تکنیک واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) برای تشخیص سریع سیتومگالوویروس در سقط های ایدیوپاتیک

پریا آقایی¹، اکرم سادات طباطبایی بفرویی^*2، محمد حسن شاه حسینی³

¹دانش آموخته گروه زیست شناسی، واحد تهران شرق، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

²استادیار گروه زیست شناسی، واحد تهران شرق، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

³استاد گروه میکروبیولوژی، واحد شهرقدس، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

نویسنده مسئول: اکرم سادات طباطبایی بفرویی

آدرس پست الکترونیک: akram_tabatabaee@yahoo.com

آدرس پستی: تهران – سه راه افسریه-بزرگراه امام رضا(ع)-کیلومتر18- شهرک قیام دشت-انتهای خیابان شهید باهنر- دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شرق، صندوق پستی: 18735-136 ، کدپستی: 33584011، تلفن: 33594950، نمابر: 1866113118

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

چکیده

سابقه و هدف: سایتومگالوویروس (CMV) انسانی از اعضای خانواده ی هرپس ویروس ها است که از علل اصلی عفونت ویروسی داخل رحمی  می باشد. هدف این مطالعه  بررسی تشخیص CMV در زنان با سقط های ایدیوپاتیک توسط تکنیک واکنش زنجیره پلیمراز (PCR)  می باشد.

مواد و روش ها: 50 نمونه خون از زنان مبتلا به سقط های ایدیوپاتیک جمع آوری و توسط کیت تجاری   DNG-Plus ژنوم  ویروسی استخراج گردید. تکنیک PCR با استفاده از ژنوم سویه استاندارد CMV بهینه سازی شد و سپس تعیین حد تشخیص (LOD) و اختصاصیت آزمایش با استفاده از ژنوم های غیر از CMV مورد ارزیابی قرار گرفت. تکنیک PCR بهینه شده بر روی نمونه ها و کنترل های مثبت و منفی انجام شد و نتایج توسط روش الکتروفورز ژل مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

یافته ها: با استفاده از تکنیک PCR بهینه شده، محصول 257 جفت بازی در ژل آگاروز مشاهده گردید. در آزمون تعیین اختصاصیت، نتایج مثبت فقط با ژنوم CMV  حاصل شد و همینطور حد تشخیص 100کپی در هر واکنش بدست آمد. در نهایت، از 50 نمونه ی مورد بررسی، دو نمونه از نظر وجود CMV مثبت گردید.

نتیجه گیری: سقط های ایدیوپاتیک، سقط هایی هستند که ظاهرا عامل مشخص ندارند. اما مشخصا عوامل متعددی از جمله عوامل عفونی که شناسایی آنها مشکل می باشد می توانند موجب سقط جنین گردند. یکی از این عوامل می تواند CMV باشد و نتایج این مطالعه مشخص کرد که بهتراست در این نوع سقط ها توسط آزمون های مولکولی مانند PCR به سرعت، CMV را جستجو و شناسایی نمود.

 

واژه‌های کلیدی: سایتومگالوویروس، سقط ایدیوپاتیک، واکنش زنجیره پلیمراز، Iau Science

 

 

 

 

 

 

 

Polymerase Chain Reaction (PCR) technique for rapid detection of Cytomegalovirus in idiopathic abortions

Paria Aghaei¹, Akram Sadat Tabatabaee Bafroee^1*, Mohammad Hasan Shahhosseini²

¹Department of Biology, East Tehran Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran

²Department of Microbiology, Shahr-e-Qods Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran

 

Abstract

Aim and Background Cytomegalovirus (CMV) is a member of the herpesviridae family, which is a major cause of intrauterine viral infection. The aim of this study was to evaluate the diagnosis of CMV in women with idiopathic abortions by the polymerase chain reaction (PCR) technique.

Materials and Methods 50 blood samples of women with idiopathic abortions were collected and viral genome was extracted using commercial kit DNG-Plus. The PCR technique was optimized using the standard CMV strain genome and then the Limit of Detection (LOD) and specificity of the test was evaluated using genomes other than CMV. The optimized PCR technique was performed on the samples and positive and negative controls and the results were analyzed by gel electrophoresis.

Results using optimized PCR technique, 257bp product were observed in agarose gel. In the specificity test, positive results were obtained only with the CMV genome and a detection limit of 100 copies per reaction was obtained. Finally, out of 50 samples, two samples were positive for CMV.

Conclusion Idiopathic abortions are abortions that do not seem to have a specific cause. But obviously many factors including infectious agents that can cause abortion are difficult to identify them. One of these factors could be CMV and the results of this study showed that it is best to search and identify CMV in this type of abortion by molecular tests such as PCR, quickly.

Keywords Cytomegalovirus, Idiopathic abortion, polymerase chain reaction , Iau Science

مقدمه

خروج جنین از رحم قبل از رسیدن به مرحله تولد (در انسانها ، معمولاً در حدود هفته بیستم بارداری) را سقط جنین می گویند. چنانچه دلیل سقط جنین ایجاد شده مشخص نباشد، آن را سقط ایدیوپاتیک یا خود به خودی می‌نامند. بنابراین، سقط با منشاء نامعلوم با نام سقط ایدیوپاتیک شناسایی می‌شود. یکی از علل سقط، عفونت‌ها می‌باشند که در سقط خود به خودی اهمیت بیش‌تری پیدا می‌کنند. ویروس سایتومگالوویروس انسانی مهم‏ترین عامل و ایجاد کننده طیف وسیعی از عفونت‌های ویروسی شایع در بزرگسالان است که این عفونت‌ها معمولاً بدون علامت بالینی یا همراه با علایم غیراختصاصی هستند. با این وجود هنگامی که زن باردار برای اولین بار با ویروس مواجه می‌شود، علاوه بر احتمال فعال شدن دوباره ویروس، خطر انتقال ویروس به جنین نیز در موارد نادر وجود دارد. قبلاً حضور آنتی‏بادی ویروس سایتومگالوویروس انسانی را در موارد ناهنجاری‌های جنینی و سقط‌های جنینی گزارش کرده‌اند و مطالعات متعددی در مورد ارتباط این ویروس با موارد اختلالات و سقط در مناطق مختلف ایران و جهان صورت گرفته است (1). ویروس سایتومگال انسانی (HCMV) مثل تمام هرپس ویروس‌ها در میزبان عفونت مجدد ایجاد می‌کند.  تنها سلول‌هایی که کاملا  برای همانند سازی HCMV در موجود زنده مجاز‌ند، فیبروبلاست‌ها هستند (2). HCMV یک ویروس پارادوکس است که می‌تواند به صورت بالقوه کشنده یا در تمام طول عمر همراه خاموش فرد باشد. نحوه‌ی عملکرد این ویروس بصورتی است که، تعداد بسیار کمی از ویروس‌ها از سلول آلوده رها  می‌شوند و انتقال عفونت عمدتا از طریق سلول به سلول انجام می‌گیرد. ممکن است چندین هفته وقت لازم باشد تا یک لایه سلول به طور کامل آلوده شود. سایتومگالوویروس‌ها، اثر سیتوپاتیک ایجاد می‌کنند. همچنین، علاوه بر اینکلوژن‌های داخل هسته‌ای در این بیماری اینکلوژن‌های داخل سیتوپلاسمی اطراف هسته‌ای نیز ایجاد می‌شوند. سلول‌های چند هسته‌ای نیز مشاهده شده و تعداد زیادی از سلول‌های آلوده شده به شدت بزرگ می‌شوند (3).

به دلیل شیوع بالای عفونت‌های مادرزادی با این ویروس، یک مشکل بزرگ بهداشت جهانی به شمار می‌رود. عفونت غیر آشکار در طی دوران کودکی و بلوغ شایع است. عفونت‌های شدید سایتومگالوویروس غالباً در بالغین دچار اختلال ایمنی، دیده می‌شود، مثل افراد با ضعف ایمنی، افراد دارای پیوند عضو به خصوص پیوند کلیه، افراد مبتلا به ایدز و همچنین افراد مبتلا به تومور‌های بدخیم که شیمی درمانی شده‌اند. شایع‌ترین علت عفونت مادرزادی، انتقال ویروس فعال شده در رحم می‌باشد، همچنین در جریان عبور جنین از کانال زایمان نیز عفونت ایجاد می‌گردد. عفونت مادرزادی ممکن است باعث مرگ جنین در رحم شود (4). سایتومگالوویروس یکی از مهم‌ترین عوامل سقط جنین مربوط به عفونت و طبیعتا پیامد‌های ناخوشایند بعدی آن بویژه در نوزادان است که سبب ایجاد ناهنجاری‌های اجتماعی-فردی در خانواده می‌گردد. در ایران نقش ویروس سایتومگالوویروس در سقط جنین مادران از نظر اپیدمیولوژیکی، به طور جامع ارزیابی نشده است (5). لذا با توجه به اهمیت ویروس و تشخیص عفونت، هدف مطالعه حاضر، شناخت مولکولی CMV به روش PCR که دارای حساسیت بسیار بالا و در عین حال روشی آسان و سریع‌تر نسبت به کشت است، می‌باشد که برای تشخیص و پیشگیری از عفونت‌های سایتومگالوویروس در نمونه بارداری‌هایی که منجر به سقط‌های خود بخودی شده‌اند، انجام گرفت.

مواد و روش ها

50 نمونه سرم خون از زنان با سقط های ایدیوپاتیک با دلیل نا مشخص و 50 نمونه از زنان سالم که همگی دارای رنج سنی 21 تا 43 سال بودند، از بیمارستانی در شهر تهران در سال 2019تحت شرایط استریل جمع آوری شد و نمونه ها جهت استخراج ژنوم ویروسی به آزمایشگاه تخصصی ویروس شناسی کیوان منتقل شدند. سایر آزمایشات در محل اصلی انجام تحقیق، آزمایشگاه تحقیقاتی ایرانیان ژن فناور،  انجام شد.

استخراج DNA از نمونه با تیتر مشخص ویروس  CMV

به منظور بهینه نمودن تکنیک PCR جهت تشخیص ویروس CMV در نمونه بیماران، ابتدا سرم با تیتر مشخص CMVاز آزمایشگاه ویروس شناسی کیوان تهیه شد. لازم به ذکر است، تعداد پارتیکل‌های ویروس در سرم با استفاده از دستگاه COBAS PCR و کیت COBAS Amplicon kit (شرکت هیتاچی ژاپن) در آزمایشگاه مذکور مشخص گردید. DNA های ویروسی با استفاده از کیت DNG-Plus سیناکلون (cat: DN8117C) استخراج گردید و کیفیت و کمیت آنها با استفاده از دستگاه نانودراپ بررسی شد. نمونه های DNA با نسبت 260/280 نانومتر، بالای 7/1 و نسبت 260/230 نانومتر، به مقدار 2/2 دارای خلوص قابل قبول از نظر کیفیت DNA  می باشند.

مراحل بهینه سازی واکنش زنجیره پلیمراز (PCR) جهت تشخیص سایتومگالوویروس

تکنیک PCR

جدول1، توالی نوکلئوتیدی پرایمرهای مورد استفاده جهت تکثیر ناحیه 257 جفت بازی ژن هدف، گلیکوپروتئین  B، جهت بهینه سازی فرایند تشخیص سایتومگالوویروس در نمونه های سرم را نمایش می دهد.

به منظور بهینه کردن پروفایل حرارتی،  میانگین دماهای ذوب پرایمرها (C °65) محاسبه شد. سپس مخلوط PCR در بازه ی دمایی C ° 5  ± 65 ، با استفاده از دستگاه ترموسایکلر تحت تکنیک PCR به روش گرادیانت قرار گرفتند تا بهترین دما برای اتصال پرایمرها بدست آید.

                 جدول1- توالی نوکلئوتیدی پرایمر های مورد استفاده در تشخیص سایتومگالوویروس

 

 

 

تعیین اختصاصیت تکنیک PCR جهت تشخیص سیتومگالوویروس

جهت تعیین اختصاصیت (آزمون ویژگی) پرایمرهای سیتومگالوویروس و تکنیک PCR بهینه شده، ژنوم های غیر از سایتومگالوویروس (از جمله، ژنوم انسان، موش، ویروس هرپس سیمپلکس I و II، آدنوویروس و ژنوم ساکارومیسس سروزیه ) از بانک ژنتیکی آزمایشگاه تحقیقاتی ایرانیان ژن فناور تهیه شد و با روش PCR بررسی شدند. همچنین سکانس پرایمرها در سایت NCBI وارد شد و پرایمرها را از لحاظ همولوژی مورد ارزیابی قرار گرفتند.

تعیین حد LOD آزمون PCR بهینه شده

به جهت تعیین حساسیت تست PCR بهینه شده، ابتدا غلظت یا جذب نوری ((OD کنترل مثبت با استفاده از دستگاه نانودراپ اندازه گیری شد و سپس با استفاده از فرمول (Genome copy number)GCN، تعداد DNA در هر میکرولیتر از سوسپانسیون DNA اولیه محاسبه گردید. به منظور شناسایی حداقل میزان DNA ویروس، به روش کخ، رقت های متوالی از سوسپانسیون DNA  سیتومگالوویروس تهیه گردید. در نهایت تکنیک PCR برای هریک از رقتها همراه با کنترل مثبت و کنترل منفی انجام شد (6).

نتایج

نتایج بهینه سازی  تکنیک PCR جهت تشخیص سایتومگالوویروس

پس از بهینه سازی واکنشگرهای PCR، مقادیر و غلظت های بهینه شده مطابق جدول 2 بدست آمد. همچنین جدول 4 برنامه زمانی و دمایی تکنیک PCR را پس از بهینه سازی پروفایل حرارتی نمایش می دهد. تصویر محصول PCR با سایز bp 257 روی ژل آگارز5/1% در شکل 1نشان داده شده است.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

             جدول2- غلظت ها و حجم های بهینه شده واکنشگر های PCR در حجم نهایی 25 میکرولیتر

 

شکل1- تکنیک PCR بهینه شده برای تشخیص سایتومگالوویروس

M: سایز مارکر kb (bioflux) 1

C+: کنترل مثبت (bp 257)

C^-: کنترل منفی

نتایج تعیین اختصاصیت پرایمرها و تکنیک PCR جهت تشخیص سایتومگالوویروس

شکل 2، اختصاصیت تکنیک PCR بهینه سازی شده در این تحقیق جهت تشخیص سایتومگالوویروس را نمایش می دهد. با توجه به شکل، پرایمرها کاملا اختصاصی فقط با DNA سیتومگالوویروس باند شده اند و با DNA غیر سایتومگالوویروس هیچ باند یا محصول ناخواسته ای ایجاد نکرده اند که نشان دهنده اختصاصیت بسیار  بالای پرایمرها میباشد.

شکل 2- تکنیک PCR جهت تشخیص اختصاصی سایتومگالوویروس

M: سایز مارکر kb (bioflux) 1، C+: کنترل مثبت محصولPCR  با اندازه محصول 257 جفت بازی مربوط به سایتومگالوویروس، 1: DNA  ی انسان، 2: DNA  ی موش3: DNA  ی هرپس سیمپلکس ویروس 4، 1:DNA  ی هرپس سیمپلکس ویروس 2، 5: DNA  ی ویروس هپاتیت B ،6: DNA  ی آدنوویروس،7 : DNA  ی ساکارومایسیس سرویزیه،  C-: کنترل منفی

 

 

 

 

 

 

حد تشخیص(LOD) تکنیک  PCR بهینه شده

شکل 3 نتایج این بررسی را نشان می دهد. حساسیت این تست  copy/Reaction 100 بدست آمد.

 

 

شکل 3. حد تشخیص(LOD) تکنیک  PCR بهینه شده

M: سایز مارکر kb (bioflux) 1، C+: کنترل مثبت محصولPCR  با اندازه محصول 257 جفت بازی مربوط به سایتومگالوویروس، 1: copy/reaction000،000،10، 2: copy/ 1000،000، 3: copy/reaction100،000، 4: copy/reaction10،000، 5: copy/reaction1000 ،6: copy/reaction100،7: copy/reaction10،  C-: کنترل منفی

 

نتایج تکنیک PCR بهینه شده بر روی نمونه ها

از میان 50 نمونه ی سرم خون ، 2 نمونه (5/4 %) آلوده به سایتومگالوویروس بود. شکل4(A-C) نتایج تکنیک PCR  بهینه شده را روی نمونه ها جهت تشخیص سایتومکالوویروس را نمایش می دهد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل4(A-C)- نتایج تکنیک PCR بهینه شده بر روی نمونه ها جهت تشخیص سایتومگالوویروس

M: سایز مارکر (bioflux) 100 bp ، C+: کنترل مثبت محصولPCR با اندازه محصول 257 جفت بازی مربوط به سایتومگالوویروس، C-: کنترل منفی ، 19: نمونه مثبت از نظر سایتومگالوویروس، و 18-1، 50-20: نمونه های منفی از نظر سایتومگالوویروس

 

 

 

بحث

سایتومگالوویروس انسانی ) HCMV  (عضو اصلی زیر خانواده -β هرپس ویروس مربوط به خانواده هرپس ویریده، جنس سایتومگالوویروس، گونه هرپس ویروس انسانی 5  ) HHV-5 ( است. سایتومگالوویروس (CMV) به عنوان یک ویروس فرصت طلب، می تواند در افراد با سیستم ایمنی پایین و یا سیستم ایمنی سرکوب شده، تاثیرات منفی بگذارد (7، 8). علی‌رغم وجود داروهای ضد ویروسی مناسب (گان سیکلوویر، فوسکارنت( عفونتCMV  هنوز به عنوان یک عامل مهم ایجاد بیماری و مرگ و میر در بیماران پیوندی است، که اغلب علت آن تاخیر در تشخیص و درمان مناسب می‌باشد (9). همچنین مطالعات مختلفی نشان داده است که، عفونت CMV یکی از دلایل عمده‌ی سقط جنین، نا هنجاری‌های مادرزادی و کاهش شنوایی در نوزادان می‌باشد که طبیعتا منجر به زیان اقتصادی و روانی در جامعه و خانواده‌ی فرد بیمار می‌شود (10). بطور کلی، CMV  پس از یک دوره عفونت فعال در شکل نهفته باقی می‌ماند. این ویروس می‌تواند در یک فرصت مناسب مانند حاملگی، مجدداً فعال شود و جنین نیز از طریق مادر، عفونت CMV را دریافت کند. عفونت اولیه CMV در 4 تا 7 درصد از کل موارد بارداری اتفاق می افتد و انتقال عفونت از مادر به جنین در حدود ۷۵-۲۴ % است که به طور میانگین ۴۰ % در نظر گرفته می‌شود، اما فقط ۱۰ % از این موارد، علایم عفونت CMV مادرزادی را هنگام تولد از خود  نشان می‌دهند و ۹۰ % بقیه موارد بدون علایم بالینی هستند (11).  البته نکته قابل توجه در این است که از این ۹۰ %، در حدود ۱۵-۵ درصد، علایم و عوارض بلند مدت نشان می‌دهند (12). با توجه به عواقب وخیم عفونت CMV دوران بارداری برای جنین، غربالگری آن در دوران بارداری می‌تواند مفید باشد. چون با غربالگری می‌توان عفونت احتمالی جنین را جست و جو نمود و در صورت مثبت بودن، با خاتمه انتخابی حاملگی، جلوی تولد یک نوزاد دارای نقایص جسمانی و روانی را گرفت. بنابراین، در مطالعه ی حاضر به ارزیابی مولکولی CMV  در سقط های ایدیوپاتیک به روش PCR پرداخته شد و این نتیجه حاصل شد که با تکنیک هایی مانند PCR به سرعت می توان، CMV را شناسایی کرد و با توجه به مطالعات پیشین نیز این موضوع تایید می شود.

بر اساس نتایج مطالعات مختلف، روش‌های متداول شناسایی عفونت CMV شامل: کشت ویروس  )استاندارد طلایی تشخیص(، تست سنجش آنتی بادی  )الایزا ( و روش مولکولی واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) می‌باشد. کشت  CMV باید 21 روز نگهداری شود تا نتیجه مثبت ایجاد شود. این زمان برای بیماران پیوندی مناسب نیست. تکنیک‌های آزمایشگاهی که بر اساس تشخیص سرولوژیکی هستند،  )تشکیل آنتی بادی خاص) برای بیماران ضعیف به لحاظ سیستم ایمنی نامناسب هستند، زیرا این افراد نمی توانند آنتی بادی نرمال بسازند. بنابراین آزمایش‌هایی که برای تشخیص CMV در بیماران ضعیف به لحاظ سیستم ایمنی استفاده می‌شود، باید در جهت تشخیص مستقیم ویروس، آنتی‌ژن‌های پروتئینی یا اسیدنوکلئیک باشد تا عفونت مشخص شود (13). تشخیص به روش آمنیوسنتز گرچه ویژگی بالایی دارد ولی یک روش تهاجمی است که خودش خطر سقط را افزایش می‌دهد. امروزه در کشورهای پیشرفته، به خصوص در بیماران دارای نقص سیستم ایمنی، روش تشخیصی PCR در حال جایگزینی با روش کشت سلول خونی می باشد. روش PCR حساسیت بالایی جهت شناسایی ویروس در نمونه‌‌های ادرار، خون، پلاسما و مایع مغز- نخاعی دارد که انجام کشت، به دلیل زمان‌بر بودن مقدور نیست. PCR محتوای نمونه‌های کلینیکی را در یک روش غیر وابسته به کشت و در مدت زمان کوتاه و همچنین با دقت، اختصاصیت و حساسیت بسیار بالا بررسی می‌کند که به میزان قابل توجهی باعث افزایش کیفیت اطلاعات بدست آمده از این نمونه‌ها می‌شود (13). همچنین، مطالعات انجام شده حاکی از آن است که، نتایج مثبت با روش PCR بخوبی وجود ویروس سایتومگال را نشان می‌دهد (9). در پژوهش حاضر نیز برای شناسایی DNA ویروس CMV از تکنیک PCR استفاده شد و مشخص شد که تکنیکPCR بهینه شده از اختصاصیت بسیار بالایی برخوردار است، به طوری که فقط با DNA ویروس CMV واکنش نشان داد و با DNA سایر موجودات زنده مورد مطالعه هیچ واکنشی صورت نگرفت. طبق مطالعه ی مقایسه ای که در سال 2017 بر روی نمونه سرم 165 زن با سقط خود به خودی با عامل CMV به وسیله  سه روش تشخیصی PCR ، الایزا و ایمونواسی کروماتوگرافیک انجام گرفت، با تشخیص 96% مثبت با PCR از نظر حضور CMV در نمونه ها، همچنان روش تشخیصی PCR با اختلاف از سایر روش ها از نظر دقت حائزاهمیت بود (14). متراکم شدن ویروس‌ها در جنین که به بیماری شدید منجرمی شود در هفته‌های 12 تا 16 بارداری رخ می‌دهد (15) و قبل از آن ردیابی وجود DNA در خون مادر می‌تواند جایگزین آمنیوسنتز شود (16). در مطالعه‌ای 100 نمونه ادرار نوزادان زیر سه هفته مورد آزمایش قرار گرفت. نتایج بررسی با توجه به متغیرهای سن بر حسب روز، جنس، علائم بالینی مختلف در نوزادان تازه متولد شده و دو روش متفاوت  Real Time و PCR ارزیابی شدند. نتایج حاصل از انجام PCR به روش الکتروفورزیس برای CMV بر روی 100 نمونه ادرار نوزادان، 58 نوزاد مثبت      ) 58 %(  و 43 نوزاد منفی) 43%(  را نشان دادند. تمامی 100 نمونه با تکنیک Real Time مورد ارزیابی قرار گرفتند که نتایج آن، نتایج PCR معمولی را تایید کردند (17). در برخی موارد، تشخیص قطعی عفونت‌های CMV  براساس جداسازی ویروس است، اما در بسیاری از موارد به ویژه در تست‌های غربالگری، امکان کشت دادن ویروس (به علت گران بودن و وقت گیربودن) نیست (18)، لذا وجود روش مولکولی در تشخیص این  بیماری به عنوان تست سریع و صحیح بسیار حائز اهمیت است (19).

Patrick Doof و همکاران جهت تایید وجود یا عدم وجود عفونت CMV از روش PCR استفاده کردند. در آ‌ن مطالعه تعداد ۱۵۷ زن باردار به عنوان مبتلایان به عفونت اولیه CMV شناخته شدند. از این تعداد ۱۴۸ مورد بدون علامت بالینی و ۸ مورد دارای علایم بالینی بودند. در یک مورد هم وجود ناهنجاری های مادرزادی جنین مربوط به عفونت CMV در نظر گرفته شد. در مطالعه‌ای توسط سعید ذاکر و همکاران بر روی نمونه‌های مایع آمنیوتیک از 60 زن باردار با سابقه سقط مشخص شد که نتایج PCR برای 5 (8/27 %) نفر با یکبار سابقه سقط و 4 (0/80 %) نفر با دوبار سابقه سقط مثبت بوده است. در گروه کنترل نتایج PCR منفی گزارش شد (19). در مطالعه حاضر نیز، نتایج PCR برای 2٪ از 50 نمونه مورد بررسی مثبت شد و حد تشخیص 100 copy/reaction بدست آمد. همچنین، نتایج حاصل از تحقیق کاظمی و همکاران بر روی 110 نمونه سرم خون از مادران با سابقه‌ی سقط خود به خودی مبنی بر مثبت شدن تست PCR برای 6 مورد ( 6/5%) بوده است که به نتایج این تحقیق نزدیک است. آنها از سه روش PCR‌، کشت و الایزا برای تشخیص عفونت CMV استفاده کردند. با توجه به نتایج، دقت تست PCR از بقیه روش‌ها بیشتر گزارش شد و ثابت کردند تست الایزا برای تشخیص عفونت CMV کارایی چشم‌گیری ندارد زیرا، تست الایزا، در دو هفته اول بروز علائم بیماری منفی است، چون آنتی بادی سرمی آنقدر افزایش پیدا نکرده است که بتواند تست الایزا را مثبت کند که این امر از جنبه‌های منفی یا ضعیف الایزا بشمار می‌رود (4).

ارزیابی نتایج محققان نشان داد که اهمیت تشخیص سریع و به موقع در مورد عفونت‌های مرتبط با CMV از اهمیت بالایی برخوردار است و مقایسه روش‌های مختلف در تشخیص وجود این عامل در بدن این موضوع را روشن می‌نماید که احتمالاً روش تشخیص مولکولی در زمان و دقت شناسایی عامل مهمی در بهره برداری این روش است (19) .همچنین روش‌های ایمونولوژی که امروزه صورت می گیرد ، با توجه به خطای دستگاه و کارشناسان مرتبط و همچنین زمان انجام آن معضلاتی را در گزارشات صحیح و سریع در بر دارد که روش مولکولی، جایگزین مناسبی در تشخیص است. همچنین با توجه به نتایج محققان دیگر کشورها این موضوع نمایان می شود که  ویروس CMV امکان واردکردن ضربه به خانواده و مادران با سقط‌های خود به خودی و مکرر، تولد نوزاد با ناهنجاری‌های شناخته شده و ضایعات جبران ناپذیر در نوزاد را دارد. بنابراین، لزوما در این نوع سقط ها می توان بوسیله ی تکنیک هایی مانند PCR به سرعت، CMV را جستجو و شناسایی نمود.

نتیجه گیری

تشخیص سریع و به موقع در مورد عفونت‌های مرتبط با CMV از اهمیت بالایی برخوردار است چون با غربالگری می‌توان عفونت احتمالی جنین را جست و جو نمود و در صورت مثبت بودن، با خاتمه انتخابی حاملگی، جلوی تولد یک نوزاد دارای نقایص جسمانی و روانی را گرفت.

منابع

1-    Neirukh T, Qaisi A, Saleh N, Rmaileh AA, Zahriyeh EA, Qurei L, Dajani F, Nusseibeh T, Khamash H, Baraghithi S, Azzeh M. Seroprevalence of Cytomegalovirus among pregnant women and hospitalized children in Palestine. BMC infectious diseases. 2013 Dec;13(1):1-7.

2-    Lilleri D, Kabanova A, Lanzavecchia A, Gerna G. Antibodies against neutralization epitopes of human cytomegalovirus gH/gL/pUL128-130-131 complex and virus spreading may correlate with virus control in vivo. Journal of clinical immunology. 2012 Dec 1;32(6):1324-31.

3-    Mercer DK, Stewart CS, Miller L, Robertson J, Duncan VM, O’Neil DA. Improved methods for assessing therapeutic potential of antifungal agents against dermatophytes and their application in the development of NP213, a novel onychomycosis therapy candidate. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2019 Apr 25;63(5):e02117-18.

4-    Mercer DK, Stewart CS, Miller L, Robertson J, Duncan VM, O’Neil DA. Improved methods for assessing therapeutic potential of antifungal agents against dermatophytes and their application in the development of NP213, a novel onychomycosis therapy candidate. Antimicrobial agents and chemotherapy. 2019 Apr 25;63(5):e02117-18.

5-    Kazemi A, Norouzi H, Nazarpour S. Comparison the Diagnostic Value of Culture and Polymerase Chain Reaction Methods in Diagnosis of Cytomegalovirus Infections in Spontaneous Abortions. The Iranian Journal of Obstetrics, Gynecology and Infertility. 2013;16(53):1-6.

6-    Kaandorp SP, Goddijn M, Van Der Post JA, Hutten BA, Verhoeve HR, Hamulyák K, Mol BW, Folkeringa N, Nahuis M, Papatsonis DN, Büller HR. Aspirin plus heparin or aspirin alone in women with recurrent miscarriage. New England Journal of Medicine. 2010 Apr 29;362(17):1586-96.

7-    Bieniek R, Kirby JE, Cheng A, Eichelberger K, Qian Q. Effective use of PCR for the detection of cytomegalovirus viremia and monitoring therapy in immunocompromised patients. Laboratory Medicine. 2011 Jun 1;42(6):339-43.

8-    Wang Y, Li S, Ma N, Zhang Q, Wang H, Cui J, Wang S. The association of ToRCH infection and congenital malformations: A prospective study in China. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 2019 Sep 1;240:336-40.

9-    Goudarzi E, Yousefi JV, Harzandi N. Survey of polymerase chain reaction efficiency in the detection of mycoplasma, Listeria and Brucella in culture negative samples obtained from women with abortion. Journal of Mazandaran University of Medical Sciences. 2013 Oct 10;23(105):61-9.

10-                       Requião-Moura LR, Matos AC, Pacheco-Silva A. Cytomegalovirus infection in renal transplantation: clinical aspects, management and the perspectives. Einstein (Sao Paulo). 2015 Jan;13:142-8.

11-                       Ssentongo P, Hehnly C, Birungi P, Roach MA, Spady J, Fronterre C, Wang M, Murray-Kolb LE, Al-Shaar L, Chinchilli VM, Broach JR. Congenital Cytomegalovirus Infection Burden and Epidemiologic Risk Factors in Countries With Universal Screening: A Systematic Review and Meta-analysis. JAMA network open. 2021 Aug 2;4(8):e2120736.

12-                       Gao YL, Gao Z, He M, Liao P. Infection status of human parvovirus B19, cytomegalovirus and herpes simplex Virus-1/2 in women with first-trimester spontaneous abortions in Chongqing, China. Virology journal. 2018 Dec;15(1):1-8.

13-                       Szkaradkiewicz A, Pieta P, Tułecka T, Breborowicz G, Słomko Z, Strzyzowski P. The diagnostic value of anti-CMV and anti-HPV-B19 antiviral antibodies in studies on causes of recurrent abortions. Ginekologia polska. 1997;68(4):181-6.

14-                       Gerna G, Baldanti F. Brief molecular diagnostic criteria for human cytomegalovirus infection/disease. Expert review of molecular diagnostics. 2019 Sep 2; 19(9):773-5.

15-                       Ahmed R. Sofy , Khalid A. El-Dougdoug , Adel A. Mousa , Mahmoud R. Sofy , Ahmed A. Hmed , Ahmed A. Abbas , Monitoring and Evaluation of Cytomegalovirus Detection and Risk Factors in Pregnant Women from Egypt, International Journal of Virology and Molecular Biology. 2017 Dec; 6 (1): 9-23.

16-                       Adler SP. Screening for cytomegalovirus during pregnancy. Infectious diseases in obstetrics and gynecology. 2011 Aug 9; 2011.

17-                       Marsico C, Kimberlin DW. Congenital Cytomegalovirus infection: advances and challenges in diagnosis, prevention and treatment. Italian journal of pediatrics. 2017 Dec;43(1):1-8.

18-                       YARI R, Javadi A, MOROVVATI A, SEYEDSHAKERI T. Rapid Detection and Prevalence of Cytomegalovirus in Infants under Three Weeks by PCR and Real Time PCR. 2016.

19-                       Benoist G, Leruez-Ville M, Magny JF, Jacquemard F, Salomon LJ, Ville Y. Management of pregnancies with confirmed cytomegalovirus fetal infection. Fetal diagnosis and therapy. 2013;33(4):203-14.

20-                       Nigro G, Mazzocco M, Mattia E, Di Renzo GC, Carta G, Anceschi MM. Role of the infections in recurrent spontaneous abortion. The Journal of Maternal-Fetal & Neonatal Medicine. 2011 Aug 1;24(8):983-9.