دوره 12، شماره 48 - ( 7-1401 )                   جلد 12 شماره 48 صفحات 98-87 | برگشت به فهرست نسخه ها

XML English Abstract Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Bonyadi P, Shojaee saadi B, Amini K. Evaluation of the effect of ionic liquids based on amino acid on the expression of pathogenic genes of Enterococcus faecalis strains isolated from the mouth. NCMBJ 2022; 12 (48) : 7
URL: http://ncmbjpiau.ir/article-1-1430-fa.html
بنیادی پریسا، شجاعی سعدی بهروز، امینی کیومرث. بررسی تأثیر مایعات یونی بر پایه اسید آمینه بر بیان ژن‌های بیماری‌زای سویه‌های انتروکوکوس فکالیس جدا شده از دهان. مجله تازه هاي بيوتكنولوژي سلولي و مولكولي. 1401; 12 (48) :87-98

URL: http://ncmbjpiau.ir/article-1-1430-fa.html


گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، واحد ساوه، دانشگاه آزاد اسلامی، ساوه، ایران ، dr_kumarss_amini@yahoo.com
متن کامل [PDF 471 kb]   (487 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (634 مشاهده)
متن کامل:   (315 مشاهده)
Evaluation of the effect of ionic liquids
based on amino acid on the expression of pathogenic
 genes of Enterococcus faecalis strains isolated from the mouth
Parisa Bonyadi 1, Behrooz Shojaee saadi1, Kumarss Amini2*
1. Department of Microbiology, Faculty of Basic Sciences, Arak Branch, Islamic Azad University, Arak, Iran
2. Department of Microbiology, Faculty of Basic Sciences, Saveh Branch, Islamic Azad University, Saveh, Iran
Abstract
Aim and Background: Enterococcus faecalis species are significant issue in severe nosocomial infections. In this study we aimed to investigate the effect of ionic liquids based on amino acids on pathogenic genes of this bacterium using Real time PCR.
Material and Methods: In this study, 100 samples of oral infections were taken from patients and Enterococcus faecalis strains were identified using biochemical tests. The presence and frequency of cyl, hyl and esp genes and their expression under the influence of ionic fluid were evaluated using real time-PCR.
Results: From the total samples taken, twelve Enterococcus faecalis bacteria were isolated and identified. The highest frequency of pathogenic genes was related to cyl gene which was present in 11 strains and the expression of target genes in the treated group under the influence of ionic fluid decreased compared to the control group (p <0.05). With decreasing ion-based amino acid concentration, the ability of bacteria to form biofilms increased (p <0.05).
Conclusion: Widespread antibiotic resistance is the most important concern about Enterococcus and cytolysin is a gelatinase enzyme and one of the most important invasive agents of Enterococcus faecalis. The results of this study provide a basis for promoting the use of new antibacterial agents, including ionic fluid, to prevent further pathogenicity of Enterococcus faecalis.
Keywords: Enterococcus faecalis, ionic fluid, cyl gene, Real time PCR , Iau Science.










Corresponding author:
Department of Microbiology, Faculty of Basic Sciences, Saveh Branch, Islamic Azad University, Saveh, Iran Email: Dr_kumarss_amini@yahoo.com


بررسی تأثیر مایعات یونی بر پایه اسید آمینه بر بیان ژن­های
 بیماری­زای سویه­های انتروکوکوس فکالیس جدا شده از دهان
پریسا بنیادی 1، بهروز شجاعی سعدی1، کیومرث امینی2*
1. گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، واحد اراک، دانشگاه آزاد اسلامی، اراک، ایران
2. گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، واحد ساوه، دانشگاه آزاد اسلامی، ساوه، ایران چکیده
سابقه و هدف: انتروکوکوس فکالیس عامل برخی عفونت­های بیمارستانی است. هدف از انجام این تحقیق بررسی ژن­های بیماری­زای این باکتری در نمونه­های بیماران و تأثیر مایعات یونی بر پایه اسید آمینه بر بیان آن­ها با روش Real time PCR بود.
مواد و روش­ها: در این مطالعه 100 نمونه از عفونت­های دهانی بیماران گرفته شد و با استفاده از آزمون­های بیوشیمیایی سویه­های انتروکوکوس فکالیس در آن مورد شناسایی قرار گرفت. حضور و فراوانی ژن­های cyl، hyl وesp و بیان آن­ها تحت تأثیر مایع یونی، با استفاده از روش Real time-PCR ارزیابی گردید.
یافته­ها: از مجموع کل نمونه­های اخذ شده 12 باکتری انتروکوکوس فکالیس جدا سازی گردیده و شناسایی شد. بیش­ترین فراوانی حضور ژن­های بیماری­زا مربوط به ژن cyl  بود که در 11 سویه حضور داشت و بیان ژن­های هدف در گروه تیمار شده تحت تأثیر مایع یونی نسبت­به گروه کنترل کاهش یافت (05/0 p<). با کاهش غلظت اسید آمینه بر پایه یون، توانایی تشکیل بیوفیلم توسط باکتری­ها افزایش یافت (05/0 p<).
نتیجه­گیری: مقاومت­های گسترده آنتی­بیوتیکی مهم­ترین عامل نگران کننده در مورد انتروکوکوس محسوب شده و سیتولایزین یک آنزیم ژلاتیناز و از جمله عوامل تهاجمی مهم باکتری انتروکوکوس فکالیس به­شمار می­رود. نتایج این تحقیق زمینه­ای برای ترویج استفاده از مواد ضد باکتریایی جدید از جمله مایع یونی را به­منظور جلوگیری از بیماری­زایی بیش­تر باکتری انتروکوکوس فکالیس فراهم می‌آورد.
واژگان کلیدی: انتروکوکوس فکالیس، مایع یونی، ژن cyl ، Real time PCR،Iau Science.

 
مقدمه
ـــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ
نویسنده مسئول:
گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، واحد ساوه، دانشگاه آزاد اسلامی، ساوه، ایران
پست الکترونیکی: Dr_kumarss_amini@yahoo.com
تاریخ دریافت: 16/08/1400
تاریخ پذیرش: 08/12/1400
انتروکوک­ها باکتری­های گرم مثبت بی­هوازی اختیاری هستند که فلور نرمال دستگاه گوارش انسان هستند و به­تازگی به­عنوان پاتوژن­های فرصت­طلب در سراسر جهان به­ویژه در عفونت­های بیمارستانی شناخته شده­اند. موفقیت این باکتری در ایجاد عفونت­های بیمارستانی به فاکتورهای بیماری­زایی آن بستگی دارد که در کلونیزاسیون میکروارگانیسم، مقاومت­به سیستم ایمنی، ایجاد رقابت با سایر میکروارگانیسم­ها و نیز ایجاد آسیب به­واسطه تولید فاکتورهای ترشحی و غیره دخالت دارند (1). انتروکوک­ها به­خصوص در شرایطی مثل تخریب پوست، سرکوب و یا نقص سیستم ایمنی، بستری شدن طولانی مدت در بیمارستان و حتی استفاده بی‌رویه از آنتی­بیوتیک­ها عفونت­های خطرناکی هم­چون باکتریمی، سپتی سمی، عفونت ادراری، مننژیت، عفونت زخم و ایجاد می­کنند (2).

عوامل بیماری­زایی هم­چون ژن­های همولیزین-سایتولیزین که در حدود 31 درصد از گونه­های انتروکوکوس فکالیس (Enterococcus Faecalis) دیده می­شوند، در قسمت­های جزایر پاتوژتیسته کدگذاری شده و سبب لیز گلبول­های قرمز و سفید می­گردند. چندین فاکتور ویرولانس در انتروکوکوس فکالیس توصیف شده که شامل ترکیب­های پروتئین سطحی انتروکوک (esp)، سیتولیزین cyl))، هیالورونیداز (hyl) و سایر پروتئین­های دارای فعالیت همولیتیک بوده‌اند (3). حدس زده می­شود که این فاکتورها به­صورت هم­افزایی ویرولانس باکتری را افزایش می­دهند که این امر منجر به صدمات بافتی و تهاجم عمقی‌تر باکتری و تشکیل بیوفیلم این باکتری می­گردد (4). پروتئین سطحی انتروکوکوس که توسط ژن esp رمزدهی می­شود موجب افزایش بیماری­زایی، کلونیزاسیون، پایداری در مجاری ادراری و تشکیل بیوفیلم می­شود (5). عفونت‌های انتروکوکی به­صورت بالقوه می‌تواند دو خطر را به­همراه خود داشته باشند، اول عفونت در اندوکارد یا مننژ اتفاق بیافتد و مسئله دوم مقاومت‌های گسترده آنتی­بیوتیکی این باکتری است که سبب شکست در درمان آنتی­بیوتیکی این عفونت‌ها می­شود (6). مقاومت روز افزون باکتری‌های مختلف به آنتی­بیوتیک‌های موجود از معضلات اصلی علم پزشکی محسوب می‌گردد که پیش­بینی شده است در دهه­های آینده به مهم­ترین معضل بشری تبدیل گردد. از سوی دیگر عوارض نامحدود ترکیب­های آنتی­بیوتیکی می­تواند منجر به بروز بیماری­های حتی خطرناک­تر از عفونت باکتریایی را فراهم آورد (7). لذا امروزه تحقیقات در مورد مواد آنتی باکتریال جدید و نیز روش‌های نوین شکست مقاومت‌های میکروبی از مهم­ترین زمینه­های مطالعه­های دانشمندان محسوب می­شود. مایعات یونی (IL) نمک­هایی با نقاط ذوب زیر 100 درجه سانتی­گراد هستند (بعضی از آن­ها در دمای اتاق مایع هستند) که از جفت شدن کاتیون­های آلی با آنیون‌های آلی و معدنی حاصل می­شوند و اثرات ضد میکروبی آن­ها نیز در مطالعه­های مختلف مشاهده شده است (8).
در بررسی پیشینه تحقیق مشخص گردید مایعات یونی در دهه گذشته به یک گروه حلال محبوب تبدیل شده­اند و کاربردهای بالقوه این مواد متنوع­تر شده است. تحقیقات در مورد مایعات یونی به­جای اینکه صرفاً به­عنوان جایگزینی برای محیط­های حلال آلی معمولی در نظر گرفته شود، به­دلایل افزایش سرعت، ویژگی و عملکرد به سمت انتخاب و طراحی عمدی این مواد پیش رفته است. طراحی مایعات یونی بر توسعه کاتیون‌ها و آنیون‌های جدید متمرکز است تا ویژگی‌های فیزیکی خاص مورد نیاز برای هر کاربرد را ایجاد کند. بنابراین، مواد در حال سنتز و مطالعه نیز به­طور فزاینده­ای پیچیده و متنوع می­شوند. مطالعه Pendelton و همکاران بر روی اثر گذاری این مایعات بر تولید بیوفیلم نشان داد که آن­ها اثرات قابل توجه ضد میکروبی را از خود نشان می­دهند (9). اثرات ضد میکروبی مایعات یونی بر پایه پیریدینیوم و ایمیدازولیوم نیز در مطالعه Cornellas دیده شد (10).  
این مطالعه بر آن بوده است تا با بررسی ژن­های بیماری­زای سویه­های جداسازی شده انتروکوکوس فکالیس از دهان و دندان بیماران، تأثیر مایعات یونی بر پایه اسید آمینه بر بیان آن­ها با روش Real time PCR بررسی نماید.
مواد و روش­ها
جداسازی سویه­ها
برای انجام این تحقیق به­طور کلی و با توجه­به فرمول نمونه­گیری جسی-مورگان، 100 نمونه از افراد مبتلا به عفونت­های دهان مراجعه کننده به مراکز دندان پزشکی سطح شهر تهران اخذ شده و در محیط کشت اختصاصی کشت داده شده است. تمامی نمونه‌ها جهت جداسازی باکتری انتروکوکوس و سویه انتروکوکوس فکالیس با تست­های استاندارد (12،11) شامل رنگ­آمیزی گرم، مورفولوژی کلنی و تست­های بیوشیمیایی هم­چون حساسیت­به باسیتراسین، حساسیت­به تری متوپریم سولفامتاکسازول (SXT)، تست همولیزین بر روی بلاد آگار، رشد بر روی محیط نمک 5/6 درصد، تست هیدرولیز ال- پیرولیدونیل - بتا- نفتیل آمید (PYR)، رشد در دمای C°62، رشد بر روی محیط بایل اسکولین مورد بررسی قرار گرفتند. جهت تأیید جداسازی انتروکوکوس فکالیس از آزمون‌های بیوشیمیایی تخمیر قندهای لاکتوز، سوربیتول، مانیتول، آرابینوز، سوربوز، استفاده گردید. از سویه انتروکوکوس فکالیس ATCC29212 به­عنوان کنترل مثبت استفاده شد.
بررسی مولکولی
به­منظور بررسی ژنومی، کلنی سویه­های انتروکوکوس فکالیس رشد کرده در محیط اختصاصی مورد استخراج DNA توسط کیت اختصاصی (سیناژن، ایران) قرار گرفتند. کمیت و کیفیت DNA استخراج شده توسط الکتروفورز در ژل آگاروز 2 درصد و اسپکتروفتومتری در نانودراپ (اپندورف، آلمان) تأیید می­گردید. پرایمرها با استفاده از نرم­افزار Gene Runner طراحی گردیدند. پس از استخراج DNA از انتروکوکوس­های ایزوله شده، واکنش زنجیره­ای پلی­مراز چندگانه (Multiplex PCR) با استفاده از پرایمرهای اختصاصی جدول 1 و با مراحل ذیل انجام گردید. آزمون با مقادیر مواد 10 میکرولیتر PCR Master Mix 2x (Amplicon)، 8/0 میکرولیتر از هر کدام یک از پرایمرها با غلظت 10 پیکومول بر میکرولیتر و 4 میکرولیتر از DNA الگو (150 نانوگرم) برای هر واکنش در مراحل دمایی، دناتوراسیون اولیه در دمای C°95 به­مدت 5 دقیقه، 35 چرخه شامل دناتوراسیونC° 95 به­مدت 30 ثانیه، مرحله اتصال پرایمر در دمایC° 55 به­مدت 30 ثانیه و مرحله تکثیر در دمای C°72 به­مدت 1 دقیقه، و پس از 35 چرخه مرحله تکثیر نهایی در دمای C°72 به­مدت 10 دقیقه انجام پذیرفت. در نهایت محصولات PCR در ژل توسط رنگ­آمیزی با غلظت­های پایین محلول رنگ اریتروژل و مشاهده مستقیم آن تحت تأثیر تابش نور ماورای بنفش تشخیص داده شده و عکس­برداری شدند.
 
جدول 1. مشخصات پرایمر های مورد استفاده در این مطالعه
اندازه (جفت باز) توالی پرایمر در جهت ´5 به ´3 عوامل حدت ژن
866 F: ACTCGGGGATTGATAGGC
R: GCTGCTAAAGCTGCGCTT
cytolysin cylA
242 F:AGATTTCATCTTTGATTCTTGG
R: AATTGATTCTTTAGCATCTGG
Enterococcal surface protein esp
678 F:ACAGAAGAGCTGCAGGAAATG
R:GACTGACGTCCAAGTTTCCAA
hyaluronidase hyl
 
پس از تعیین سویه­های دارای بیش­ترین تعداد فاکتورهای ویرولانس هدف این مطالعه، بررسی اثر مایع یونی بر بیان ژن­های ویرولانس در آن­ها صورت گرفت.
تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی مایع یونی
تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی (MIC) مایع یونی بر پایه اسید آمینه به روش میکروبراث دایلوشن صورت گرفت. جهت انجام آزمایش MIC ابتدا غلظت 4048 میکروگرم در میلی­لیتر از محلول استاندارد مایعات یونی [M1] [a2] (مرک، آلمان) در محلول DMSO آماده گردید.
سپس از محیط کشت مولر هینتون براث محتوی معادل نیم مک فارلند از باکتری مورد مطالعه، 100 میکرولیتر داخل 96 چاهک میکروپلیت ریخته  شد. سپس به اولین چاهک هر ردیف 100 میکرولیتر عصاره غلظت 4048 میکروگرم بر میلی­لیتر اضافه گردید و رقت سریالی تا چاهک دهم ادامه میافت و در نهایت پلیت در دمای 37 درجه برای مدت 24 ساعت انکوبه می­گردید. وجود یا عدم وجود کدورت نشان­دهنده رشد یا عدم رشد باکتری بود. غلظت موجود در یک چاهک قبل از چاهک دارای تغییر جهشی کدورت، به­عنوان MIC تعیین می­گردید.
تعیین میزان بیان ژن­های هدف در حضور مایع یونی
قبل از انجام واکنش زنجیره­ای پلی­مراز مقادیر 10 میکرولیتر از غلظت subMIC مایع یونی در حجم 20 میلی­لیتر از BHI  براث ریخته و معادل نیم مک فارلند به آن باکتری انتروکوکوس فکالیس دارای ژن­های هدف اضافه شد. پس از 15 ساعت نگهداری(Late lag phase)  که بهترین مرحله برای استخراج RNA است، استخراج RNA توسط کیت اختصاصی(QIAamp RNA Mini Kit, Germany) با توجه­به دستورالعمل آن انجام شد. با تأیید کیفیت RNA استخراج شده توسط دستگاه نانودراپ، سنتز cDNA با استفاده از آنزیم Avian Myeloblastosis Virus (AMV) Reverse Transcriptase با غلظتµl/unit  25 توسط کیت اختصاصی آن (Roche, Germany) انجام شد. واکنش زنجیره­ای پلی­مراز در حجم 20 میکرولیتر با استفاده از کیت اختصاصی (ترموفیشر، آمریکا) به­صورت زیر انجام شد: 10 میکرولیتر از Prime Qmaster mix (2x) دارای سایبرگرین، 5 میکرولیتر از diethylpyrocarbonate (DEPC) water، یک میکرولیتر از پرایمر فوروارد، یک میکرولیتر از پرایمر ریورس، یک میکرولیتر از Rox dye و 2 میکرولیتر از CDNA استفاده شد. تکثیر قطعه­های مورد نظر در دستگاه Corbet (Corbet, Australia) با برنامه دناتوراسیون اولیه 95 درجه سانتی­گراد برای 1 دقیقه، تکثیر شامل 95 درجه سانتی­گراد برای 30 ثانیه، 59 درجه سانتی­گراد برای مدت 40 ثانیه و 72 درجه سانتی­گراد برای 60 ثانیه در 35 چرخه انجام شد. از ژن خانگی 16srRNA به­عنوان کنترل داخلی تست استفاده شد. 
سنجش تولید بیوفیلم در انتروکوکوس فکالیس و تاثیر مایع یونی بر آن
به­منظـور سـنجش بیـوفیلم از انتروکوکوس فکـالیس رشـد یافتـه محـیط (TSB)broth  Trypticase soy استفاده شد. ابتدا 200 میکرولیتر از سوسپانسیون میکروبی برابر با نیم مک فارلند به گوده­های  میکروپلیت 96 خانه­ای اضافه و در دمای ºC ٣٧ به­مدت ٤٨ ساعت انکوبـه شـد. میکروپلیـت سـه مرحله توسط آب مقطر استریل شسته و بعد به­مـدت ١ سـاعت در دمای آزمایشگاه قرار گرفت تا خشک شود. بیوفیلم اتصال یافته بـا افزودن سافرانین ١/٠ درصد به­مدت ٢٠ دقیقه در دمـای آزمایـشگاه رنگ­آمیزی شد. سپس سه مرحله با آب مقطر استریل شسته شد تـا رنگ اضافی حـذف و بعـد از خـشک شـدن در دمـای آزمایـشگاه، جذب نوری بیوفیلم بر روی سـطح تـه گـوده پلیـت خـشک شـده در٤٩٠ OD با Reader ELISA قرائـت گردیـد. سپس میـانگین و انحـراف معیار محاسبه شد. از سویه انتروکوکوس فکالیس 29212  ATCC به­عنوان شاهد استفاده گردید. باکتری‌های مورد استفاده در محیط کشت TSB به­مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس انکوبه شدند، سپس با استفاده از رقت­سازی سریالی، استوک باکتری با غلظت cfu/ml 106تهیه شد. هر میکروپلیت برای دو باکتری مورد استفاده قرار گرفت و برای هر باکتری اسید آمینه بر پایه یونی با غلظت MIC- 4 تهیه شد. در هر ردیف، 100 میکرولیتر از محیط کشت TSB درون چاهک­ها ریخته شد، سپس در چاهک اول، 100 میکرولیتر از استوک نانو ذره با غلظت  MIC- 4 ریخته شد و رقت­سازی سری دوتایی انجام گرفت که در پایان غلظت اسید آمینه بر پایه یونی در چاهک­ها به­ترتیب برابر  MICMIC،  MIC2/1، MIC 4/1 و MIC 8/1 شد. این مراحل برای هر باکتری در 3 ردیف (3 تکرار) انجام شد. یک ردیف از میکروپلیت به­عنوان کنترل نانوذره در نظر گرفته شد که تنها محیط کشت و غلظت­های مختلف نانوذره در چاهک­ها ریخته شد. میکروپلیت به­مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس انکوبه شد. پس از طی این مدت، محیط کشت موجود در هر چاهک خالی شد، سپس چاهک­ها 3 بار با بافر فسفات استریل (PBS) شسته شدند. پس از آن میکروپلیت­ها به­صورت وارونه به­مدت 1 ساعت در دمای اتاق قرار گرفتند تا خشک شدند. 200 میکرولیتر از محلول کریستال ویوله 2/0 درصد به هر چاهک افزوده شد و میکروپلیت 15 دقیقه بدون حرکت در دمای 37 درجه سلسیوس قرار گرفت. پس از آن رنگ داخل چاهک­ها خارج شد و دوباره شستشو با بافر فسفات استریل انجام گرفت و میکروپلیت­ها در دمای اتاق خشک شدند.200 میکرولیتر از محلول 30 %اسید استیک به هر چاهک افزوده شد تا رنگ باندشده با باکتری­های تشکیل دهنده بیوفیلم استخراج شود. سپس جذب نوری این محلول در طول موج 595 نانومتر با میکروپلیت ریدر اندازه­گیری شد (13).
نتایج
نتایج جداسازی سویه­ها
در این مطالعه 60  ایزوله انتروکوکوس فکالیس از بیماران 14 تا 60 ساله با میانگین سنی 28 سال جداسازی شدند. بیش­ترین تعداد باکتری جدا شده مربوط به گروه سنی 59-30 سال بود. 43 ایزوله (67/71 %) انتروکوکوس فکالیس از مردان جداسازی شد. معیار تأیید جدایه‌های انتروکوکوس، ویژگی‌های مورفولوژیک و بیوشیمیایی این باکتری بود. پس از تشخیص، نمونه‌هایی که خصوصیت­های بیوشیمیایی آن‌ها شامل کوکسی­های گرم مثبت کاتالاز منفی، تخم­مرغی شکل و غیر هاگ­زا که به­صورت جداگانه در دمای 10 تا 45 درجه شد می­نمودند به­عنوان نمونه مثبت درج گردیدند و کلنی‌های مربوط ذخیره شدند.
نتایج آزمایش Multiplex PCR جهت شناسایی ژن­های بیماری­زا
شکل شماره 1 نتایج واکنش MultiplexPCR را در 12 ایزوله انتروکوکوس فکالیس جدا شده از عفونت­های دهانی را نشان می­دهد. در این تصاویر می­توان باندهای مربوط به ژن­های مختلف را در سویه­های جدا شده مشاهده کرد. از نمونه­های آزمایشگاهی برای شناسایی ژن­های کدکننده cyl، esp، hyl با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و هم­چنین سویه انتروکوکوس فکالیس تولید کننده ژن­های مورد نظر به­عنوان کنترل مثبت استفاده شد. داده­ها نشان داد که در 2 ایزوله ژن esp[M3] [a4]  (6/16 درصد)، در11 ایزوله ژن cyl و در 10 سویه، ژن hyl (3/83 درصد) ملاحظه گردید که بیش­ترین فراوانی (6/91 درصد) مربوط به ژن cyl بود.
تعیین غلظت MIC و Sub MIC مایع یونی
داده­ها نشان داد که غلظت 125 میکروگرم بر میلی­لیتر از مایع یونی قابلیت باکتریسیدال را دارد. هم­چنین غلظت µg/ml 225 به­عنوان غلظت subMIC تعیین گردید.
نتایج بررسی بیان ژن
بیان ژن­های هدف و ژن خانه دار 16srRNA  پس از تیمار سویه­ها انتروکوکوس فکالیس با غلظت subMIC بررسی گردید. بررسی منحنی ذوب واکنش­های Real time RT-PCR نشان داد که این نمودارها به­صورت تک باند و اختصاصی بوده اند. نتایج آزمون T-test نشان داد که بیان ژن­های هدف در هر 3 ژن کاهش یافته بود اما این کاهش در ژن Cyl به­صورت بسیار معنی­دار (05/0p<،  CI=95%) رخ داده بود و در ژن­های hyl و ESP پس از تیمار با مایع یونی میزان کاهش در سطح کم-تری رخ داده بود (05/0p<).
 


شکل 1.  نتیجه الکتروفورز محصولات MultiplexPCR در ژل آگاروز 2% .نمونه 1 تا 12، به­ترتیب از چپ به راست: DNA Ladder، +: کنترل مثبت، -: کنترل منفی.



شکل 3. نمودار تغییرهای Fold change ژن­های هدف در سویه­های انتروکوکوس فکالیس
 
نتایج تست تشکیل بیوفیلم
بر اساس نتایج جدول 2، 39 ایزوله (65 %) از 60 ایزوله توانایی تولید بیوفیلم را بصورت متوسط و شدید داشته اند و بیشترین میزان تولید بیوفیلم در گروه سنی 59-30 مشاهده شد. درصد تشکیل بیوفیلم توسط سویه های مورد مطالعه در حضور غلظتهای مختلف مایع یونی در نمودار 1 نشان داده شده است. همانطور که در نمودار مشاهده می شود، با کاهش غلظت اسید آمینه بر پایه یون، توانایی تشکیل بیوفیلم توسط باکتریها افزایش یافت. به عبارت دیگر اسید آمینه بر پایه یون می تواند در غلظت sub-MIC یا همان 1/2MIC نیز تولید بیوفیلم را کاهش دهد (05/0P<).
 

جدول 2: بررسی رابطه بین تشکیل بیوفیلم و متغیرهای دموگرافیک در جمعیت مطالعه
P-value
تشکیل بیوفیلم  (OD:490 nm) خصوصیات دموگرافیک
بیوفیلم ضعیف
تعداد (%)
بیوفیلم شدید و متوسط
تعداد (%)
P < 0.05 (10) 6 (18.34) 11 زن جنس
(25) 15 (46.66) 28 مرد
P < 0.05 (14.28)3 (12.82)5 سن (سال)  11-4 سال
(4.76)1 (5.12)2 17-12 سال
(14.28)3 (10.25)4 29-18 سال
(33.34)7 (43.58)17 59-30 سال
(33.34)7 (28.23)11 60 < سال
(100)21 (100) 39 کل



شکل 1. درصد سویه­های مولد بیوفیلم در غلظت­های مختلف مایع یونی
 
بحث
مطالعه هر چه بیش­تر مکانیسم بیماریزایی و پاتوژنز باکتری انتروکوکوس فکالیس که اغلب به­عنوان فلور نرمال در انسان مطرح است، می‌تواند راهکارهای جدید و مناسبی را جهت پیشگیری و درمان عفونت‌های شایع بیمارستانی حاصله از این ارگانیسم‌ها، حاصل آورد. مقاومت‌های گسترده آنتی‌بیوتیکی مهم‌ترین عامل نگران کننده در مورد انتروکوکوس محسوب می‌گردد و لذا شناخت عوامل مؤثر در این امر و بررسی اثر درمانی داروهای جدید جایگزین می‌تواند در راستای کاهش بار عفونت‌های ناشی از انتروکوکوس کمک کننده باشد(7،14).  یکی از مهم‌ترین این عوامل، ژن‌های حدت هستند که به­ضرورتدر این مطالعه مورد بررسی قرار گرفتند. Salehi و همکاران در سال 1391، در مطالعه تجربی تعداد 214 نمونه کلینیکی شامل 80 نمونه کانتر ادراری و 134 نمونه ادرار از بیماران جمع­آوری شد. نتایج آن­ها نشان داد که ژن esp در 83 درصد از نمونه­های ادرار و 97 درصد کانترهای ادراری و ژن esp در 100 نمونه­های ادرار و 90 درصد از کانترهای ادراری حضور داشتند. میزان مقاومت چند دارویی سویه­های انتروکوکی نسبت­به جنتامایسین و تتراسایکلین 1/78 درصد، سفالوسپورین 75 درصد، جنتامایسین و سفالوسپورین 3/59 درصد و جنتامایسین و استرپتومایسین 53 درصد برآورده شد (15). این نتایج می­تواند به­عنوان ابزار تشخیصی سریع به­منظور ارزیابی تولید فرومون و فراهم نمودن شرایط لازم جهت انتقال پلاسمیدها بین سویه­های کلینیکی و گسترش مقاومت آنتی­بیوتیکی باشد. در تحقیق حاضر به بررسی اثرات ضد میکروبی مایعات یونی بر روی ژن­های cyl، esp، hyl پرداخته شد که نتایج به­دست آمده از نظر فراوانی سویه­ها با تحقیق حاضر در یک راستا بود. کمری[M5] [a6]  و همکاران در سال 1395، 200 گونه انتروکوکوس جدا شده از گوشت را جهت بررسی شیوع ژن­های esp، cyla PCR مطالعه نمودند. هم­چنین این سویه­ها نظر تشکیل بیوفیلم با استفاده روش off-cut مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. انتروکوکوس جدا شده از گوشت در این پژوهش دارای شیوع بالایی از ژن esp بودند. اثبات شده است که این ژن در تشکیل بیوفیلم نقش دارد. هم­چنین این پژوهش نیز ثابت کرد که 68% از باکتری­های که بیوفیلم قوی تشکیل دادند دارای ژن esp بودند. توانایی تشکیل بیوفیلم می­تواند مقاومت باکتری به آنتی­بیوتیک­ها را افزایش دهد و خطر آلودگی گوشت­های مصرفی در ایجاد عفونت­های مقاوم افزایش می­یابد. شیوع ژن سیتولیزین گرچه کم­تر از esp  بود اما همین شیوع کم نیز می تواند سبب افزایش عفونت باکتری شود و با تحقیق حاضر مطابقت دارد. در مطالعه حاضر نیز بروز بیوفیلم قوی در سویه­های دارای ژن esp صورت می­گرفت.  کاظمینی و همکاران در سال 1394، در مطالعه­ای تعداد 200 نمونه مدفوع از مراکز درمانی کرمان جمع­آوری کردند و با کشت در محیط اختصاصی از جمله KF استرپتوکوک آگار و انجام آزمون­های بیوشیمیایی، تعداد 60 نمونه انتروکوک فکالیس شناسایی گردید. نتایج نشان داد که میزان آلودگی به باکتری انتروکوک فکالیس در زنان 52 درصد و در مردان 48 درصد است. هم­چنین شیوع ژن­های حدت در زنان بیش­تر از مردان بود که در راستای داده­های مطالعه ما بود. بیش­ترین فراوانی را ژن asal (6/80%) و کم­ترین فراوانی را در ژن (1/16%) clya  شناسایی شد، Hyl در هیچ­یک از نمونه-ها ردیابی نگردید. بر خلاف این پژوهش، در تحقیق حاضر بیش­ترین فراوانی مربوط به ژن cyl بود. Niyazi  و همکاران، مجموعه­ای از نمک­های برمید ایمیدازولیوم (NIM-Br 1a ، 1b و 1c) با طول­های مختلف زنجیره­های آلکیل سنتز شدند و فعالیت­های ضد باکتریایی آن­ها در شرایط آزمایشگاهی با اندازه­گیری حداقل غلظت مهاری (MIC) برای استافیلوکوکوس اورئوس، اشرشیاکلی، سودوموناس آئروژینوزا و انتروکوکوس فکالیس تعیین شد (16). علاوه­بر این، این مشتقات ایمیدازولیوم نیز در برابر بیوفیلم تولید شده توسط این سویه­های باکتریایی مورد بررسی قرار گرفت. همه ترکیب­ها در برابر باکتری­های گرم مثبت و گرم منفی مؤثر بودند و هم­چنین در تولید بیوفیلم S. aureus از سایر مؤثرتر بودند. در پژوهش حاضر مایعات یونی موجب کاهش بیان ژن­های ویرولانس  شد.  Izabelle Mو همکاران، فعالیت ضد میکروبی در مقابل گونه­های باکتریایی از نظر اهمیت بالینی در بهبود زخم­ها و محیط دهان مورد آزمایش قرار گرفت، نتایج نشان داد که مایعات یونی در مهار رشد باکتری­ها حتی در حداقل غلظت مهاری (MIC)  اثر مهمی دارد. هم­چنین نتایج نشان داد که مایعات یونی مبتنی­بر ایمیدازولیوم سنتز شده ممکن است یک استراتژی قوی برای برنامه­های کاربردی با استفاده از مواد غیر سمی دارای فعالیت ضد میکروبی باشد (17)  که با تحقیق حاضر هم­راستا بود.
 Alizadeh Sarvandaniو همکاران نشان دادند که از 60 ایزوله مورد بررسی 12 باکتری انتروکوک فکالیس واجد ژن esp بودند. نتایج MIC و سنجش بیان ژن نشان دادند که عصاره نانوکورکومین اثر ضدمیکروبی و مهاری بر روی تشکیل بیوفیلم و بیان ژن esp در ایزوله‌های باکتری انتروکوک فکالیس ندارد (18).  Trendolkar و همکاران بیان نمودند که پروتئین سطحی انتروکوک، به­عنوان یک فاکتور کلیدی برای توانایی انتروکوکوس فکالیس در تشکیل بیوفیلم، در یک وضعیت وابسته­به گلوکز است. در مطالعه Seno  و همکاران ظرفیت تشکیل بیوفیلم در ایزوله­های دارای پروتئین سطحی به­طور قابل توجهی بیش­تر از ایزوله­های فاقد پروتئین سطحی بود. در صورتی­که Trendolkar  و همکاران چنین اثر همگرایی را بین ژلاتیناز و پروتئین سطحی انتروکوک بر روی تشکیل بیوفیلم نشان ندادند. هم­چنین مشخص شده که پروتئین سطحی انتروکوک برای تشکیل بیوفیلم ضروری نبوده ولی وجود آن با تشکیل مقادیر بالایی از بیوفیلم همراه بوده است (19).  Taghavi Zenouz و همکاران در سال 2016 در یک مطالعه آزمایشگاهی، اثرات فتودینامیک تراپی در حضور متیلن بلو و هایپرسین بر دو میکروارگانیسم انتروکوکوس فکالیس و سودوموناس ائروژینوزا را بررسی کرده و به این نتیجه رسیدند که کاربرد هایپرسین با غلظت 100 میکروگرم بر میلی­لیتر با و بدون لیزر تراپی خاصیت باکتریوسیدال علیه دو باکتری انتروکوکوس فکالیس و سودوموناس ائروژینوزا دارد و با کاهش غلظت هایپرسین به مقادیر کم­تر از 100میکروگرم بر میلی­لیتر خاصیت آنتی باکتریال آن کاهش یافته، میکروارگانیسم­ها در محیط کشت رشد نمودند (20).
نتیجه­گیری
به­طور کلی نتایج این مطالعه نشان داد که سویه­های انتروکوکوس فکالیس از نظر ژنتیکی متنوع هستند و این موضوع نشان دهنده شیوع پلی کلونال سویه­ها در نمونه­های بالینی است. پروتئین­های ادهسین می­توانند نقش مهمی در ایجاد و انتقال مقاومت آنتی­بیوتیکی داشته باشند. تأثیر مثبت این مطالعه بر روی کاهش بیان ژن­های بیماری­زا نشان داد که درمان ترکیبی مایع یونی با داروهای ضد میکروبی رایج، اثرات ضد باکتری خوبی را علیه گونه­های انتروکوکوس نشان می­دهند و مایع یونی با حداقل دوز مصرفی می­تواند جایگزین مناسبی برای درمان تک دارویی عفونت­های انتروکوکی، همراه با جلوگیری از بروز اثرات نامناسب در مراحل درمان، صرفه­جویی در مصرف دارو و کاهش هزینه ها باشد.











































منابع
1. García-Solache M, Rice LB. The Enterococcus: a model of adaptability to its environment. Clinical microbiology reviews. 2019;32(2):e00058-18.
2. Hanchi H, Mottawea W, Sebei K, Hammami R. The genus Enterococcus: between probiotic potential and safety concerns—an update. Frontiers in microbiology. 2018;9:1791.
3. McBride SM, Fischetti VA, LeBlanc DJ, Moellering Jr RC, Gilmore MS. Genetic diversity among Enterococcus faecalis. PloS one. 2007;2(7):e582.
4. Pöntinen AK, Top J, Arredondo-Alonso S, Tonkin-Hill G, Freitas AR, Novais C, et al. Apparent nosocomial adaptation of Enterococcus faecalis predates the modern hospital era. Nature communications. 2021;12(1):1-13.
5. Keogh D, Lam LN, Doyle LE, Matysik A, Pavagadhi S, Umashankar S, et al. Extracellular electron transfer powers Enterococcus faecalis biofilm metabolism. MBio. 2018;9(2):e00626-17.
6. Rodrigues CT, De Andrade F, De Vasconcelos L, Midena R, Pereira T, Kuga M, et al. Antibacterial properties of silver nanoparticles as a root canal irrigant against Enterococcus faecalis biofilm and infected dentinal tubules. International Endodontic Journal. 2018;51(8):901-11.
7. Yelin I, Kishony R. Antibiotic resistance. Cell. 2018;172(5):1136-. e1.
8. Ferraz R, Silva D, Dias AR, Dias V, Santos MM, Pinheiro L, et al. Synthesis and antibacterial activity of ionic liquids and organic salts based on penicillin g and amoxicillin hydrolysate derivatives against resistant bacteria. Pharmaceutics. 2020;12(3):221.
9. Pendleton JN, Gilmore BF. The antimicrobial potential of ionic liquids: A source of chemical diversity for infection and biofilm control. International journal of antimicrobial agents. 2015;46(2):131-9.
10. Cornellas A, Perez L, Comelles F, Ribosa I, Manresa A, Garcia MT. Self-aggregation and antimicrobial activity of imidazolium and pyridinium based ionic liquids in aqueous solution. Journal of colloid and interface science. 2011;355(1):164-71.
11. Zoletti G, Siqueira Jr J, Santos K. Identification of Enterococcus faecalis in Root-filled Teeth With or Without Periradicular Lesions by Culture-dependent and—Independent Approaches. Journal of endodontics. 2006;32(8):722-6.
12. Santos R, Sau N, Certucha M, Almendáriz F, Monge A, Zepeda I, et al. Rapid detection of bacteria, Enterococcus faecalis, in airborne particles of Hermosillo, Sonora, México. Journal of Environmental Biology. 2019;40(4):619-25.
13. Partoazar A, Talaei N, Bahador A, Pourhajibagher M, Dehpour S, Sadati M, et al. Antibiofilm activity of natural zeolite supported NanoZnO: inhibition of Esp gene expression of Enterococcus faecalis. Nanomedicine. 2019;14(6):675-87.
14. Pazda M, Kumirska J, Stepnowski P, Mulkiewicz E. Antibiotic resistance genes identified in wastewater treatment plant systems–a review. Science of the Total Environment. 2019;697:134023.
15. Salehi M, Mosavari N, Hosseini F, Mobaraki M. The evaluation of esp and eep genes in Enterococcus strains isolated from clinical urine samples in Tehran. evaluation. 2012;15(62):39-48.
16. Duman AN, Ozturk I, Tunçel A, Ocakoglu K, Colak SG, Hoşgör-Limoncu M, et al. Synthesis of new water-soluble ionic liquids and their antibacterial profile against gram-positive and gram-negative bacteria. Heliyon. 2019;5(10):e02607.
17. Rodriguez LC, Palmer KL, Rodrigues DC. Dicationic Imidazolium-Based Ionic Liquids: A New Strategy for Non-Toxic and Antimicrobial Materials. 2014.
18. Alizadeh Sarvandani S, Amini K, Saffarian P. Evaluation of antimicrobial activity of Curcumin nanoparticles on the gene expression of the enterococcal surface protein, Esp, involved in biofilm formation of Enterococcus Faecalis. Razi Journal of Medical Sciences. 2019;26(9):39-46.
19. Ghasemi A, Moniri R, Khorshidi A, Musavi GA. The survey of virulence factors of Enterococcus faecalisisolated from urine samples. Iranian Journal of Medical Microbiology. 2009;2(3):53-8.
20. Zenuz AT, Eslami H, Kafil HS, Safari E, Ghanizadeh M, Mohammadi A. The application of antimicrobial photodynamic therapy on Pseudomonas aeuroginosa and Enterococcus fecalis using hypericin and methylene blue photosensitizers. Biomedical and Pharmacology Journal. 2016;9(2):443-50.

نوع مطالعه: مقاله پژوهشی | موضوع مقاله: میکروبیولوژی
دریافت: 1400/8/16 | پذیرش: 1400/12/8 | انتشار: 1401/8/1

ارسال نظر درباره این مقاله : نام کاربری یا پست الکترونیک شما:
CAPTCHA

ارسال پیام به نویسنده مسئول


بازنشر اطلاعات
Creative Commons License این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است.

کلیه حقوق این وب سایت متعلق به مجله تازه های بیوتکنولوژی سلولی - مولکولی می باشد.

طراحی و برنامه نویسی : یکتاوب افزار شرق

© 2024 CC BY-NC 4.0 | New Cellular and Molecular Biotechnology Journal

Designed & Developed by : Yektaweb