different hospital environments in order to isolate P. aeruginosa. Environmental isolates of P. aeruginosa were identified using morphological features and differential biochemical methods. Confirmatory identification was performed by tracing the pbo1 gene using colony PCR. After extracting pyocyanin pigment with chloroform, finally, the produced pyocyanin was used to prepare colored paper and candle and the optical stability of pyocyanin was investigated.

Results: From 43 environmental samples collected, 15 isolates of P. aeruginosa were identified and confirmed by molecular method. The mean of optical absorption (OD520) of pyocyanin after extraction was 0.488. Staining of paper and candle with the extracted pyocyanin was successful and the optical stability of pyocyanin was favorable.

Conclusion: Due to the rapid growth of bacteria and the possibility of its mass production in a short time and based on the results of this study, bacterial pigments can be used in various industries, including paper industry, and replaced by chemical dyes.

Keywords: Pseudomonas aeruginosa, Phenazine, pbo1 gene, Iau Science.

 

 

 

 

 

 

Corresponding author:

Department of Biology, Faculty of Science, Mashhad Branch, Islamic Azad University, Mashhad, Iran Email: m.nakhaei@mshdiau.ac.ir

 

 

 

 

 

کاربرد پیگمان فنازین ایزوله­های سودوموناس آئروجینوزا

 برای تهیه کاغذ و شمع رنگی

ملیحه نجفی1، محبوبه نخعی مقدم2*، محبوبه نجفی1، احسان یوسفی2

1. گروه زیست­شناسی، دانشکده علوم، واحد دامغان، دانشگاه آزاد اسلامی، دامغان، ایران

2. گروه زیست­شناسی، دانشکده علوم، واحد مشهد، دانشگاه آزاد اسلامی، مشهد، ایران


چکیده

سابقه و هدف: میکروارگانیسم­ها نسبت­به سایر منابع در تولید رنگ، اهمیت دارند، زیرا میکروارگانیسم­ها مزایایی از جمله رشد سریع، بازدهی بالاتر و استخراج راحت ­تر دارند. رنگدانه­ های طبیعی سالم­تر از انواع شیمیایی هستند و استفاده از آن­ها در صنایع مختلف مفید است. هدف از انجام این تحقیق، جداسازی و استخراج پیگمان پیوسیانین از ایزوله­ های محیطی سودوموناس آئروجینوزا به­ منظور تهیه کاغذ و شمع رنگی بود.

مواد و روش­ها: در این مطالعه، به­ منظور جداسازی سودوموناس آئروجینوزا، نمونه ­برداری از محیط­های مختلف انجام شد. ایزوله­ های محیطی سودوموناس آئروجینوزا با استفاده از ویژگی­های مورفولوژی و روش­های بیوشیمیایی افتراقی شناسایی شدند. شناسایی تأییدی از طریق ردیابی ژن pbo1 با روش کلنی Polymerase Chain Reaction انجام شد. پس از استخراج پیگمان پیوسیانین با کلروفرم، در نهایت از پیوسیانین تولیدی برای تهیه کاغذ و شمع رنگی استفاده و ثبات نوری پیوسیانین بررسی شد.

یافته­ ها: از 43 نمونه محیطی جمع­آوری شده، تعداد 15 ایزوله سودوموناس آئروجینوزا شناسایی و با روش مولکولی تأیید شد. میانگین جذب نوری (OD520) پیوسیانین سودوموناس آئروجینوزا بعد از استخراج 488/0 بود. رنگ­ آمیزی کاغذ و شمع با پیوسیانین استخراج شده موفقیت­آمیز و ثبات نوری پیوسیانین مطلوب بود.

نتیجه­ گیری: ﺑﺎ ﺗﻮﺟﻪ­ﺑﻪ رﺷﺪ ﺳﺮﻳﻊ ﺑﺎﻛﺘﺮیﻫﺎ و اﻣﻜﺎن ﺗﻮﻟﻴﺪ اﻧﺒﻮه آن در ﻣﺪت زﻣﺎن ﻛﻮﺗﺎه و بر اساس نتایج تحقیق حاضر، ﻣﻲﺗﻮان از پیگمان­ باکتری­ها در برخی ﺻﻨﺎﻳﻊ از جمله صنعت کاغذ استفاده و آن­ها را جایگزین رنگ­های شیمیایی کرد.

واژگان کلیدی: سودوموناس آئروجینوزا، فنازین، ژن ،pbo1،. Iau Science


 

مقدمه

ـــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ

نویسنده مسئول:

گروه زیست­شناسی، دانشکده علوم، واحد مشهد، دانشگاه آزاد اسلامی، مشهد، ایران

پست الکترونیکی: m.nakhaei@mshdiau.ac.ir

تاریخ دریافت: 04/12/1399

تاریخ پذیرش: 23/06/1400

رنگ­های مصنوعی مشکلات زیست محیطی و بهداشتی قابل­توجهی را ایجاد کرده­اند. در مقابل، رنگدانه­های میکروبی سازگار با محیط زیست هستند و در صنایع نساجی، به­عنوان رنگ­های خوراکی، آنتی­اکسیدان ها، شاخص­های زیستی و عوامل ضدمیکروبی و ضد سرطان استفاده می­شوند (1). مواد شیمیایی حاصل از منابع نفتی و پتروشیمی از طریق فرآیندهای شیمیایی خطرناک تولید می­شوند که بسیاری از آن­ها تهدیدی برای محیط زیست و سلامت انسان به­شمار می­روند. برخی از عوارض ایـن رنگ­ها شامل اثرهای سرطان­زایی، تضعیف سیستم ایمنی، ایجاد آلرژی و کهیر، اختلال­های رفتاری و بیش فعالی در کودکان، رتینوپاتی، آسیب­های کبدی و اختلال در متابولیسم لیپیدها و آسم است (2). در سال­های اخیر به توسعه فناوری مواد اولیه در رنگرزی سازگار با محیط زیست، تجدیدپذیر، پایدار و ایمن توجه فراوانی شده است. استفاده از مواد طبیعی فاقد حساسیت­زایی، غیر سمی و دوست­دار محیط زیست در صنعت حائز اهمیت است (3). تاکنون بیش از 1500 ماده رنگ­زای طبیعی مورد بررسی و شناخت قرار گرفته­اند (4). امروزه به­دلیل افزایش روز افزون مخاطرات ناشی از فرآورده‌های نفتی و پساب‌های سمی ناشی از آن، ‏پتانسیل‌های فراوان طبیعت و زیست‌گونه­ ها و هم­چنین با ظهور موضوع­های مختلف مرتبط با استفاده بیش از حد از پیگمان­های مصنوعی نظر محققان را به خود جلب کرده­اند و تحقیقات گسترده­ ای در مورد رنگ­های طبیعی در سال­های اخیر آغاز شده است. از جمله منابع عظیم و متنوع طبیعی، میکروارگانیسم­ها هستند. فرآورده‌های ‏تولیدی توسط میکروارگانیسم‌ها طیف گسترده­ ای دارند. میکروارگانیسم­ها به­دلیل توانایی در تولید رنگ‌ها، آنزیم‌ها، داروها و ‏تجزیه و تبدیل مواد شیمیایی، جایگزین مناسبی برای آینده‌ی بدون نفت هستند. تولید پیگمان­های زیستی از باکتری­ها، به­دلیل سرعت رشد بالا، قابلیت تولید انبوه، پایین بودن هزینه تولید، بازده بالا، ثبات و پایداری بالا و سهولت پردازش فرآیندهای پایین­دستی یک روش مناسب برای جایگزینی رنگ­های شیمیایی است (8-5). در حال حاضر حجم گسترده ارتباطات فرهنگی، اقتصادی، اجتماعی و تبادل اطلاعات سبب افزایش مصرف کاغذ و محصول­های کاغذی شده است؛ از این جهت صنعت کاغذ و صنایع مرتبط به آن در دنیای کنونی جایگاه ویژه­ای دارد (9). سودوموناس آئروجینوزا یک باکتری گرم منفی، متحرک، هوازی و باسیلی شکل و یکی از ارگانیسم­های با ارزش تجاری است که بسیاری از سویه­های آن مسئول تولید رنگدانه­ های محلول در آب مانند پیوسیانین (آبی)، پیووردین (زرد-سبز)، پیوروبین (قرمز) و پیوملانین (قهوه ای) هستند (13-10). پیوسیانین (ان- متیل، ال- هیدروکسی فنازین) از نظر شیمیایی در گروه فنازین­ها قرار دارد. فنازین­ها ترکیب­های هیدروسیکلیک نیتروژن­دار هستند (شکل 1) (13،12).

شکل 1. ساختار پیوسیانین

 

در سودوموناس آئروجینورا دو نسخه اختصاصی از اپرون بیوسنتز پیوسیانین (pbo)، به نام (phzI) phz A1 B1 C1 D1 E1 F1 G1 و (phzII) phz A2 B2 C2 D2 E2 F2 G2 وجود دارد. این دو اپرون 3/98 درصد در سطح DNA به­صورت همولوگ هستند، ولی در ناحیه پروموتور متفاوت­اند. علاوه­بر این، دو ژن دیگر به نام­های phz M و phz S نقش اساسی در مسیر بیوسنتز پیوسیانین دارند (14،13). اثرهای مضر رنگ­های مصنوعی و مواد شیمیایی مورد استفاده در زمان رنگ­آمیزی ما را بر آن داشت تا در مورد تهیه رنگ جایگزین با استفاده از منابع طبیعی تلاش کنیم. بنابراین، با توجه­به اهمیت حفاظت از محیط زیست و نقش پیگمان­های زیستی در کاهش آلودگی­های زیست­محیطی، هدف از انجام این تحقیق، استخراج پیگمان پیوسیانین از ایزوله­های محیطی سودوموناس آئروجینوزا به منظور تهیه کاغذ و شمع رنگی بود.

مواد و روش­ها

جداسازی و شناسایی بیوشیمیایی سودوموناس آئروجینوزا

برای جمع­آوری ایزوله­های محیطی سودوموناس آئروجینوزا نمونه­برداری توسط سوآب استریل از نواحی شامل سرویس بهداشتی، صابون، حمام، خاک، دستگاه دیالیز و ساکشن و سطح وسایل در منزل و یا بیمارستان انجام گرفت و سوآب داخل محیط نوترینت براث استریل انداخته شد. پس از انتقال نمونه­ها به آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشگاه آزاد اسلامی مشهد و انکوباسیون شبانه آن­ها در دمای C°37 و شرایط هوازی، انتقال با روش کشت ایزوله روی محیط ائوزین متیلن­بلو آگار و ستریماید آگار انجام گرفت و به­مدت 24 ساعت در دمای C°37 انکوبه شد. سپس کلونی­های مشکوک، جداسازی و خالص­سازی شدند. شناسایی بیوشیمیایی باکتری­های سودوموناس آئروجینوزای جدا شده با استفاده از رنگ­آمیزی گرم و آزمایش­های بیوشیمیایی مرسوم (اکسیداز، کاتالاز، متیل ­رد، اوره، کشت در محیط­های TSI آگار، SIM، سیمون سیترات، محیط OF و کشت در محیط ستریماید آگار (شکل 2) و رشد در دمای C°42) انجام شد (15).

 

   

شناسایی مولکولی سودوموناس آئروجینوزا

جهت تأیید باکتری­های سودوموناس آئروجینوزای جدا شده از نمونه­های محیطی و ردیابی ژن تولید پیگمان از روش کلنی PCR و آغازگرهای ژن pbo1 (Sinaclon, Iran) مطابق با جدول 1 استفاده شد. با استفاده از نرم­افزارهای بیوانفورماتیکی و داده­های موجود در پایگاه NCBI استخراج توالی دقیق ژن pbo1 صورت پذیرفت. ابتدا توالی کامل ژن pbo1 براساس سایت، http://www.ncbi.nim.nih.yov (سودوموناس آئروجینوزا PAO1 و Accession no=AF005404) در نظر گرفته شد و سپس با نرم­افزار oligo 7 پرایمرهای مناسب برای تکثیر بخشی از ژن­ها طراحی شدند. جهت اطمینان از صحت توالی­های استخراج شده، ارزیابی آن­ها با استفاده از جعبه ابزار BlastN در پایگاه NCBI انجام شد.

 

 

جدول 1. مشخصات آغازگرهای مورد استفاده برای ردیابی ژن pbo1 در ایزوله­های سودوموناس آئروجینوزای جدا شده از نمونه­های محیطی

توالی آغازگر پیشرو ('3'5)

توالی آغازگر پیرو ('3'5)

طول محصول PCR (جفت باز)

CGCTCGGGATCGCTTCTG

GGACGCCTGACGCTGATC

400

 

 

 

مخلوط واکنش کلنی PCR برای تکثیر ژن­ pbo1 در حجم نهایی 25 میکرولیتر حاوی 5/0 میکرولیتر dNTPs (mM 2/0)، 75/0 میکرولیتر منیزیم کلرید (mM 2/0)، 1 میکرولیتر از هر یک از آغازگرهای پیشرو و پیرو (Pmol/μl 5/2)، 25/0 میکرولیتر Taq پلی­مراز ( unit/μl2/1) (Sinaclon, Iran)، 3 میکرولیتر بافر واکنش­گر (X 1)، 1 کلنی از باکتری و 5/17 میکرولیتر آب مقطر آماده شد. کلنی PCR توسط ترموسایکلر (Kyratec, Kore) و مطابق با چرخه­های دمایی زیر انجام شد: واسرشت اولیه در دمای C°95 به­مدت 5 دقیقه، واسرشت ثانویه در دمای C°95 به­مدت 1 دقیقه در 30 چرخه، اتصال در دمای C°58 به­مدت 1 دقیقه، بسپارش در دمای C°72 به­مدت 30 ثانیه و بسپارش نهایی در دمای C°72 به­مدت 7 دقیقه. محصول­های واکنش بر روی ژل آگارز 5/1 درصد حاوی اتیدیوم بروماید (CinnaGen, Iran) به­مدت 30 دقیقه با ولتاژ 90 ولت الکتروفورز (Interlab, Italy) شدند. سپس نمونه­های رانده شده در ژل توسط دستگاه فرابنفش لومیناتور (Caution, EEC) مشاهده و در نهایت از باندها با استفاده از دستگاه ژل داک (Kimiagene, Iran) عکس گرفته شد (16). از سودوموناس آئروجینوزا با شماره استاندارد ATCC 1074 (تهیه شده از سازمان پژوهش­های علمی و صنعتی ایران) به عنوان کنترل مثبت و از آب مقطر به عنوان کنترل منفی استفاده شد.

استخراج پیوسیانین سودوموناس آئروجینوزا

مقدار 250 میکرولیتر سوسپانسیون سودوموناس آئروجینوزا (01/0OD620 =) رشد یافته در محیط لوریا برتانی (LB, Merck, Germany) به 25 میلی­لیتر محیط گلیسرول آلانین (GA, Merck, Germany) تلقیح و به­مدت 24 ساعت در انکوباتور شیکردار (دمای C°37) با سرعت rpm 200 گرماگذاری شد. در مرحله بعد، نمونه­ها با سرعت rpm 10000 به­مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ (Sigma, USA) شدند. مایع رویی جمع­آوری و از فیلتر با قطر منافذ 22/0 میکرومتر عبور داده شد. به 5/7 میکرولیتر از مایع رویی فیلتر شده، مقدار 5/4 میلی­لیتر کلروفرم اضافه و 10 مرتبه، هر مرتبه به­مدت 2 ثانیه ورتکس شد. این مرحله برای هر ایزوله 3 بار تکرار شد. کلروفرم در ته لوله قرار می­گیرد و به­علت اینکه پیوسیانین در کلروفرم حل می­شود، به آبی متمایل به سبز تغییر رنگ می­دهد. سانتریفیوژ نمونه­ها پس از تغییر رنگ با سرعت rpm 10000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. مقدار 3 میلی­لیتر از لایه آبی رنگ جمع شده در ته لوله (مخلوط کلروفرم و پیوسیانین) به لوله جدید منتقل و به­منظور اسیدی شدن مخلوط، مقدار 5/1 میلی­لیتر اسید کلریدریک 2/0 مولار به آن اضافه و ورتکس شد (تغییر رنگ آبی به صورتی). سپس، نمونه­ها با سرعت rpm 10000 به­مدت 2 دقیقه سانتریفیوژ و مقدار 1 میلی­لیتر از مایع صورتی رنگ به کووت منتقل و جذب آن در طول موج 520 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. این آزمایش به طور مشابه، برای تمامی ایزوله­ها و سویه استاندارد سودوموناس آئروجینوزا ATCC 1074، 3 بار تکرار شد. در نهایت غلظت پیوسیانین با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد (17).

5/1 × 072/17 × OD520 = غلظت پیوسیانین (میکروگرم در میلی­لیتر)

تهیه کاغذ و شمع رنگی با استفاده از پیگمان پیوسیانین استخراج شده

از پیوسیانین تولید شده در محیط GA برای تهیه کاغذ و شمع رنگی استفاده شد. برای این منظور از ایزوله­های با ظرفیت بالاتر پیگمان استفاده شد. رنگ با استفاده از حلال کلروفرم استخراج و به منظور تغلیظ، 24 ساعت در انکوباتور C°37 گذاشته شد. از 25 میلی­لیتر محیط GA که سودوموناس آئروجینوزا در آن تولید پیگمان پیوسیانین کرده بود، 18 میلی­لیتر محلول رنگ جدا شد که 4 میلی­لیتر از آن برای رنگ­آمیزی کاغذ مورد استفاده قرار گرفت. به این صورت که کاغذ در بشر حاوی محلول قرار داده شد و بعد از 10 دقیقه، کاغذ از بشر خارج و در دمای محیط خشک شد. از لایه آبی شده به پارافین مذاب اضافه گردید. بعد از مدتی پارافین در دمای اتاق می­بندد و یک شمع با رنگ پیگمان باکتری تهیه می­شود. 

بررسی ثبات نوری پیگمان

ثبات نوری کاغذ رنگ­آمیزی شده مطابق استاندارد ISO 105/B02 توسط دستگاه ثبات نوری (Ress Sanj, Iran) اندازه­گیری شد (18).

یافته ها

جداسازی و شناسایی بیوشیمیایی ایزوله های سودوموناس آئروجینوزا از نمونه­های محیطی و ردیابی ژن مولد پیگمان 

بر اساس نتایج آزمون­های بیوشیمیایی در جدول 2، تعداد 15 ایزوله سودوموناس آئروجینوزا از نمونه­های محیطی جمع­آوری شد.

 

 

جدول 2. نتایج آزمون­های بیوشیمیایی جهت تشخیص سودوموناس آئروجینوزا

آزمایش

گرم

اکسیداز

کاتالاز

تخمیر قندها

اندول

حرکت

رشد در محیط ستریماید در دمای C°37

متیل رد

اوره­آز

سیتراتاز

نتیجه

باسیل G¯

+

+

-

-

+

+

-

-

+

 

 

نتایج کلنی PCR وجود ژن pbo1 را در تمامی 15 ایزوله سودوموناس آئروجینوزای جدا شده تایید کرد. در شکل 3، ژل الکتروفورز محصول کلنی PCR تعدادی از ایزوله­ ها در کنار نشانگر 50 جفت­بازی نشان داده شده است.

استخراج پیوسیانین سودوموناس آئروجینوزا

پیوسیانین سودوموناس آئروجینوزا بعد از استخراج در شکل 4 نشان داده شده است. میانگین جذب نوری پیوسیانین سودوموناس آئروجینوزا بعد از استخراج با 3 تکرار در جدول 3 آمده است.

همان­طوری که در جدول 5 مشخص است، در میان ایزوله­های محیطی سودوموناس آئروجینوزا، ایزوله 2 و 11 بیش­ترین میزان تولید پیوسیانین و ایزوله 10 کم­ترین مقدار تولید پیگمان را بر اساس جذب نوری در طول موج nm520 داشتند.

   

 

شکل 3. ژل الکتروفورز محصول کلنی PCR  بعد از تکثیر ژن pbo1 تعدادی از ایزوله­های سودوموناس آئروجینوزا (1-4: نمونه­ها)

 

 

شکل 4. پیوسیانین سودوموناس آئروجینوزا بعد از استخراج

 

جدول3. جذب نوری (OD520) پیوسیانین استخراج شده از ایزوله­های محیطی سودوموناس آئروجینوزا

جذب نوری پیوسیانین بعد از استخراج

باکتری

 

تکرار سوم

تکرار دوم

تکرار اول

507/0

501/0

502/0

استاندارد

502/0

498/0

500/0

ایزوله 1

724/0

722/0

721/0

ایزوله 2

490/0

492/0

490/0

ایزوله 3

540/0

538/0

539/0

ایزوله 4

254/0

252/0

250/0

ایزوله 5

340/0

387/0

388/0

ایزوله 6

383/0

380/0

382/0

ایزوله 7

312/0

309/0

310/0

ایزوله 8

673/0

675/0

670/0

ایزوله 9

240/0

243/0

241/0

ایزوله 10

705/0

703/0

704/0

ایزوله 11

341/0

359/0

358/0

ایزوله 12

554/0

552/0

550/0

ایزوله 13

655/0

653/0

654/0

ایزوله 14

667/0

665/0

661/0

ایزوله 15

474/0

495/0

495/0

میانگین

488/0

میانگین کل

 

رنگ­آمیزی کاغذ و تهیه شمع با پیگمان پیوسیانین و بررسی ثبات نوری پیوسیانین

شکل 5، کاغذها و شمع رنگ­آمیزی شده با پیگمان پیوسیانین تولید شده توسط ایزوله­های محیطی سودوموناس آئروجینوزا را نشان می­دهد. ثبات رنگ کاغذ بعد از رنگ­آمیزی با پیوسیانین مطلوب تعیین شد.

 

 

شکل 5. کاغذها و شمع رنگ­آمیزی شده با پیگمان پیوسیانین

 

 

 

بحث

پیگمان­ها ﺑﻪ­طور وسیعی در تهیه ﻏﺬا، ﭘﻮﺷﺎک، اسباب بازی کودکان، رﻧﮕ­ﺮزی و صنایع دیگر ﺑﻪ­کار می­رود. به این دﻟﻴﻞ که رﻧﮓدﻫﻨﺪهﻫﺎی ﺷﻴﻤﻴﺎﻳﻲ مشکلاتی را برای انسان و محیط زیست اﻳﺠﺎد میﻛﻨﻨﺪ، ﺗﺤﻘﻴﻘﺎت متعددی ﺑﺮای دﺳﺘ­ﻴﺎﺑﻲ ﺑﻪ ﻣﺤﺼﻮل­های ﻣﻄﻤﺌﻦ و پیگمان­های ﻃﺒﻴﻌﻲ از ﻣﻨﺎﺑﻊ ﻃﺒﻴﻌﻲ انجام شده است. ﻣﺪاﻓﻌﺎن محیط زیست ﻣﻌﺘﻘﺪﻧﺪ ﻛﻪ رﻧﮓ­های طبیعی از ﻟﺤﺎظ ﻛﻴﻔﻲ دارای ﺟﺎﻳﮕﺎه ﺑﺎﻻﺗﺮی ﺑﻮده و ﺑﻪ­دﻟﻴﻞ ﻃﻴﻒ رﻧﮕﻲ ﮔﺴﺘﺮده­ای ﻛﻪ دارند، چشم­نوازتر هستند. هم­چنین، ﺳﺎزﮔﺎری اﻳﻦ دﺳﺘﻪ از رﻧﮓ­ها با ﻃﺒﻴﻌﺖ و ﻗﺎﺑﻠﻴﺖ تجزیه­پذیری آن­ها از اهمیت بالایی برخوردار است. رﻧﮓﻫﺎی ﻃﺒﻴﻌﻲ ﺑﻪ­دﻟﻴﻞ تنوع بالا و آسان بودن تولید مورد توجه قرار گرفته­اند (19). رﻧﮕﺪاﻧﻪﻫﺎی ﻣﻴﻜﺮوﺑﻲ ﺑﻪ­دلیل ﺳﺮﻋﺖ رﺷﺪ ﺑﺎﻻی ﻣﻴﻜﺮوب­ﻫﺎ و اﻣﻜﺎن ﺗﻮﻟﻴﺪ اﻧﺒﻮه اﻳﻦ رﻧﮕﺪاﻧﻪ­ﻫﺎ اهمیت دارند (5). در این رابطه بر آن شدیم تا تولید رنگ از ایزوله­های محیطی سودوموناس آئروجینوزا که تحقیقات در مورد جنبه کاربردی آن کم بود و رنگدانه تولیدی نیز رنگ زیبایی داشت، مورد مطالعه قرار دهیم. در همین رابطه، Nowroozi و همکاران گزارش کردند که سودوموناس­هایی که دارای ژن­های phzM و phzS هستند، قادر به تولید پیگمان پیوسیانین هستند (20). در این مطالعه، بر اساس آزمایش­های بیوشیمیایی و مولکولی (ردیابی ژن pbo1، ژن اپرون بیوسنتز پیوسیانین) تعداد 15 ایزوله سودوموناس آئروجینوزا از نمونه­های محیطی جدا و شناسایی شد. در مطالعه Higgins و همکاران در سال 2018، مشابه با تحقیق حاضر از ژن pbo (phz1 و phz2) برای شناسایی سودوموناس آئروجینوزا استفاده کردند (14). در میان ایزوله­های محیطی سودوموناس آئروجینوزا، توانایی تولید پیگمان در ایزوله­های مختلف، بر اساس جذب نوری در طول موج nm 520، با یکدیگر و با سویه رفرنس متفاوت بود. Khan و همکاران در سال 2019، مشابه با تحقیق حاضر از سودوموناس آئروجینوزا PAO1 KCTC 1637 پیگمان پیوسیانین استخراج کردند (21). نتیجه رنگ­آمیزی کاغذ و شمع با پیوسیانین مطلوب و قابل قبول بود. میزان تولید پیگمان در ایزوله­های مختلف متفاوت بود که می­توان با شناسایی ایزوله­های با پتانسیل تولید بیش­تر و بهینه­سازی شرایط محیطی، میزان استخراج رنگ را افزایش داد. در تحقیق حاضر نیز، در میان ایزوله­های مختلف مورد آزمایش، میزان تولید پیگمان در ایزوله 2 بیش­تر از سایرین و سویه رفرنس بود که می تواند به عنوان سویه برتر برای تولید رنگ معرفی شود.

در مطالعه­های گذشته، پیشینه­ای در جهت تهیه کاغذ و شمع رنگی با پیگمان­های سودوموناس آئروجینوزا یافت نشد. مشابه با پژوهش حاضر، در مطالعاه­های گوناگون از پیگمان­های باکتریایی در صنایع مختلف از جمله رنگرزی لباس، صنایع غذایی و دارویی و محصول­های آرایشی به­عنوان رنگ­زا استفاده شده است (22،23). در تحقیق DeBritto و همکاران در سال 2020، پارچه­های پنبه­ای را با پیوسیانین استخراج شده از سودوموناس آئروجینوزا رنگ­آمیزی کردند که همانند تحقیق حاضر، ثبات رنگ تأیید شد (11). Jissa و همکاران در سال 2008 با استفاده از پیگمان تولید شده توسط گونه­های سراشیا اقدام به رنگ­آمیزی لاستیک، کاغذ، منسوجات و پلاستیک نمودند و بیان کردند که پیگمان استخراج شده خاصیت رنگرزی دارد و همانند تحقیق حاضر، ثبات رنگ با آزمایشات مربوطه تأیید شد (24). Heydari و همکاران در سال 1393، پتانسیل جذب پرتوی فرابنفش توسط رنگدانه جداسازی شده از قارچ‌های آسپرژیلوس و پنی­سیلیوم به­منظور استفاده در ترکیب­های ضد آفتاب را بررسی نمودند. نتایج به­دست آمده در این مطالعه نشان داد که پیگمان­های جداسازی شده از قارچ­های پنی­سیلیوم و آسپرژیلوس محافظت خوبی را در مقابل اشعه ماورای بنفش از خود نشان داده­اند. هم­چنین در زمینه بررسی تنوع رنگ، در بین گونه‌های قارچی مورد ارزیابی پیگمان­های زرد و مشکی بهترین جذب اشعه را دارا بودند. بنابراین می­توان از این پیگمان­های طبیعی به­جای ترکیب­های شیمیایی در کرم­های ضد آفتاب استفاده نمود (25). در تحقیق حاضر با استخراج پیوسیانین، کاغذ و شمع رنگ­آمیزی شد که مزایای استفاده از پیگمان باکتری­ها، رشد سریع، محیط کشت ارزان و تنوع رنگ در رنگدانه­ها است. محققین نشان داده­اند که پیگمان قارچ­هایی مثل پنی­سیلیوم و موناسکوس را می­توان استخراج نمود و در صنایع چرم، پارچه، کاغذ و رنگ استفاده کرد (26). سودوموناس آئروجینوزا توانایی تولید رنگدانه­های محلول در آب نظیر رنگدانه غیر فلوئورسنتی آبی رنگ یا پیوسیانین که محلول در آب و کلروفرم است، رنگدانه فلوئورسنتی سبز رنگ به نام پیوردین، رنگدانه فلوئورسنتی قرمز تیره پیوروبین و رنگدانه فلوئورسنتی سیاه پیوملانین را دارد. پیوسیانین رنگدانه اختصاصی سودوموناس است و می­توان آن را با کلروفرم از محلول­های آبی جدا کرد. اغلب این رنگدانه­ها دارای عملکردهای زیستی مهمی از جمله فعالیت آنتی­بیوتیکی، ضد قارچی و ضد توموری هستند (27). رنگ حاصله برخلاف باکتری مولد آن خاصیت بیماری­زایی نداشت، بلکه همان­طوری­که ذکر شد می­تواند خاصیت ضد میکروبی داشته باشد.

در سال­های اخیر توجه زیادی به پیگمان­های میکروارگانیسم­ها و مسیرهای بیوسنتز آن­ها شده است. میکروارگانیسم­هایی هم­چون قارچ­ها و باکتری­ها می­توانند یک منبع با ارزش برای تولید مواد رنگی باشند و با طیفی گسترده به­کار روند. تولید رنگ­های مصنوعی شاید از لحاظ اقتصادی مقرون­به صرفه باشد، اما رنگ­های مصنوعی با چالش­هایی از جمله وابستگی­به منابع نفتی غیرقابل احیا، سمیت محیطی، مسائل بهداشتی و عدم بازیافت رو به­رو هستند. در حالی­که رنگ­های طبیعی مصرف شده می­توانند بازیافت شده و هیچ بوی نامطبوعی ندارند. بنابراین جستجوی منابع طبیعی که از لحاظ زیست­محیطی هم سازگار باشند، برای تولید مواد رنگی یک نیاز ضروری است (28). در تحقیق حاضر با پیگمان طبیعی پیوسیانین کاغذ رنگ­آمیزی شد، ولی با تحقیقات بیش­تر برای تعیین ساختار پیگمان­ها و حذف گروه­های سمی پیگمان­ها می­توان از آن­ها در صنایع مختلف استفاده نمود. 

پیگمان­های طبیعی از دو منبع مهم گیاهان و میکروارگانیسم­ها حاصل می­شوند. تولید پیگمان از میکروارگانیسم­ها با توجه­به رشد سریع و آسان، محیط کشت ارزان، استخراج راحت­تر، عدم وابستگی­به شرایط جوی و گستردگی تنوع رنگ نسبت­به سایر منابع زیستی دارای مزایای بیش­تری است. بسته­به نوع ترکیب­ها، آن­ها عملکردهای متفاوت و متنوعی برای میزبان دارند. به­طور مثال عمل حفاظتی در برابر فتواکسیدان­های کشنده مثل کارتنوئید­ها و عملکرد حفاظتی در برابر استرس­های محیط مثل ملانین­ها را دارند و به­عنوان کوفاکتور در کاتالیز آنزیم­ها مثل فلاوین­ها شرکت دارند (29).

نتیجه­گیری

نتایج تحقیق حاضر نشان داد که ایزوله­های محیطی سودوموناس آئروجینوزا در تولید رنگ طبیعی کارآیی داشتند و رنگ تولیدی، از ثبات مطلوبی نیز برخوردار بود. رنگ حاصل، ضمن خوش رنگ بودن و سازگاری با محیط زیست، دارای منبع طبیعی و خطرهای کم­تری در مقایسه با رنگ­های شیمیایی است. ﺑﺎ ﺗﻮﺟﻪ­ﺑﻪ رﺷﺪ ﺳﺮﻳﻊ ﺑﺎﻛﺘﺮیﻫﺎ و اﻣﻜﺎن ﺗﻮﻟﻴﺪ اﻧﺒﻮه آن در ﻣﺪت زﻣﺎن ﻛﻮﺗﺎه و براساس نتایج تحقیق حاضر، ﻣﻲﺗﻮان از پیگمان­ پیوسیانین به­عنوان یک رنگ طبیعی برای رنگ­آمیزی کاغذ و شمع استفاده و آن­را جایگزین رنگ­های شیمیایی نمود. هم­چنین نتایج نشان داد که ردیابی ژن pbo در سودوموناس آئروجینوزا با روش کلنی PCR و پرایمر طراحی شده در این تحقیق، می­تواند باعث صرفه­جویی در وقت، مواد و هزینه شود و احتمال آلودگی حین کار را نیز کاهش می­دهد.

سپاسگزاری

نویسندگان مقاله بدین­وسیله مراتب تشکر و قدردانی خود را از مسئولین محترم دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد جهت فراهم آوردن امکانات پژوهشی برای انجام این تحقیق ابراز می­دارند.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

منابع

1. Rao MPN, Xiao M, Li WJ. Fungal and bacterial pigments: secondary metabolites with wide applications. Front Microbiol. 2017; 8: 1113.

2. Abdullaev FI. Cancer chemopreventive and tumoricidal properties of saffron (Crocus sativus L.). Exp Biol Med. (Maywood). 2002; 227: 5-20.

3. Kasiri MB and Safapour S. Natural dyes and antimicrobials for green treatment of textiles. Environ Chem Lett. 2014; 12: 1-13.

4. Ghaffarzadeh and Edrisi M. A review on natural pigments and the extraction methods. JSCW (J Stud Color World) 2016; 6: 63-82. [In Persian]

5. Lu Y, Wang L, Xue Y, Zhang C, Xing X, Lou K, Zhang Z, Li Y, Zhang G, Bi J, Su Z. Production of violet pigment by a newly isolated psychrotrophic bacterium from a glacier in Xinjiang, China Biochem Eng J.; 2009.43:135-141.

6. Harasym J, and Bogacz-Radomska L. Colorants in foods-from past to present. Nauki Inz Technol. 2016; 3:21-35.

7. Mehrad B, Ravanfar R, Licker J, Regenstein JM, Abbaspourrad A. Enhancing the physicochemical stability of β-carotene solid lipid nanoparticle (SLNP) using whey protein isolate. Food Res Int. 2018; 105:962-969.

8. Tuli HS, Chaudhary P, Beniwal V, Sharma AK. Microbial pigments as natural color sources: current trends and future perspectives. Int J Food Sci Tech. 2015; 52: 4669-4678.

9. Ghaffarzadeh-Mollabashi O, Sharari M, Alebrahim MT. Investigation on the possibility of producing the pulp and paper from weeds. IJWP. 2017; 8: 241-251. [In Persian]

10. Doosti M, Faghihi MHO, Ramazani A, Saini MR. Comparison of conventional culture methods and Polymerase Chain Reaction (PCR) for specific detection of Pseudomonas aeruginosa. J Isfahan Med Sch. 2012; 30:780-786.

11. DeBritto S, Gajbar TD, Satapute P, Sundaram L, Lakshmikantha RY, Jogaiah S, Ito S. Isolation and characterization of nutrient dependent pyocyanin from Pseudomonas aeruginosa and its dye and agrochemical properties. Sci Rep. 2020; 10: 1542.

12. Blankenfeldt W, Parsons JF. The structural biology of phenazine biosynthesis. Curr Opin Struct Biol. 2014; 29: 26-33.

13. Raji El Feghali P, NawasT. Extraction and purification of pyocyanin: a simpler and more reliable method. MOJ Toxicol. 2018; 4: 417-422.

14. Higgins S, Heeb S, Rampioni G, Fletcher MP, Williams P, Camara M. Differential regulation of the phenazine biosynthetic operons by quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa PAO1-N. Front Cell Infect Microbiol. 2018; 8: 252.

15. Brown A, Horobin A, Blount DG, Hill PJ, English J, Rich A, Williams PM, Pritchard DI. Blow fly Lucilia sericata nuclease digests DNA associated with wound slough/eschar and with Pseudomonas aeruginosa biofilm. Med Vet Entomol. 2012; 26: 432-439.

16. Cao M, Fu Y, Guo Y, Pan J. Chlamydomonas (Chlorophyceae) Colony PCR. Protoplasma. 2008; 235: 107-110.

17. Kandasamy S, Khan W, Evans F, Critchley AT, Prithivira B. A product of ascophyllum nodosum enhances immune response of caenorhabditis elegans against Pseudomonas aeruginosa infection. Mar Drugs. 2012; 10: 84-105.

18. Wojciechowski K, Szadowski J. Spectrophotometric investigation and ppp- Mo calculations of some phenylazophthalimide dyes. Dyes Pigments. 1991; 16: 35-56.

19. Cho YJ, Park JP, Hwang HJ, Kim SW, Choi JW, Yun JW. Production of red pigment by submerged culture of Paecilomyces sinclairii. Lett Appl Microbiol. 2002; 35: 195-202.

20. Nowroozi J, Akhavan Sepahi A, Rashnonejad A. Pyocyanine biosynthetic genes in clinical and environmental isolates of Pseudomonas aeruginosa and detection of Pyocyanine’s antimicrobial effects with or without colloidal silver nanoparticles. cell J. 2011; 14: 7-18.

21. Khan F, Manivasagan P, Lee JW, Pham DTN, Oh J, Kim YM. Fucoidan-stabilized gold nanoparticle-mediated biofilm inhibition, attenuation of virulence and motility properties in Pseudomonas aeruginosa PAO1. Mar Drugs. 2019; 17: 208.

22. Malik K, Tokkas J, Goyal S. Microbial pigments: a review. Int J Microbial Res Technol. 2012; 1:361-365.

23. Kumar-Samanta A, Agaruval P. Application of natural dyes on textile. Indian J Fiber Text Res. 2009; 34: 384-399.

24. Jissa GK, Soorej MB, Beena PS, Chandrasekaran M. Marine bacteria as source of pigment for application as dye in textile industry. Internatl Conf Biodiv Conserv Mgt. 2008; 743-744.

25. Heydari N, Kazemipour M, Khaleghi M. The potentiality of UV absorption by isolated pigments from Penicillium and Aspergillus for using sunscreen compounds. JMW. 2014; 7: 18-25.

26. Venil CK, Velmurugan P, Dufossé L, Renuka Devi P, Veera Ravi A. Fungal pigments: potential coloring compounds for wide ranging applications in textile dyeing. J Fungi. 2020; 6(2):68.

27. Hamad MNF, Marrez DA, El-Sherbieny SMR. Toxicity evaluation and antimicrobial activity of purified pyocyanin from Pseudomonas aeruginosa. Biointerface Res Appl Chem.  2020; 15: 6974 – 6990.

28. Mehrabi M, Nazemi A, Nasrollahi A. Isolation and molecular identification of pigment producing microorganisms and acute toxicity of pigments. J Microbial Biotechnology. 2011; 3: 19-28.

29. Baker R, Tatum J. Novel anthraquinones from stationary cultures of Fusarium oxysporum. J Ferment Bioeng. 1998; 85: 359-361.

 

Type of Study: Research Article | Subject: Cellular and molecular
Received: 2021/02/22 | Accepted: 2021/09/14 | Published: 2021/09/14

Add your comments about this article : Your username or Email:
CAPTCHA

Rights and permissions
Creative Commons License This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

© 2024 CC BY-NC 4.0 | New Cellular and Molecular Biotechnology Journal

Designed & Developed by : Yektaweb