Optimization of light chain production of human enterokinase enzyme for use in the pharmaceutical industry
Mohammad Ebrahimifard¹, Mohammad Mahdi Forghanifard¹, Ahad Yamchi², Vajihe Zarrinpur²,

1. Department of Biology, Damghan Branch, Islamic Azad University, Damghan, Iran.
2. Department of Biotechnology, Golestan University, Gorgan, Iran.

Corresponding author: Mohammad Mahdi Forghanifard
Tel: 09127116027      Email: forghanifard@gmail.com
 
Abstract
Background and purpose: Enterokinase is a gastrointestinal enzyme that acts as a protease with a specific sequence. Due to the ability of enterokinase to enzymatically digest the recombinant protein at its specific site (including the four amino acids Aspartic acid and one amino acid lysine), which is targeted at the protein, as a very useful tool for purification and separation Target protein from the non-target part is used in the pharmaceutical, food and industrial industries.
Materials and Methods: Independent variables used included OD (0.6, 1.2 and 1.8) at 600 nm, IPTG concentration (0.2, 0.5 and 0.8 mM) and The type of bacterial strain was (ShuffleT7, BL21, NICO21). The response surface methodology (RSM) in the form of a central composite scheme was used to predict independent variables on the production of enterokinase enzyme.
Results: OD equal to 1.8 at 600 nm wavelength, IPTG concentration of 0.71 mM and type of ShuffleT7 bacterial strain, LB culture medium, 2.5 mM lactose concentration and 25 ° C induction temperature, for production Recombinant enterokinase was optimized.
Discussion and Conclusion: Drug proteins play an important role in modern molecular medicine therapies. Enterokinase gene expression in the bacterial system facilitates the purification of low concentrations, so large-scale, highly purified recombinant proteins can be produced and optimized in the bacterial system.
Keywords: Enterokinase, Promoter inductor, Purification, Cloning, Expression host. Iau Science .
 
 
 
بهینه سازی تولید زنجیره سبک آنزیم انتروکیناز انسانی به منظور استفاده در صنایع دارویی
محمد ابراهیمی فرد¹، محمد مهدی فرقانی فرد¹، احد یامچی²، وجیهه زرین پور¹

1. گروه زیست شناسی، واحد دامغان، دانشگاه آزاد اسلامی، دامغان، ایران.
2. دانشیار، گروه بیوتکنولوژی، دانشگاه علوم کشاوزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران.

چکیده
سابقه و هدف: انتروکیناز یک آنزیم دستگاه گوارش است که به عنوان یک پروتئاز با توالی خاص عمل می کند. به دلیل توانایی انتروکیناز برای هضم آنزیمی پروتئین نوترکیب در سایت اختصاصی آن (شامل چهار اسید آمینه آسپارتیک اسد و یک اسید آمینه لیزین می باشد) که در پروتئین هدف قرار داده می شود، به عنوان یک ابزار بسیار مفید برای امکان خالص سازی و جداسازی بخش پروتئین هدف از بخش غیر هدف در صنایع دارویی، غذایی و صنعتی مورد استفاده قرار می گیرد.
مواد و روش­ها: متغیرهای مستقل مورد استفاده شامل میزان OD (6/0، 2/1 و 8/1) در طول موج 600 نانومتر، غلظت IPTG  (2/0، 5/0 و 8/0 میلی مولار) و نوع سویه باکتری (ShuffleT7, BL21, NICO21) بود. از روش سطح پاسخ (RSM) در قالب طرح مرکب مرکزی برای پیش بینی متغیرهای مستقل بر میزان تولید آنزیم انتروکیناز استفاده شد.
یافته­ها: میزان OD برابر با 8/1 در طول موج 600 نانومتر، غلظت IPTG 71/0 میلی مولار و نوع سویه باکتری ShuffleT7، محیط کشت LB، غلظت لاکتوز 5/2 میلی مولار و دمای القاء 25 درجه سانتیگراد، برای تولید آنزیم انتروکیناز نوترکیب بهینه سازی شد.
بحث و نتیجه گیری: پروتئین­های دارویی نقش مهمی در درمان­های نوین پزشکی مولکولی دارند. بیان ژن انتروکیناز در سیستم باکتریایی، تسهیل در خالص سازی غلظت هایی که پایین است را فراهم می کند، بنابراین پروتئین های نوترکیب در مقیاس وسیع و با خلوص زیاد می توانند در سیستم باکتریایی تولید و بهینه سازی شوند.
کلمات کلیدی: انتروکیناز، القاگر پروموتر، خالص سازی، کلونینگ، میزبان بیانی. Iau Science .
 
 
 
 
 
مقدمه
انترو پپتیداز یکی از اعضای خانواده سرین پروتئازهای نوع II گذرنده از غشا است که در مرز دوازدهه قرار دارد. این آنزیم به عنوان یک زیموژن (پروانتروکیناز) که نیاز به فعال سازی توسط یک پروتئاز دیگر، تریپسین و یا احتمالا دودنئاز دارد، سنتز می شود (2,1). انتروکیناز به عنوان پروتئاز، به طور اختصاصی، پروپپتیدی اسیدی را از تریپسینوژن جدا کرده و آنرا به تریپسین فعال تبدیل می کند. در واقع انتروکیناز یک سرین پروتئاز متصل به غشا در دوازدهه است که تریپسینوژن را در جایگاه خاص X  LYS-ASP می­شکند و آنرا تبدیل به تریپسین فعال می کند (4,3). انتروکیناز از روده خوک، گاو، انسان و دیگر موجودات خالص شده است که به نظر می رسد در اکثر موارد، هترودایمری مرتبط با پیوند دی سولفیدی باشد. این آنزیم از یک زنجیره واحد پیش­ساز مشتق شده که شامل زنجیره سنگین 140-82 کیلو دالتونی و زنجیره سبک 62-28 کیلو دالتونی می باشد. هر دو زنجیره انتروکیناز حاوی 50-30 درصد کربوهیدرات است. انتروکیناز در ابتدا به نام انتروپپتیداز شناخته می شد، که برای اولین بار توسط پاولوف روسی در سال 1899 کشف شد (5). کونیتز در سال 1939 اولین بار انتروکیناز را به عنوان فعال کننده در دودنئوم پستانداران معرفی کرد که تبدیل آنزیمی تریپسینوژن به تریپسین با استفاده از انتروکیناز خالص خوکی را انجام می داد. انتروکیناز یک کیناز نیست، بنابراین در حال حاضر این آنزیم به نام انتروکیناز که منعکس کننده فعالیت پروتئولیتیک آن است، شناخته می شود )6). بعد از کشف انتروکیناز و شناسایی ویژگی های اختصاصی این آنزیم، در اکثر موارد استفاده تجاری انتروکیناز به منابع جدا شده از بافت دوازدهه حیواناتی مانند گاو و خوک محدود شده بود. اکنون استفاده از فناوری مهندسی پروتئین امکان تولید و بیان ناهمگن انتروکیناز در میزبان پروکاریوتی به شیوه نوترکیب را ایجاد کرده است (1). این آنزیم نقشی کلیدی در آبشار گوارشی دستگاه گوارش بازی می کند و آن شکستن پپتید فعال سازی انتهای آمینی تریپسینوژن و تولید تریپسین فعال است، در نتیجه پس از آن تریپسین منجر به فعال سازی دیگر زیموژن های پانکراسی (تریپسین، کیموتریپسین، کربوکسی پپتیداز و الاستاز) می شود (8,7).
در حال حاضر انتروکیناز، ترومبین^[1]، فاکتور TEV, ^[2]Xa^[3] و غیره پروتئازهایی هستند که برای برش پروتئین ترکیبی تولید شده در باکتری استفاده می شوند. در میان این پروتئازها، انتروکیناز به عنوان یک آنزیم ایده آل برای خالص سازی پروتئین هدف با شکست دنباله خاص از پروتئین ترکیبی به شمار می رود (11,10,9). به دلیل توانایی انتروکیناز برای شکافتن پروتئین نوترکیب در جایگاهی بسیار خاص در حضور مواد شوینده، دناتوره های مختلف، عمل در یک محدوده گسترده pH  و درجه حرارت، این آنزیم تبدیل به یک ابزار بسیار جذاب و مفید برای جداسازی نواحی پروتئین نوترکیب در بیوتکنولوژی شده است (12).
در سال های گذشته منبع انتروکیناز طبیعی، با توجه به هزینه های بالای استخراج و جداسازی آنزیم از حیوانات بوده، که در نهایت منجر به تولید پروتئین آلوده و محدود می گردید. بنابراین تلاش ها به منظور توسعه تولید انتروکیناز با استفاده از روش مهندسی ژنتیک معطوف شده است (13). به عنوان مثال، Kim و همکاران در سال 2021 بیان و خالص­سازی زنجیره سبک انتروکیناز انسانی محلول و فعال در باکتری اشریشیا کلای را مورد مطالعه قرار دادند (14). همچنین Aghaeepoor و همکاران در سال 2019 به بررسی بهینه­سازی تولید آنزیم استریپتوکیناز نوترکیب در سویه باکتری اشریشیا کلی با روش سطح پاسخ پرداختند (15). با این حال، تاکنون هیچ مطالعه ای در زمینه بهینه سازی شرایط بیان ژن انتروکیناز انجام نشده است، بنابراین هدف از این مطالعه کلونینگ و بیان ژن آنزیم انتروکیناز انسانی در سویه های گوناگون باکتری E.coli و دستیابی به بهترین سویه باکتری E.coli  مولد آنزیم انتروکیناز و شرایط جهت بیان ژن بوده است.
مواد و روش­ها
مواد
در این پژوهش از باکتری E.coli سویه­های BL21، NICo21، Shuffle T7 برای بیان پروتئین انتروکیناز استفاده شد. وکتور مورد استفاده در این مطالعه pET15b است. این وکتور دارای مارکر انتخابی آمپی سیلین و پروموتور  T7می­باشد.
روش­ها
استخراج داده های مربوط به ژن مورد نظر از بانک ژن و طراحی سازه ژنی
در این مطالعه از روی ژن اصلی انتروکیناز انسانی (EC 3.4.21.9)، سازه ژنی مورد نیاز طراحی گردید.
تهیه Competent Cell
مراحل تهیه کشت بر اساس روش Zurawa-Janicka و همکاران (2017) انجام شد. به طور خلاصه، پس از تهیه LB broth، به آن سلول میزبان BL21، Nico21 و Shuffle T7 اضافه شد (7).  برای استخراج پلاسمید از تک کلنی های کشت داده شده داخل پلیت با استفاده از لوپ برداشته شد و داخل محیط LB broth کشت داده و مقدار 5 میکرولیتر (mg/L 100) آنتی بیوتیک آمپی سلین نیز اضافه گردید.
استخراج پلاسمید نوترکیب
پلاسمید pET15b در مقیاس کوچک طبق دستورالعمل با کیت Thermo استخراج گردید.
انجام PCR برای تایید استخراج پلاسمید 
واکنش زنجیره پلی‌مراز (PCR) در حجم 25 میکرولیتر شامل 75/12 میکرولیتر آب­مقطر دو بار تقطیر، 5/2 میکرولیتر بافر واکنش x10، 5 /0 میکرولیتر مخلوط نوکلئوتیدی 10 میلی مولار، 5/0 میکرولیتر از هر دو آغازگر اختصاصی (10 پیکومول)، 5/0 میکرولیتر آنزیم تک پلی‌مراز (5 واحد/میکرولیتر) و 5 میکرولیتر DNA (50 نانو گرم) استفاده گردید. در این تحقیق از یک برنامه چرخه حرارتی به طور اختصاصی برای آغازگرها استفاده گردید. برای مرحله واسرشت اولیه دمای 95 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه اعمال شد. تکثیر در 35 سیکل شامل 94 درجه سانتی­گراد به مدت 1 دقیقه، دمای اتصال پرایمرها 56 درجه به مدت 1 دقیقه و دمای گسترش 72 درجه سانتی­گراد به مدت 50 ثانیه صورت گرفت. یک سیکل نهایی شامل مرحله گسترش نهایی 72 درجه سانتی­گراد به مدت 10 دقیقه بود. محصول PCR در ژل اگارز 5/1 درصد TBE و با ولتاژ ثابت 80 ولت در 80 دقیقه الکتروفورز شد (17,16).
 
 
هضم آنزیمی
به منظور درج قطعه نوترکیب در پلاسمید، ابتدا لازم است که هم قطعه نوترکیب و هم پلاسمید بوسیله آنزیم های محدودگر یکسان، بریده شوند. برای انجام هضم آنزیمی در ابتدا و انتهای قطعه نوترکیب، جایگاه برش برای آنزیم های BamHI و XhoI تعبیه شد. پلاسمید pET15b هم در جایگاه کلونینگ خود محل های برش برای این دو آنزیم را داشت. مواد موردنیاز برای انجام واکنش هضم آنزیمی شامل آب استریل (2 میکرولیتر)، بافر X10 (4 میکرولیتر)، آنزیم BamHI ،1 میکرولیتر (unit/µl10)، آنزیم XhoI ، 2/1 میکرولیتر (unit/µl10)، پلاسمید و قطعه ژن، 12 میکرولیتر (1 ماکروگرم) بود. به منظور اطمینان از انجام واکنش هضم آنزیمی، نمونه ها بر روی ژل آگارز 5/1 درصدTBE  برده شدند و از هر کدام از نمونه ها، یک کنترل نیز گذاشته شد (18).
بیان ژن انتروکیناز و انتخاب بهترین Host Cell
با استفاده از روش آماری RSM، بررسی وضعیت بیان در OD ها و غلظت های IPTG مختلف، بهترین Host Cell انتخاب گردید و ادامه کار با این Host Cell انجام شد. همچنین بهترین OD و مقدار IPTG نیز در این مرحله انتخاب گردید (جدول 1). برای این مرحله استوک Host Cell های مختلف از فریزر 80- درجه سانتیگراد بیرون آورده شد و پس از هم دما شدن، مقدار 200 میکرولیتر از هر کدام داخل یک لوله حاوی محیط LB broth ریخته و سپس مقدار 5 میکرولیتر (mg/L100) آنتی بیوتیک Amp به آن افزوده شد و بصورت overnight داخل شیکر انکوباتور 35 درجه سانتیگراد با دور rpm 180 قرار گرفت. سپس پیش کشت  به 100 میلی لیتر محیط LB دارای آنتی بیوتیک Amp اضافه شد و داخل شیکر انکوباتور 35 درجه سانتیگراد قرار گرفت. حال با توجه به OD و IPTG های نوشته شده در جدول 1 مرحله القاء انجام و پس از اضافه نمودن IPTG، 4 ساعت دیگر در شیکر انکوباتور با همان دما قرار داده شد. سپس محتویات کشت داده شده داخل یک فالکون استریل ریخته شد و در دور rpm 6500 و دمای 4 درجه سانتیگراد بمدت 14 دقیقه سانتریفیوژ گردید (20,19).
جدول 1- طراحی آزمایش مرحله اول با RSM

فاکتور			سطح
IPTG (mM)	Host Cell	OD
2/0	BL 21	6/0	1
5/0	Shuffle	2/1	2
8/0	Nico	8/1	3
RSM با 3 فاکتور
Factor 3: IPTG	Factor 2: Host Cell	Factor 1: OD	Run
2/0	BL 21 (1)	6/0	1
8/0	BL 21 (1)	6/0	2
5/0	BL 21 (1)	2/1	3
2/0	BL 21 (1)	8/1	4
8/0	BL 21 (1)	8/1	5
5/0	Shuffle (2)	6/0	6
2/0	Shuffle (2)	2/1	7
8/0	Shuffle (2)	2/1	8
5/0	Shuffle (2)	2/1	9
5/0	Shuffle (2)	2/1	10
5/0	Shuffle (2)	2/1	11
5/0	Shuffle (2)	8/1	12
2/0	Nico (3)	6/0	13
8/0	Nico (3)	6/0	14
5/0	Nico (3)	2/1	15
8/0	Nico (3)	8/1	16
2/0	Nico (3)	8/1	17

 
بهینه سازی بیان بیشتر پروتئین
بهینه سازی در مرحله القاء پروتئین
به منظور بهینه سازی و گرفتن بیان بالاتر در مرحله القاء، علاوه بر القاگر IPTG از القاگر لاکتوز در غلظت های mM 10-40 نیز استفاده شد.
بررسی انواع محیط کشت، ترکیب تیمارهای نوع القاگر و دمای القا
در این مرحله برای گرفتن بهترین بیان ممکن، شرایط مختلفی طبق روش آماری RSM و بر پایه نتایج مرحله اول، طراحی شد(جدول 3). به این صورت که باکتری با شرایط زیر وارد این مرحله شد:
Shuffle T7  ,  IPTG=0.71mM  ,  OD= 1.8
در تمام تیمارها مقدار IPTG, OD ثابت بود و فاکتورهای مشخص شده طبق جدول 2 متغیر بودند. محیط های کشت مورد نیاز این مرحله نیز تهیه گردید.(در محیط M9 گلوکز بعد از اتوکلاو و توسط فیلتر به محیط اضافه شد) دمای قبل از القاء نیز برای تمامی تیمارها 35 درجه سانتیگراد دور شیکر نیز rpm 180 بود و دماهای ذکر شده در جدول 2 مربوط به زمان القاء و پس از افزودن ماده القاگر می باشد. در پایان این مرحله مراحل استخراج، غلظت سنجی و الکتروفورز نیز انجام شد.
جدول 3 -طراحی آزمایش مرحله دوم با RSM

فاکتور			سطح
[4]Tm	Lactose (mM)	Medium
18	0	M9	1
25	5/2	LB	2
32	5	TB	3
Response Surface Methodology (RSM) with 3 Factor
Factor 3: Tm	Factor 2: Lactose	Factor 1: Medium	Run
18	5/2	LB	1
18	5	TB	2
32	5	TB	3
32	0	TB	4
25	5/2	M9	5
25	5/2	TB	6
25	0	LB	7
32	5/2	LB	8
32	0	M9	9
32	5	M9	10
25	5	LB	11
18	0	M9	12
25	5/2	LB	13
25	5/2	LB	14
25	5/2	LB	15
18	0	TB	16
18	5	M9	17

 
نتایج
سازه ژنی طراحی شده
سازه ژنی طراحی شده برای بهینه سازی متناسب با کدون های E.coli  و RBS  مناسب صورت پذیرفت.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
شکل 1- سازه ژنی طراحی شده  به همراه وکتور
استخراج پلاسمید نوترکیب
به منظور انجام واکنش الحاق ژن در ناقل، استخراج ناقل با استفاده از کیت استخراج ناقل شرکت Thermo   انجام شد و درستی انجام عملیات استخراج با بارگذاری 7 میکرولیتر از ناقل استخراج شده بر روی ژل آگارز 5/1 درصد بررسی و تأیید شد.

شکل 2- استخراج پلاسمید PET15b  هر سه چاهک مربوط به ناقل pET15b   استخراج شده است
هضم آنزیمی
پس از هضم آنزیمی ژن انتروکیناز، الکتروفورز انجام شد و نتیجه آن نشان داد که ژن انتروکیناز در وکتور بیانی کلون شده است.

شکل 3- الکتروفورز هضم آنزیمی. A. ژن انتروکیناز. B. ژن انتروکیناز کلون شده.
بهینه سازی فرآیند بیان ژن انتروکیناز و انتخاب بهترین Host Cell
تجزیه و تحلیل رگرسیونی و واریانس (ANOVA) مشخص نمود که مدل چند جمله­ای درجه­ی دوم به اندازه کافی بیان­گر پاسخ، با ضرایب مشخص می­باشد. 9653/0= ² R موید این است که مدل رگرسیون، واکنش را به­خوبی توضیح داده و مدل برازش شده توانسته 53/96 درصد از کل تغییرات در دامنه­ی مقادیر مورد مطالعه را توضیح دهد. ²R معیاری است برای این­که مشخص گردد چه میزان از تغییرات توسط مدل شرح داده شده است و در موارد ²R واقعی و ²R تعدیل شده^[5] که به ترتیب 9653/0 و 9340/0 به­دست آمدند، بیان‌گر توصیف مناسبی از پراکندگی داده­ها بوده­اند. همچنین مناسب بودن مدل با استفاده از آزمون فقدان برازش مورد بررسی قرار گرفت که در سطح 5 درصد معنی­دار نبود (05/0 <P). از آنجا که فرض آزمون عدم برازش در معادله مدل معنی­دار نبود؛ مدل بر اساس پارامترهای مختلف برازش گردید. برازش خوب به این معنی است که مدل ایجاد شده توانسته است که تغییرات در داده‌ها را به اندازه کافی توضیح دهد، لذا این مدل جهت پیش­بینی در دامنه تعیین شده برای متغیرهای مورد استفاده مناسب بود. نمودارهای سه­بعدی سطحی و کانتور^[6] برای متغیرها ترسیم شده است. هر شکل اثرات دو متغیر را روی پاسخ نمایش می­دهند، که در هر نمودار متغیر سوم در میزان بهینه­اش ثابت نگه­داشته شده است.
انتخاب بهترین OD
در این مرحله یکی از متغیرهای مستقل بیان آنزیم انتروکیناز در سه OD مختلف (6/0، 2/1 و 8/1) با طول موج 600 نانومتر بررسی شد که از روش سطح پاسخ RSM^[7] در قالب طرح مرکب مرکزی (CCD^[8]) برای پیش بینی متغییرهای مستقل بر میزان بیان آنزیم انتروکیناز استفاده و با توجه به شکل 1 (الف) می توان بیان کرد که تغییرات غلظت میکروارگانیسم بطور معنی داری بر میزان بیان آنزیم انتروکیناز تاثیر داشته است (05/0 <P). با توجه به شکل همان گونه که مشخص است، میزان بیان پروتئین انتروکیناز هم راستا با افزایش غلظت میکروارگانیسم روند افزایشی داشته و نمونه های حاوی غلظت 8/1 از میکروارگانیسم سبب بیان بیشترین میزان آنزیم انتروکیناز شده همچنین کمترین میزان بیان آنزیم انتروکیناز در نمونه های حاوی غلظت 6/0 میکروارگانیسم بوده است.
انتخاب بهترین غلظت القا کننده (IPTG)
در این مرحله یکی  دیگر از متغیرهای مستقل بیان آنزیم انتروکیناز در سه غلظت IPTG  مختلف (2/0، 5/0 و 8/0 میلی مولار) بررسی شد که از روش سطح پاسخ RSM در قالب طرح مرکب مرکزی (CCD) برای پیش بینی متغییر های مستقل بر میزان بیان آنزیم انتروکیناز استفاده و با توجه به شکل 1 (ب) بهترین غلظت IPTG برای بیان آنزیم انتروکیناز برابر با 71/0 میلی مولار می باشد که این ناحیه با توجه به سطح زیر منحنی پروتئین بدست آمد.
انتخاب بهترین سویه 
در این مرحله  متغیر مستقل سوم  بیان آنزیم انتروکیناز در سه سویه مختلف (ShuffleT7, BL21, NICO21) بررسی شد که از روش سطح پاسخ RSM در قالب طرح مرکب مرکزی (CCD) برای پیش بینی متغییر های مستقل بر میزان بیان آنزیم انتروکیناز استفاده و با توجه به شکل 1 (ج) بهترین سویه برای بیان آنزیم انتروکیناز ShuffleT7 می باشد که این سویه با توجه به سطح زیر منحنی پروتئین بدست آمد.
ارزیابی نقطه بهینه برای فرآیند بیان آنزیم انتروکیناز در مرحله اول بهینه سازی
پس از انجام آزمون های اولیه محدوده مناسبه متغیرهای مستقل تولید آنزیم انتروکیناز شامل ( میزان OD،  غلظت IPTG و نوع سویه باکتری) از روش سطح پاسخ (RSM) در قالب طرح مرکب مرکزی برای پیش بینی متغیرهای مستقل بر میزان تولید آنزیم انتروکیناز استفاده شد (شکل 2). در بهینه سازی تولید آنزیم انتروکیناز از 17 تیمار بر اساس طرح مرکب مرکزی، شامل 3 تکرار در نقطه مرکزی استفاده شد. متغیرهای مستقل مورد استفاده در مرحله اول شامل میزان OD (6/0، 2/1 و 8/1) در طول موج 600 نانومتر، غلظت IPTG  (2/0، 5/0 و 8/0 میلی مولار) و نوع سویه باکتری (ShuffleT7, BL21, NICO21). نقطه مرکزی دارای شرایط میزان OD برابر با 8/1 در طول موج 600 نانومتر، غلظت IPTG 71/0 میلی مولار و نوع سویه باکتری ShuffleT7 بود.
بهینه سازی مرحله دوم انتروکیناز 
انتخاب بهترین محیط کشت
فاکتور­های زیادی بر شرایط تخمیر موثر می­باشند که می­توانند بر رشد باکتری­ها اثر بگذارند، یکی از آنها نوع محیط کشت مورد استفاده می باشد. که ما در این مرحله از محیط کشت های LB^[9], TB^[10], M9^[11] که از روش سطح پاسخ RSM در قالب طرح مرکب مرکزی (CCD) برای پیش بینی متغییرهای مستقل بر میزان بیان آنزیم انتروکیناز استفاده نمودیم و با توجه به شکل 1 (د) می توان بیان کرد که تغییرات محیط کشت بطور معنی داری بر میزان بیان آنزیم انتروکیناز تاثیر داشته است.P<0.05 با توجه به شکل همان گونه که مشخص است، میزان بیان پروتئین انتروکیناز هم راستا با تغییر محیط کشت روند افزایشی داشته و نمونه های حاوی محیط کشت LB از سبب بیان بیشترین میزان آنزیم انتروکیناز شده همچنین کمترین میزان بیان آنزیم انتروکیناز در محیط کشت M9 بوده است.
 
انتخاب بهترین غلظت لاکتوز
در این مرحله یکی از متغیرهای مستقل بیان آنزیم انتروکیناز در سه غلظت لاکتوز مختلف (0، 5/2 و 5 میلی مولار) بررسی شد که از روش سطح پاسخ RSM در قالب طرح مرکب مرکزی (CCD) برای پیش بینی متغییرهای مستقل بر میزان بیان آنزیم انتروکیناز استفاده و با توجه به شکل 1(ه)  می توان بیان کرد که تغییرات غلظت لاکتوز بطور معنی داری بر میزان بیان آنزیم انتروکیناز تاثیر داشته است. 05/0 < P با توجه به شکل همان گونه که مشخص است، میزان بیان پروتئین انتروکیناز هم راستا با تغییر غلظت لاکتوز روند افزایشی کمی داشته و نمونه های حاوی غلظت لاکتوز 5/2 میلی مولار سبب بیان بیشترین میزان آنزیم انتروکیناز شده همچنین کمترین میزان بیان آنزیم انتروکیناز در نبود لاکتوز بوده است.
انتخاب بهترین دمای القاء
در این مرحله یکی از متغیرهای مستقل بیان آنزیم انتروکیناز در سه دمای مختلف (18، 25 و 32 سانتی گراد) بررسی شد که از روش سطح پاسخ RSM در قالب طرح مرکب مرکزی (CCD) برای پیش بینی متغییرهای مستقل بر میزان بیان آنزیم انتروکیناز استفاده و با توجه به شکل 1 (و) می توان بیان کرد که تغییرات دما بطور معنی داری بر میزان بیان آنزیم انتروکیناز تاثیر داشته است. 05/0 < P با توجه به شکل همان گونه که مشخص است، میزان بیان پروتئین انتروکیناز هم راستا با تغییر دما روند افزایشی داشته و نمونه ها در دمای 25 درجه سانتیگراد سبب بیان بیشترین میزان آنزیم انتروکیناز شده همچنین کمترین میزان بیان آنزیم انتروکیناز در دمای 18 درجه سانتیگراد بوده است.
ارزیابی نقطه بهینه برای فرآیند بیان آنزیم انتروکیناز در مرحله دوم بهینه سازی
پس از انجام آزمون های اولیه محدوده مناسبه متغیرهای مستقل تولید آنزیم انتروکیناز شامل ( نوع محیط کشت، غلظت لاکتوز و دمای القاء) از روش سطح پاسخ (RSM) در قالب طرح مرکب مرکزی برای پیش بینی متغیرهای مستقل بر میزان تولید آنزیم انتروکیناز استفاده شد. در بهینه سازی تولید آنزیم انتروکیناز از 17 تیمار بر اساس طرح مرکب مرکزی، شامل 3 تکرار در نقطه مرکزی استفاده شد. متغیرهای مستقل مورد استفاده در مرحله اول شامل نوع محیط کشت (LB, TB, M9)، غلظت لاکتوز (0، 5/2 و 5 میلی مولار) و دمای القاء (18، 25 و 32 سانتی گراد). نقطه مرکزی دارای شرایط محیط کشت LB، غلظت لاکتوز 5/2 میلی مولار و دمای القاء 25 درجه سانتیگراد بود. همچنین پاسخ اندازه گیری شده شامل غلظت آنزیم انتروکیناز با استفاده از سطح زیر منحنی پیک نمودار کروماتوگرام کروماتوگرافی مایع با فشار بالا بود. در روش سطح پاسخ برای هر پاسخی مدلی تعریف می شود که اثر مستقل و متقابل متغیر ها را بر روی هر پاسخ بررسی می کند. تجزیه واریانس برای ارزیابی اثرات معنی دار متغیرهای فرآیند بر روی پاسخ انجام شد. با انجام تجزیه و تحلیل ضریب همبستگی (R²) چند متغیره، مدل های مختلف بر اساس R² واقعی و R² پیش بینی شده مقایسه شد. در نهایت تیمار بهینه با توجه به نتایج پیش بینی می شود(شکل 3).

شکل 4- نمودار تاثیرفاکتورهای مختلف بیان آنزیم نسبت به سطح زیر منحنی پروتئین
(الف) دانسیته نوری (OD)
(ب) غلظت IPTG
(ج) سویه
(د) محیط کشت
(ه) غلظت لاکتوز
(و) دما

شکل 5- بهینه سازی بیان آنزیم انتروکیناز با تاثیرات OD برابر 8/1، غلظت IPTG برابر 71/0 میلی مولار، سویه باکتری ShuffleT7
 

شکل 6- بهینه سازی تیمارهای مرحله دوم (سطح سه بعدی). با توجه به Area های بدست آمده بهترین غلظت لاکتوز و بهترین محیط کشت انتخاب گردید.
بحث
پزشکی به سمت دوران جدیدی در حرکت است که در آن روش هایی برای مدیریت بیماری ها در سطح اطلاعات ژنتیکی و پروتئینی که تماما بیولوژی می باشند، ایجاد شده است و پروتئین­های دارویی نقش مهمی در درمان­های نوین پزشکی مولکولی دارند. در حال حاضر، پروتئین های انسانی نوترکیب، بخش قابل توجهی از داروهای بیوتکنولوژی تایید شده توسط FDA را تشکیل می دهند. اگرچه دستکاری در سیستم­های بیان باکتریایی نسبتاً آسان و ساده است، اما ایجاد روش­های موثر برای بهبود حلالیت پروتئین­ها، مانعی است که باید برطرف شود (21). در سال 2017 درویشی به تکثیر، کلون سازی و بررسی بیان زنجیره سبک انتروکیناز گاوی در اشریشیا کلای پرداخت. اما در این مطالعه ما به کلونینگ و بهینه سازی شرایط بیان ژن، در سویه های گوناگون باکتری Escherichia coli پرداختیم. از دلایل انتخاب این سیستم بیانی پروکاریوتی، قیمت پایین، بهره وری و سرعت بالاست که مناسب ترین گزینه برای بیان پروتئین های نوترکیب می باشد و در این بین اشریشیا کلای بهترین گزینه است (23,22). نقطه حائز اهمیت در این مطالعه این است که پروتئین زنجیره سبک انتروکیناز انسانی دارای فعالیت بیولوژیکی بالاتری نسبت به مشابه گاوی است (24). در سال 2015 نصیبی مطالعه ای بر روی تولید پروتئین نوترکیب HFBI  در باکتری  E.coli سویه­ی Shuffle T7 انجام داد و به این نتیجه دست یافت که کاهش دما (از 37 به 22 درجه سانتیگراد)، میزان بیان پروتئین نوترکیب را افزایش می دهد، ایشان دلیل افزایش بیان پروتئین نوترکیب را کاهش نرخ رشد باکتری و افزایش انرژی باکتری برای تولید بیشتر می دانست (25) در این پژوهش بهینه سازی دما با استفاده از روش RSM صورت گرفت که دمای 25 درجه سانتیگراد بهترین دما برای بالاترین مقدار تولید پروتئین نوترکیب بدست آمد. کاهش دمای القاء منجر به کاهش میزان سنتز پروتئین خواهد شد، چون سنتز پروتئین با سرعت بالا می تواند برای تا شدن و حلالیت پروتئین مضر باشد (26). عبدالله زاده و همکاران در سال 2020 در مطالعه­ای برای بهینه سازی تولید آنزیم پکتینار از روش آماری RSM استفاده نمودند و آنها به این نتیجه رسیدند که استفاده از این روش، برای بهینه سازی تولید آنزیم موثر بوده و تولید آنزیم را تقریبا 12 برابر افزایش داد (27)، ما نیز در این مطالعه از روش RSM که رابطه بین یک یا چند متغیر پاسخ را با چندین متغیر مستقل (مورد مطالعه) تعیین می‌کند (28)، استفاده کردیم که منجر به صرف جویی در وقت و افزایش کارایی بیان شد. (این روش 84 نمونه را به 17 نمونه مورد بررسی کاهش داد). پکیام و همکاران در سال 2020 در مطاله­ای به بهینه سازی تولید پروتئین نوترکیب در اشریشیا کلای با استفاده از رویکردهای محاسباتی و تجربی پرداختند. آنها معتقد بودند که کاربرد همه روش­های بهینه سازی به ترتیب برای همه فاکتورهای حیاتی در سطح بیان و فرآیند می تواند منجر به بازده بالای پروتئین نوترکیب شود. اولین گام در تولید پروتئین­های نوترکیب در اشریشیا کلای، استفاده از ابزارهای محاسباتی مناسب برای تولید مدلی با استفاده از ویژگی های تاثیرگذار است که بهینه سازی عوامل مبتنی بر ژن و پروتئین را تسهیل می کند. گام بعدی استفاده از بهینه سازی یک فاکتور در یک زمان و انتخاب براساس دانش روز می باشد، که امکان انتخاب بهینه میزبان، ناقل و محیط را فراهم می کند. گام بعدی بهینه سازی چند متغیره آماری هست که که برای شناسایی سطوح بهینه تمام فاکتورهای فرآیندی انتخابی ارجح خواهد بود. در طولانی مدت می توان با تجربیات بدست آمده از گام­های دوم و سوم، ابزارهای محاسباتی مناسب طراحی و اجرا نمود. چنین سیستم پیشرفته­ای قادر به پیش بینی عملکرد پروتئین در اشریشیا کلای نوترکیب بوده و آزمایشات آزمایشگاهی را بیشتر کاهش خواهد داد (29). هوی و همکاران در سال 2021 طبق مطالعاتی که بر روی پیش بینی بیان پروتئین های ترشحی در باکتری های گرم منفی انجام دادند به این نتیجه دست یافتند که تشکیل پیوند های دی سولفیدی در E.coli در موقعیت های غیر سیتوپلاسمی یعنی پری پلاسم انجام می شود. در پری پلاسم E.coli دی سولفیدی اکسیدوردوکتازها و ایزومرازها قرار گرفته اند که تشکیل پیوند های دی سولفیدی را کاتالیز می کند و تجمع پروتئین های دارای تاخوردگی صحیح را امکان پذیر می کند، از این رو ایجاد پروتئین محلول، پری پلاسم را به قسمت ایده آلی برای بیان پروتئین های درمانی خاص تبدیل نموده است (30). اما با توجه به اینکه بیان پروتئین در پری پلاسم E.coli بسیار اکسید کننده است، ما برای کسب پروتئین دارای پیوند دی سولفیدی مطلوب (انتروکیناز) و در نتیجه تاخوردگی صحیح، استفاده از بیان سیتوپلاسمی را در سویه Shuffle T7 انتخاب نمودیم. سویه Shuffle T7 به علت تشکیل پیوندهای دی سولفیدی و اختصاصی بودن RNA پلیمراز فاژ T7 بکار رفته در سیستم بیانی pET برای توالی پروموتری مربوط به خود، برای بیان سیتوپلاسمی پروتئین نوترکیب در اشرشیا کلی حائز اهمیت می باشد، از دیگر مزایای این سویه، اصلاح پیوندهای نادرست اکسید شده است (34-31) مولایی و ابطحی در سال 2011 به بررسی بهینه سازی تولید آنزیم استرپتوکیناز نوترکیب در باکتری اشریشیا کلای پرداختند. آن ها دریافتند تغییر شرایط محیط کشت می تواند باعث افزایش میزان تولید پروتئین های نوترکیب در باکتری میزبان گردد. وجود برخی عوامل غذایی از جمله گلوکز به تنهایی باعث افزایش محصول نمی شود بلکه امکان دارد کاهش محصول را نیز در پی داشته باشد (35) در این مطالعه میزان بیان پروتئین انتروکیناز هم راستا با تغییر محیط کشت (M9, TB, LB) روند افزایشی داشته و نمونه های حاوی محیط کشت LB  و M9 به ترتیب بیشترین و کمترین میزان بیان آنزیم انتروکیناز را نشان داد، در ادامه در مرحله القاء علاوه بر IPTG از لاکتوز هم استفاده نمودیم که پایین ترین غلظت لاکتوز (5/2 میلی مولار) سبب بیشترین بیان پروتئین نوترکیب گردید. بابکان و همکاران در سال 2019 با بررسی بهینه­سازی بیان و تخلیص آنزیم گلوتات اندوپپتیداز از باکتری هالوترمولرانت، به صورت پری پلاسمی در غلظت های 4/0، 1 و 2 میلی مولار القاگر، بهینه سازی نمودند، آن ها دریافتند که بهترین نتیجه برای بیان پری پلاسمیک پروتئین نوترکیب با غلظت 2 میلی مولار IPTG می باشد (36). از جمله متغیرهای این پژوهش، بیان آنزیم انتروکیناز در سه غلظت IPTG  (2/0، 5/0 و 8/0 میلی مولار) به روش سطح پاسخ در قالب طرح مرکب مرکزی بود که غلظت 71/0 میلی مولار IPTG بهترین غلظت برای بیان آنزیم انتروکیناز انتخاب گردید. از آنجا که تولید انبوه انتروکیناز محلول در باکتری ها هنوز یک چالش حل نشده است، ما در این پژوهش فقط بیان آنزیم انتروکیناز انسانی را بهینه سازی نمودیم، برای تولید انبوه این آنزیم باید بهینه سازی تخلیص آن نیز مورد بررسی قرار گیرد. هم اکنون آنزیم انتروکیناز تجاری در هر دو میزبان باکتریایی (شرکت Gen Script) و یوکاریوتی (شرکت Sigma) تولید و به بازار عرضه می شود.  
نتیجه­گیری
در این تحقیق کلونینگ و بهینه سازی شرایط بیان ژن آنزیم انتروکیناز انسانی در سویه های  SHuffle T7،BL21  وNICO21   باکتری Escherichia coli صورت گرفت، که بیان بهتر ژن آنزیم انتروکیناز در سویه SHuffle T7 با نقطه مرکزی دارای شرایط میزان OD برابر با 8/1 در طول موج 600 نانومتر و غلظت IPTG 71/0 میلی مولار همراه بود. ارزیابی نقطه بهینه برای فرآیند بیان آنزیم انتروکیناز در مرحله دوم بهینه سازی با نقطه مرکزی دارای شرایط محیط کشت LB، غلظت لاکتوز 5/2 میلی مولار و دمای القاء 25 درجه سانتیگراد صورت پذیرفت. بیان ژن انتروکیناز در سیستم باکتریایی، سبب تسهیل در خالص سازی پروتئین با غلظت های پایین، می شود، بنابراین با استفاده از نتایج چنین تحقیقاتی، پروتئین های نوترکیب در مقیاس وسیع و با خلوص زیاد (تولید صنعتی)، تولید خواهند شد که می تواند منجر به خودکفایی در صنعت داروسازی نوترکیب شود.
فهرست منابع

1. Sugama, J., Y. Katayama, Y. Moritoh and M. Watanabe., 2021, Enteropeptidase inhibition improves kidney function in a rat model of diabetic kidney disease, Diabetes, Obesity and Metabolism 23(1): 86-96.
2. Wang, J.-H., M.-Z. Tang, X.-T. Yu, C.-M. Xu, H.-M. Yang and J.-B. Tang., 2019, Site-specific, covalent immobilization of an engineered enterokinase onto magnetic nanoparticles through transglutaminase-catalyzed bioconjugation, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 177: 506-511.
3. Simeonov, P., R. Berger-Hoffmann, R. Hoffmann, N. Sträter and T. Zuchner., 2011, Surface supercharged human enteropeptidase light chain shows improved solubility and refolding yield, Protein Engineering, Design & Selection, 24(3): 261-268.
4. Zhang, X.-h., S.-h. Tan and T.-m. Li., 2005, Characterization of Enterokinase and Its Research Advances in Genetic Engineering, pharmaceutical biotechnology-beijing- 12(5): 347.
5. Qin, X.,2016, Inactivation of pancreatic digestive proteases by deconjugated bilirubin from the liver: A critical mechanism for gut protection, J Gastroenterol Pancreatol Liver Disord, 3(4): 1-2.
6. Pepeliaev, S., J. Krahulec, Z. Černý, J. Jílková, M. Tlustá and J. Dostálová.,2011, High level expression of human enteropeptidase light chain in Pichia pastoris, Journal of biotechnology 15 (1):67-75.
7. Zurawa-Janicka, D., T. Wenta, M. Jarzab, J. Skorko-Glonek, P. Glaza, A. Gieldon, J. Ciarkowski and B. Lipinska., 2017, Structural insights into the activation mechanisms of human HtrA serine proteases,  Archives of biochemistry and biophysics, 621: 6-23.
8. Krahulec, J. and M. Šafránek .,2021. Impact of media components from different suppliers on enterokinase productivity in Pichia pastoris, BMC biotechnology, 21(1): 1-9.
9. Nemestóthy, N., G. Megyeri, P. Bakonyi, P. Lakatos, L. Koók, M. Polakovic, L. Gubicza and K. Bélafi-Bakó.,2017,Enzyme kinetics approach to assess biocatalyst inhibition and deactivation caused by [bmim][Cl] ionic liquid during cellulose hydrolysis, Bioresource technology, 229: 190-195.
10. Melicherová, K., J. Krahulec, M. Šafránek, V. Lišková, D. Hopková, D. Széliová and J. Turňa., 2017, Optimization of the fermentation and downstream processes for human enterokinase production in Pichia pastoris, Applied microbiology and biotechnology, 101(5): 1927-1934.
11. Marangoni, A. G. 2003, Enzyme kinetics: a modern approach, John Wiley & Sons.
12. Kaur, J., A. Kumar and J. Kaur., 2018. Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: Roadblocks and reinforcements, International Journal of Biological Macromolecules, 106: 803-822.
13. Mikhailova, A. G. and L. D. Rumsh.,2000, Enteropeptidase, Applied biochemistry and biotechnology, 88(1): 159-174.
14. Kim, Y. S., H.-J. Lee, S.-h. Park, Y.-c. Kim and J. Ahn., 2021, Expression and purification of soluble and active human enterokinase light chain in Escherichia coli,  Biotechnology Reports, 30: e00626.
15. Aghaeepoor, M., A. Akbarzadeh, F. Kobarfard, A. A. Shabani, E. Dehnavi, S. J. Aval and M. R. A. Eidgahi,2019. Optimization and high level production of recombinant synthetic Streptokinase in E. coli using Response Surface Methodology. Iranian journal of pharmaceutical research: IJPR, 18(2): 961.
16. Tariq, F., M. A. U. Khan, S. Shahzad, W. B. Chaudhary, A. Arif and G. Gharib., 2018, Production of Remedial Proteins through Genetically Modified Bacteria, Advancements in Life Sciences 5(2): 37-45.
17. Zoued, A., Y. R. Brunet, E. Durand, M.-S. Aschtgen, L. Logger, B. Douzi, L. Journet, C. Cambillau and E. Cascales., 2014, Architecture and assembly of the Type VI secretion system, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research 1843(8): 1664-1673.
18. Lim, J., Destabilizing single chain major histocompatibility complex class I protein for repurposed enterokinase proteolysis,2020, Scientific reports, 10(1): 1-10.
19. Odonkor, S. T. and K. K. Addo.,2018, Prevalence of multidrug-resistant Escherichia coli isolated from drinking water source, International journal of microbiology ,45 (2): 2018-2021.
20. Melicherová, K., J. Krahulec, M. Šafránek, V. Lišková, D. Hopková, D. Széliová and J. Turňa., 2017, Optimization of the fermentation and downstream processes for human enterokinase production in Pichia pastoris, Applied microbiology and biotechnology, 101(5): 1927-1934.
21. Kwon, J., Cho, H., Kim, S., Ryu, Y. and Lee, J.J., 2021. A combination strategy of solubility enhancers for effective production of soluble and bioactive human enterokinase. Journal of Biotechnology, 340, pp.57-63.
22. Burnett, M.J. and Burnett, A.C., 2020. Therapeutic recombinant protein production in plants: Challenges and opportunities. Plants, People, Planet, 2(2), pp.121-132.
23. Bagno, F.F., Godói, L.C., Figueiredo, M.M., Sérgio, S.A.R., Moraes, T.D.F.S., Salazar, N.D.C., Kim, Y.C., Reyes-Sandoval, A. and da Fonseca, F.G., 2020. Chikungunya E2 Protein Produced in E. coli and HEK293-T Cells—Comparison of Their Performances in ELISA. Viruses, 12(9), p.939.
24. Eliot T. Smith and David A. Johnson: Human enteropeptidase light chain: Bioengineering of recombinants and kinetic investigations of structure and function. Protein Science 2013, 22(5):577–585.
25. Nasibi Nahid, Turkzadeh Mahani Massoud, Mortazavi Morteza. Production of recombinant HFBI protein in E.coli. Thesis from Kerman University. 2015.
26. Ahmad I, Nawaz N, Darwesh NM, ur Rahman S, Mustafa MZ, Khan SB, Patching SG. Overcoming challenges for amplified expression of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein expression and purification. 2018 Apr 1;144:12-8.
27. Abdollahzadeh, R., Pazhang, M., Najavand, S., Fallahzadeh-Mamaghani, V. and Amani-Ghadim, A.R., 2020. Screening of pectinase-producing bacteria from farmlands and optimization of enzyme production from selected strain by RSM. Folia microbiologica, pp.1-15.
28. Hussain, S., Khan, H., Gul, S., Steter, J.R. and Motheo, A.J., 2021. Modeling of photolytic degradation of sulfamethoxazole using boosted regression tree (BRT), artificial neural network (ANN) and response surface methodology (RSM); energy consumption and intermediates study. Chemosphere, 276, p.130151.
29. Packiam KA, Ramanan RN, Ooi CW, Krishnaswamy L, Tey BT. Stepwise optimization of recombinant protein production in Escherichia coli utilizing computational and experimental approaches. Applied microbiology and biotechnology. 2020 Apr;104(8):3253-66.
30. Hui, X., Chen, Z., Zhang, J., Lu, M., Cai, X., Deng, Y., Hu, Y. and Wang, Y., 2021. Computational prediction of secreted proteins in gram-negative bacteria. Computational and Structural Biotechnology Journal.
31. Shoae M, Safarpour H, Khorashadizadeh M. Recombinant Production of Bovine Enteropeptidase Light Chain in SHuffle® T7 Express and Optimization of Induction Parameters. The Protein Journal. 2021 Sep 29:1-0.
32. De Marco A. Strategies for successful recombinant expression of disulfide bond-dependent proteins in Escherichia coli. Microbial cell factories. 2009 Dec;8(1):1-8.
33. Dawn, A. and Deep, S., 2021. An improved strategy of TGFβ3 expression in Escherichia coli: Exploiting folding modulators for a switch from misfolded to folded form. International Journal of Biological Macromolecules, 167, pp.787-795.
34. Ahmadzadeh, M., Farshdari, F., Nematollahi, L., Behdani, M. and Mohit, E., 2020. Anti-HER2 scFv expression in Escherichia coli SHuffle® T7 express cells: effects on solubility and biological activity. Molecular biotechnology, 62(1), pp.18-30.
35. Molaee N and Abtahi H. (2011). Improvement  of recombinant streptokinase production in E.coli. Arak Medical University Journal. 14. 7 . 97 – 103.
36. Babakan., S., Safari., A., Moniri., R., Hamzeh miveh roud., M and Dastmalchi., S. (2019). Optimization of expression and purification of glutathione endopeptidase enzyme from halotermolar bacterium. Cellular and Molecular innovation in biotechnology Journal 344. 9. 23-30.