دوره 12، شماره 48 - ( 7-1401 )                   جلد 12 شماره 48 صفحات 58-47 | برگشت به فهرست نسخه ها

XML English Abstract Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Jalili S, Rahmati F, Abdollahzadeh Parsa M. Extracting the creatininease enzyme and investigating the effect of different concentrations of gold nanoparticles on the enzyme activity. NCMBJ 2022; 12 (48) : 4
URL: http://ncmbjpiau.ir/article-1-1561-fa.html
جلیلی شیرین، رحمتی فرشته، عبداله زاده پارسا مهدی. استخراج آنزیم کراتینیناز و بررسی اثر غلظت های مختلف نانوذرات طلا بر فعالیت آنزیم. مجله تازه هاي بيوتكنولوژي سلولي و مولكولي. 1401; 12 (48) :47-58

URL: http://ncmbjpiau.ir/article-1-1561-fa.html


گروه بیوشیمی، دانشکده علوم زیستی، واحد تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران. ، f.rahmati@iau-tnb.ac.ir
متن کامل [PDF 528 kb]   (663 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (854 مشاهده)
متن کامل:   (439 مشاهده)
Extracting the creatininease enzyme and
 investigating the effect of different
concentrations of gold nanoparticles on the enzyme activity
Shirin Jalili1, Fereshteh Rahmati2  ⃰, Mehdi Abdollahzadeh Parsa2
1. Policing sciences and social studies research institute, Tehran. Iran.
2. Department of Biochemistry, Faculty of Biological Sciences, North-Tehran Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran.
Abstract
Aim and Background: The use of creatininase is an enzymatic method for measuring amount of creatine and creatinine in body fluids to assess kidney health. The aim of this study was to investigate the effect of gold nanoparticles on the activity and stability of creatininase enzyme for use in creatine and creatinine assay kits.
Materials and Methods: In this study, E. coli BL21 containing pET28a amplification vector containing creatininase gene was first cultured in liquid LB medium and then induced at 28°C. After sonication, purification of enzyme was performed by affinity chromatography.  After confirmation of expression by SDS-PAGE, The expressed enzyme concentration was measured by Bradford method. Then the activity of the enzyme was examined and compared by colorimetric method in the presence and absence of gold nanoparticles. Finally, the effect of gold nanoparticles on the structure of creatininase enzyme was investigated by fluorescence spectroscopy.
Results:Creatininase activity in the absence of gold nanoparticles 14.6 U/ml and in the presence of gold nanoparticles with concentrations of 1.97, 3.94, 7.88, 11.82, 15.76, 19.7 and 39.4 ngr/l 14/1, 12.4, 11.2, 10.1, 8.4, 7.5, 4.7 U/ml were calculated which indicates a decrease in creatininase activity in the presence of gold nanoparticles. On the other hand, fluorescence spectroscopy of creatininase in the presence and absence of gold nanoparticles at the excitation wavelength of 295 nm showed a decrease in fluorescence intensity in the presence of gold nanoparticles.
Conclusion: Gold nanoparticles reduced the activity of the creatininase enzyme. Gold nanoparticles also reduced the fluorescence intensity of creatininase enzyme, which could indicate a change in the microenvironment of the amino acid tryptophan in the structure of the creatininase enzyme, so using gold nanoparticles is not a good option for stable structure and activity of creatininase for use in commercial kits.
Key word:  Creatininase, Expression, Gold nanoparticles, Colorimetry, Fluorescence spectroscopy, Iau Science.






Corresponding author:
Department of Biochemistry, Faculty of Biological Sciences, North-Tehran Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
Email: f.rahmati@iau-tnb.ac.ir


استخراج آنزیم کراتینیناز و بررسی اثر غلظت­های
 مختلف نانوذرات طلا بر فعالیت آنزیم
شیرین جلیلی 1 ، فرشته رحمتی 2 ، مهدی عبداله زاده پارسا 2
1. پژوهشگاه علوم انتظامی و مطالعات اجتماعی ناجا، تهران، ایران.
2. گروه بیوشیمی، دانشکده علوم زیستی، واحد تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران.

چکیده
سابقه و هدف: استفاده از آنزیم کراتینیناز یک روش آنزیمی جهت سنجش میزان کراتین و کراتینین در مایعات بدن با هدف بررسی سلامت ­ا است. هدف از این تحقیق، بررسی اثر نانوذرات طلا بر فعالیت و پایداری آنزیم کراتینیناز به جهت استفاده در کیت­های سنجش کراتین و کراتینین است.
مواد و روش­ها: در این مطالعه ابتدا باکتری E.Coli BL21  حاوی وکتور تکثیری pET28a حاوی ژن آنزیم کراتینیناز در محیط LB مایع کشت و سپس در دمای 28 درجه القاء بیان گردید. در ادامه پس از سونیکاسیون، تخلیص آنزیم با کمک کروماتوگرافی تمایلی انجام شد. پس از تأیید بیان با SDS-PAGE، غلظت آنزیم بیان شده با روش برادفورد سنجش شد. در ادامه فعالیت آنزیم با روش رنگ­سنجی در حضور و عدم حضور نانوذرات طلا بررسی و مقایسه گردید. در نهایت اثر نانوذرات طلا بر ساختار آنزیم کراتینیناز با روش طیف­سنجی فلورسانس، بررسی گردید.
یافته­ها: فعالیت آنزیم کراتینیناز در عدم حضور نانوذرات طلا U/ml 6/14 و در حضور نانوذرات طلا با غلظت­های 97/1، 94/3، 88/7، 82/11، 76/15، 7/19و 4/39 نانوگرم بر لیتر به­ترتیب U/ml 1/14، 4/12، 2/11، 1/10، 4/8، 5/7، 7/4 محاسبه گردید که نشان از کاهش فعالیت آنزیم کراتینیناز در حضور نانوذرات طلا دارد. از طرفی طیف­سنجی فلورسانس آنزیم کراتینیناز در حضور و عدم حضور نانوذرات طلا در طول موج تهییج 295 نانومتر کاهش شدت فلورسانس در حضور نانوذرات طلا را نشان داد.
نتیجه­گیری: نانوذرات طلا باعث کاهش فعالیت آنزیم کراتینیناز شدند. هم­چنین نانوذرات طلا باعث کاهش شدت فلورسانس آنزیم کراتینیناز گردیدند که می­تواند نشانگر تغییر در ریزمحیط اسید آمینه تریپتوفان در ساختار آنزیم کراتینیناز باشد، در نتیجه استفاده از نانوذرات طلا گزینه مناسبی برای پایدارسازی فعالیت و ساختار آنزیم کراتینیناز جهت استفاده در کیت­های تجاری نیستند.
واژگان کلیدی: کراتینیناز، بیان، نانوذرات طلا، رنگ­سنجی، طیف­سنجی فلورسانس،  Iau Science.

 
مقدمه
ـــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ
نویسنده مسئول:
گروه بیوشیمی، دانشکده علوم زیستی، واحد تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران.
پست الکترونیکی:  f.rahmati@iau-tnb.ac.ir
تاریخ دریافت: 25/12/1400
تاریخ پذیرش: 10/07/1401
در سال­های اخیر، استفاده از پروتئین­ها و آنزیم­های نوترکیب در تحقیقات علمی افزایش یافته است. یکی از روش­های تولید پروتئین نوترکیب، همسانه سازی مولکولی DNA خارجی، به درون DNA کروموزومی باکتریایی است. از این تکنولوژی، امروزه برای تولید پروتئین­های نوترکیب در تحقیقات بالینی و صنعتی استفاده می­شود (1). آنزیم­های میکروبی از لحاظ اقتصادی، با داشتن مراحل تهیه کشت میکروبی ساده­تر، سریع­تر و ارزان­تر نسبت­به آنزیم­های تولید شده توسط حیوانات و گیاهان، مناسب­تر هستند. از طرفی میکروارگانیسم­های مولد آن­ها، به­سادگی می­توانند از لحاظ ژنتیکی، برای تولید هرچه بیش­تر و در جهت بهبود کمیت و کیفیت مورد نظر محصولات، دست­کاری شوند (2).

یکی از این آنزیم­ها، آنزیم کراتینیناز با نام سیستمیک کراتینین آمیدوهیدرولاز (EC 3.5.2.10) است که یک پروتئین هوموهگزامر با 259 اسید آمینه و وزن مولکولی 28 کیلو دالتون برای هر مونومر است و متعلق­به خانواده بزرگ آمیدوهیدرولاز­ها است (3). آنزیم کراتینیناز هیدرولیز کراتینین را به کراتین کاتالیز می­کند، که سپس می­تواند توسط آنزیم کراتیناز به اوره و سارکوزین متابولیزه شود. از این آنزیم می­توان در سنجش بالینی کراتین و کراتینین در مایعات بدن استفاده کرد (4). این آنزیم در بسیاری ازباکتری­ها از جمله: سودوموناس­ها، آرتروباکترها، فلاووباکتریوم­ها، باسیلوس­ها، پاراکوکوس و آلکالیژنزها یافت می­شود. این باکتری­ها از این آنزیم جهت تجزیه میکروبی کراتین به­عنوان منبع کربن و نیتروژن و در چرخه متابولیسم آرژنین و پرولین استفاده می­کنند (5).
کراتین در افزایش سنتز آدنوزین تری­فسفات (ATP) نقش دارد، هم­چنین در بدن در تعادل با کراتینین بوده و از طرفی شاخص مهمی برای سنجش سلامت کلیه­ها و هم­چنین عضلات است. بنابراین اندازه­گیری میزان کراتین و کراتینین در سرم خون و ادرار، می­تواند نشان دهنده عملکرد کلیه­ها و عضلات باشد (6).
ژن کدکننده این آنزیم در باکتری­های اشاره شده یافت می­شود ولی این باکتری­ها، این آنزیم را تنها به میزان مورد نیاز خود تولید کرده و همین مقادیر کم نیز ناپایدار بوده و از طرفی جداسازی و خالص­سازی آنزیم از این باکتری­ها به­صورت طبیعی مشکلات خاص خود را داشته و ممکن است باکتری تولید کننده بعد از چندین پاساژ متوالی بر روی محیط کشت، توانایی تولید این آنزیم را از دست بدهند، لذا برای تولید انبوه این آنزیم در صنعت، از تکنیک تولید پروتئین نوترکیب (تولید آنزیم در میزبانی دیگر که دارای قدرت بیان بالاتر و تحت کنترل است) استفاده می­شود. یکی از باکتری­های مولد این آنزیم، سودوموناس پوتیدا است که آنزیم تولیدی آن، مقدار و فعالیت بالاتری از خود نشان می­دهد. برای تولید انبوه این آنزیم به­کمک مهندسی ژنتیک می­توان ژن کراتینیناز را از باکتری مولد (سودوموناس پوتیدا) استخراج و در یک وکتور تکثیری (pET28a) کلون کرده و در نهایت به سویه بیانی هم­چونE.coli BL21  جهت بیان انبوه، استخراج و خالص­سازی پروتئین هدف، منتقل کرد (7). از طرفی با توجه­به ناپایدار بودن آنزیم تولید شده، لازم است از روشی برای پایدارسازی آنزیم استفاده کرد. به­طور کلی برای پایدارسازی آنزیم­ها از روش­های مختلفی از جمله: ایجاد پیوندهای عرضی درون مولکولی (8)، متصل کردن پلی­مرهای محلول درآب مانند پلی­اتیلن گلیکول (PEG) (9) و سایر پلی­مرهای سازگار با زیست هم­چون کیتوزان (10)، افزودن قندها و الکل­های قندی مانند گلیسرول (11)، استفاده از سورفاکتانت ها (11)، جهش­زایی تصادفی و مستقیم موضعی (12) و هم­چنین افزودن نانوذرات (13) استفاده می­شود. نانوذرات طلا پایدارترین ذرات فلزی هستند که باتوجه­به خصوصیت­های مختلفی چون شکل، سایز، ویژگی­های نوری و مغناطیسی مشخصی که دارند کاربردهای جذابی را ارائه می­دهند (14).
یکی از روش­های بررسی ساختاری پروتئین­ها، طیف­سنجی فلورسانس است. به­طوری­که در صورت تابش نور مرئی به یک مولکول یا ماده، باعث برانگیخته شدن آن مولکول به سطح بالاتری از انرژی شده و در هنگام بازگشت به حالت اولیه، مقداری از انرژی به­صورت گرما آزاد شده و مابقی به­صورت طیف فلورسانس گسیل می­گردد که با کمک یک آشکار ساز می­توان آن را به­صورت نمودار به نمایش در آورد (15). با توجه­به وجود اسید آمینه تریپتوفان در ساختار آنزیم کراتینیناز و بالا بودن میزان جذب این اسید آمینه و تأثیرگذاری بیش­تر آن بر یافته­های طیف­سنجی فلورسانس (طبق منابع معتبر)، در صورت استفاده از طول موج تهییج 295 نانومتر و بررسی طیف فلورسانس حاصله می­توان به وضعیت اسید آمینه تریپتوفان در پروتئین پی برد (16). بدین­ترتیب می­توان اثر نانوذرات طلا بر ساختار آنزیم کراتینیناز را با مقایسه طیف­سنجی فلورسانس در طول موج 295 نانومتر در حضور و عدم حضور نانوذرات طلا مورد بررسی قرار داد.
هدف از این تحقیق بررسی اثر نانوذرات طلا بر فعالیت و پایداری آنزیم کراتینیناز جهت تولید انبوه آنزیم کراتینیناز فعال­تر و پایدارتر به­منظور استفاده در کیت­های تشخیصی سنجش میزان کراتین و کراتینین سرم و ادرار است.
مواد و روش­ها
مواد: در این پژوهش از ایمیدازول (مرک)، ترپیپتوفان ( مرک)، عصاره مخمر (مرک)، کلرید سدیم ( مرک)، کلرید پتاسیم (مرک)، هیدروکسید سدیم (مرک)، IPTG (فرمنتاز)، بیس اکریلامید (بیو بیسیک)، APS (مرک)، برمو فنول بلو (مرک)، آگارز (کیاژن)، استیک اسید (مرک)، تریس باز (مرک)، TEMED (مرک)، گلایسین (سیگما)، BSA (مرک) استفاده گردید.
بیان، تخلیص و سنجش غلظت پروتئین­ها
به­منظور بیان بالای آنزیم کراتینیناز و سهولت در تخلیص آنزیم مذکور، ابتدا باکتری  E.Coli سویه BL21 که وکتور بیانی pET28a حاوی ژن کراتینیناز سودوموناس پوتیدا در آن ترانسفورم شده است، در محیط کشت LB مایع کشت گردید. پس از القای ژن آنزیم مورد نظر جهت بیان بالای آن (Over Expression)، به­کمک دستگاه سونیکاتور (20 ثانیه سونیکه و 40 ثانیه استراحت تا 15 پالس) دیواره سلول باکتری تخریب گردید. به­منظور تخلیص آنزیم از روش کروماتوگرافی تمایلی (به­کمک ستون نیکل-سفارز) استفاده شد. آنزیم­های نوترکیب بیان شده دارای دنباله هیستیدینی (His6-tag) در انتهای آمین (N-Terminal) خود هستند. این دنباله هیستیدینی تمایل زیادی به نیکل داشته و میانکنش محکمی با آن برقرار می­کند. در نهایت برای جداسازی پروتئین­های متصل­به ستون از بافر جداکننده (Elution Buffer) حاوی NaCl 300 میلی­مولار، Imidazole  250 میلی­مولار، Tris/Hcl 50 میلی­مولار با PH ، 8 استفاده شد. در ادامه برای حصول اطمینان و تأیید حضور و خلوص نمونه­ها از روش الکتروفورز SDS-PAGE استفاده شد و در نهایت برای سنجش غلظت پروتئین از روش برادفورد استفاده گردید. با رسم منحنی استاندارد به کمک پروتئین BSA و معرف برادفورد، غلظت نمونه آنزیمی مشخص گردید (17).
بررسی فعالیت آنزیم با روش رنگ­سنجی
برای بررسی فعالیت آنزیم از روش رنگ­سنجی استفاده گردید. بدین­منظور آنزیم کراتینیناز حاصل از بیان با محلول کراتین در PBS به­عنوان سوبسترا در 37 درجه به­مدت 10 دقیقه انکوبه شده و سپس 1/0 میلی­لیتر از محلول بالا را به 9/0 میلی­لیتر آب یخ استریل اضافه نموده و سپس 1 میلی­لیتر  NaOH (1 مولار) و 1 میلی­لیتر محلول پیکریک اسید افزوده و در دمای اتاق 25 درجه سانتی­گراد به­مدت 20 دقیقه انکوبه کرده و در ادامه میزان جذب آن در 520 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر خوانش گردید. با استفاده از روش رنگ­سنجی، فعالیت آنزیم کراتینیناز بر حسب U/ml محاسبه گردید.
بررسی اثر نانوذرات طلا بر فعالیت آنزیم کراتینیناز
در این تحقیق از نانوذرات طلا به­صورت نانوکلوئید طلا(ppm 100) به رنگ شرابی با اندازه ذرات 20 نانومتر استفاده شده است.
برای بررسی اثر نانوذرات طلا بر فعالیت آنزیم کراتینیناز ابتدا استوک نانوذرات طلا رقیق شده و از غلظت­های 97/1، 94/3، 88/7، 82/11، 76/15، 7/19و 4/39 نانوگرم بر لیتر نانوذرات طلا استفاده گردید. پس از انکوبه کردن هر غلظت از نانوذرات طلا با آنزیم کراتینیناز به­مدت 5 دقیقه، فعالیت آنزیم در حضور نانوذرات طلا محاسبه گردید.
بررسی سینتیکی آنزیم کراتینیناز در حضور و عدم حضور نانوذرات طلا
به­منظور بررسی سینتیک آنزیم کراتینیناز در میانکنش با نانوذرات طلا، ابتدا غلظت­های 06/0، 07/0، 08/0، 09/0، 1/0، 11/0، 12/0 و 2/0 میلی­مولار بر لیتر سوبسترا (کراتین در PBS) تهیه گردید و سپس فعالیت آنزیم با همان روش رنگ­سنجی مذکور در بالا در هر یک از این غلظت­ها بررسی گردید. این آزمون یک بار با آنزیم آزاد (عدم حضور نانوذرات) و یک بار با آنزیم انکوبه شده با نانوذرات طلا با غلظت 7/19 نانوگرم بر لیتر انجام شد. به­منظور دقت بیش­تر هر کدام از آزمون­ها با سه بار تکرار صورت پذیرفت. در ادامه نمودارهای میکائیلیس- منتن و لاینویور- برک مربوط به فعالیت آنزیم بر غلظت سوبسترا در حضور و عدم حضور نانو ذرات طلا با نرم­افزار Prism نسخه 8 رسم گردیده و پارامترهای سینتیکی آنزیم (Vmax و Km) با کمک نمودار به­دست آمد.
بررسی ساختاری آنزیم کراتینیناز با روش طیف­سنجی فلورسانس
به­منظور بررسی ساختاری آنزیم از روش طیف­سنجی فلورسانس استفاده شد. با توجه­به این­که آنزیم کراتینیناز حاوی اسید آمینه تریپتوفان است و این اسید آمینه آروماتیک بالاترین میزان جذب را دارد، بدین­منظور ابتدا بافرفسفات پتاسیم (50 میلی­مولار) در آب مقطر با pH، 4/7 آماده شد، آنزیم کراتینیناز در بافر حل شد. طول موج برانگیختگی 295 نانومتر و دمای 298 درجه کلوین و طول موج خوانش در بازه 300 تا 500 نانومتر در این آزمون مورد استفاده قرار گرفت تا فقط اسید آمینه تریپتوفان تحریک شود در نتیجه طیف فلورسانس حاصله مربوط به موقعیت تریپتوفان در آنزیم کراتینیناز است.
بررسی اثر نانوذرات طلا بر ساختار آنزیم کراتینیناز
برای بررسی اثر نانوذرات طلا بر ساختار آنزیم کراتینیناز از غلظت های 97/1، 94/3، 88/7، 82/11، 76/15، 7/19و 4/39 نانوگرم بر لیتر نانوذرات طلا استفاده گردید. پس از انکوبه کردن هر غلظت از نانوذرات طلا با آنزیم کراتینیناز حل شده در بافر به­مدت 5 دقیقه، طیف فلورسانس حاصل از هر یک در طول موج تهییج 295 نانومتر رسم شده و در انتها طیف­های فلورسانس حاصله در حضور و عدم حضور نانوذرات طلا مورد مقایسه قرار گرفت.
تجزیه و تحلیل آماری داده­ها
به­منظور بررسی نرمال بودن داده­ها از آزمون شاپیروویلک استفاده گردید که نرمال بودن داده­ها تأیید شد. هم­چنین از تحلیل واریانس (ANOVA) در نرم­افزار SPSS نسخه 25 جهت بررسی تفاوت میانگین داده­ها استفاده گردید که میانگین داده­ها در سطح معنی­دار 05/0 متفاوت بوده است.
نتایج
سنجش غلظت آنزیم کراتینیناز حاصل از بیان
به­منظور سنجش غلظت آنزیم از روش برادفورد استفاده گردید. در ابتدا با کمک غلظت­های 0، 2/0، 4/0، 6/0، 8/0 و 1 میلی­گرم بر میلی­لیتر از BSA، نمودار استاندارد غلظت رسم و معادله خط به­دست آمد تا به­کمک آن بتوان غلظت پروتئین­های تخلیص شده در ویال­ها را اندازه­گیری کرد. سپس با جاگذاری میزان جذب هر ویال در معادله خط، غلظت آنزیم در هر ویال به­ترتیب 456/1، 243/1، 085/1، 870/0، 745/0، 632/0 و 457/0 میلی­گرم بر میلی­لیتر تعیین گردید. (جدول 1).
 
جدول 1. نتایج غلظت آنزیم کراتینیناز در هر ویال
E7 E6 E5 E4 E3 E2 E1 ویال
457/0 632/0 745/0 870/0 085/1 243/1 456/1 میزان پروتئین بر حسب mg/ml
 
بررسی فعالیت آنزیم کراتینیناز
میزان فعالیت آنزیم کراتینیناز حاصل از بیان در دمای القا 28 درجه سانتی­گراد در غلظت 1/0 مولار از سوبسترا (کراتین حل شده در PBS) U/ML 6/14 تعیین شد.
بررسی اثرنانوذرات طلا بر فعالیت آنزیم کراتینیناز
برای بررسی اثر نانوذرات طلا بر فعالیت آنزیم کراتینیناز ابتدا آنزیم با غلظت­های مختلفی از نانوذرات طلا به­مدت 5 دقیقه انکوبه گردید و در ادامه فعالیت آنزیم در غلظت ثابت سوبسترا (1/0 مولار) اندازه­گیری شد. بدین­ترتیب فعالیت آنزیم کراتینیناز در حضور نانوذرات طلا با غلظت­های 97/1، 94/3، 88/7، 82/11، 76/15، 7/19و4/39 نانوگرم بر لیتر به­ترتیب U/ML 1/14، 4/12، 2/11، 1/10، 4/8، 5/7 و 7/4 تعیین شد (جدول 2). در ادامه نمودار اثر نانوذرات طلا بر فعالیت آنزیم کراتینیناز رسم گردید (نمودار 1).

نمودار 1. اثر نانوذرات طلا بر فعالیت آنزیم کراتینیناز
 
جدول 2. فعالیت آنزیم کراتینیناز در حضور و عدم حضور نانوذرات طلا
4/39 7/19 76/15 82/11 88/7 94/3 97/1 0 غلظت نانوذرات طلا ngr/l
7/4 5/7 4/8 1/10 2/11 4/12 1/14 6/14 فعالیت آنزیم بر حسب U/ml
 
بررسی سینتیک آنزیم کراتینیناز در حضور و عدم حضور نانوذرات طلا
نتایج فعالیت آنزیم کراتینیناز در عدم حضور نانوذرات طلا در غلظت­های M/L 06/0، 07/0، 08/0، 09/0، 1/0، 11/0، 12/0 و 2/0 سوبسترا به­طور میانگین به­ترتیب U/ML 56/10، 57/11، 64/12، 78/13، 6/14، 19/15، 64/15 و 91/15 محاسبه گردید (جدول 3).
در ادامه نتایج فعالیت آنزیم کراتیناز در حضور نانوذرات طلا در غلظت­های فوق به­طور میانگین به-ترتیب U/ML 42/5، 95/5، 49/6، 08/7، 5/7، 79/7، 02/8 و 17/8 تعیین شد(جدول 4).
هم­چنین نمودارهای میکائیلیس منتن و لاینویر برک براساس فعالیت آنزیم کراتینیناز بر غلظت سوبسترا در حضور و عدم حضور نانوذرات طلا رسم گردید (نمودار 2و3) و پارامترهای سینتیکی آنزیم در حالت آزاد Unit/ML 51/21 Vmax=و  M/L053/0Km= و در حضور نانوذرات طلا Unit/ML 03/11 Vmax=و  M/L053/0Km= به­دست آمد. نتایج حاصل شده نشان می­دهد که با افزایش غلظت مهارکننده، حداکثر سرعت واکنش (Vmax ) کاهش یافته ولی km ثابت می­ماند؛ از طرفی با افزایش غلظت سوبسترا کاهش فعالیت آنزیم جبران نشده و میزان فعالیت و اثر مهاری تغییر نکرد که مبین مهار از نوع غیر رقابتی است.
 
جدول 3. فعالیت آنزیم کراتینیناز در غلظت های مختلف سوبسترا
2/0 12/0 11/0 1/0 09/0 08/0 07/0 06/0 غلظت سوبسترا M/L (کراتین در PBS)
97/15 79/15 43/15 06/15 12/14 35/12 95/11 16/10 فعالیت آنزیم (سری1) بر حسب U/ml
76/15 23/15 59/14 68/14 59/13 12/13 27/11 6/10 فعالیت آنزیم (سری2) بر حسب U/ml
16 92/15 56/15 17/14 63/13 45/12 49/11 92/10 فعالیت آنزیم (سری3) بر حسب U/ml
91/15 64/15 19/15 6/14 78/13 64/12 57/11 56/10 میانگین فعالیت آنزیم بر حسب U/ml

جدول شماره 4. فعالیت آنزیم کراتینیناز در حضور نانوذرات طلا و غلظت های مختلف سوبسترا
2/0 12/0 11/0 1/0 09/0 08/0 07/0 06/0 غلظت سوبسترا M/L (کراتین در PBS)
23/8 12/8 73/7 35/7 25/7 93/6 15/6 34/5 فعالیت آنزیم در حضور  AuNP (ng/l 7/19) بر حسب U/ml (سری 1)
31/8 07/8 59/7 49/7 18/7 19/6 02/6 68/5 فعالیت آنزیم در حضور  AuNP (ng/l 7/19) بر حسب U/ml (سری 2)
97/7 87/7 05/8 66/7 84/6 35/6 68/5 24/5 فعالیت آنزیم در حضور  AuNP (ng/l 7/19) بر حسب U/ml (سری 3)
17/8 02/8 79/7 5/7 08/7 49/6 95/5 42/5 فعالیت آنزیم در حضور  AuNP (ng/l 7/19) بر حسب U/ml

نمودار 2. نمودار میکاییلیس منتن آنزیم کراتینیناز در حضور و عدم حضور نانوذرات طلا (ng/l 7/19)

نمودار 3. نمودار لاینویر برک آنزیم کراتینیناز در حضور و عدم حضور نانوذرات طلا (ng/l 7/19)
 
طیف­سنجی فلورسانس آنزیم کراتینیناز در حضور و عدم حضور نانوذرات طلا
در ابتدا طیف فلورسانس نشر شده آنزیم کراتینیناز (عدم حضور نانوذرات طلا) حاصل از تهییج در طول موج 295 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفلوریمتر آنالیز و رسم گردید. در ادامه به­منظور بررسی اثر نانوذرات طلا بر ساختار آنزیم کراتینیناز، آنزیم با غلظت های 97/1، 94/3، 88/7، 82/11، 76/15، 7/19 و 4/39 نانوگرم بر لیتر نانوذرات طلا به­مدت 5 دقیقه انکوبه شده و سپس طیف فلورسانس نشری حاصل از تهییج در طول موج 295 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفلوریمتر آنالیز و رسم گردید. نمودار حاصله نشان داد که با افزایش غلظت نانوذرات طلا، میزان شدت فلورسانس به­وضوح کاهش یافته است که می­تواند نشانگر تغییر در ریز محیط اسید آمینه تریپتوفان در ساختار آنزیم کراتینیناز باشد نمودار(4). طیف فلورسانس حاصل از آنزیم کراتینیناز در عدم حضور و حضور غلظت­های مختلف نانوذرات طلا را نشان می­دهد.
بحث
هدف از انجام این مطالعه، ارائه روشی مطلوب برای پایدارسازی آنزیم کراتینیناز به­جهت استفاده در کیت­های سنجش کراتین وکراتینین بود. با توجه ­به ناپایداری این آنزیم (19)، اثر نانوذرات طلا بر پایداری آنزیم کراتینیناز مورد ارزیابی قرار گرفت. بدین منظور پس از کشت باکتری در محیط LB مایع از دمای القای 28 درجه استفاده گردید. چرا که طبق تحقیقاتی که پیش­تر انجام شده بود، آنزیم کراتینیناز بیان شده در دمای القای 28 درجه سانتی­گراد، آنزیمی فعال­تر ارائه داده بود (20). پس از بیان و تخلیص آنزیم به کمک روش کروماتوگرافی تمایلی، سنجش فعالیت آنزیم با روش رنگ­سنجی انجام شد و مقدار U/ML 6/14 ثبت گردید.
 

نمودار 4. طیف فلورسانس آنزیم کراتینینازدر طول موج تهییج (nm 295) در حضور و عدم حضور AuNPs
 
در گذشته مطالعه­هایی با هدف پایدارسازی آنزیم کراتیناز انجام شده که از آن­ها می­توان به ایجاد موتاسیون­های تصادفی به­صورت تکی، جفت و سه گانه بر روی آنزیم کراتینیناز اشاره کرد که در نهایت جهش­های سه گانه ایجاد شده باعث پایداری نسبی آنزیم گردیده ولی اثر نامطلوب بر فعالیت آنزیم داشته است (21). در مطالعه دیگری اثر یون­های نقره برآنزیم کراتینیناز بررسی شده که حاکی از مهار فعالیت آنزیم بود (22). مطالعه­ای دیگر اثر نانو ذرات اکسید آهن و کیتوزان بر آنزیم کراتینیناز را بررسی کرده که باعث ثبات نسبی در ساختار وفعالیت آنزیم شده بود (23). با توجه­به این که نانوذرات طلا جزو پایدارترین عناصر فلزی هستند، لذا در این تحقیق سعی شد اثر نانوذرات طلا بر پایداری آنزیم کراتینیناز نوترکیب مورد بررسی قرار گیرد تا شاید گزینه مناسبی برای پایداری ساختاری و فعالیت آنزیم کراتینیناز باشد. بدین­منظور آنزیم کراتینیناز استخراجی با غلظت­های مختلفی از نانوذرات طلا انکوبه شد و فعالیت آنزیم دوباره بررسی گردید. نتایج حاصله نشانگر کاهش فعالیت آنزیم کراتینیناز در میانکنش با نانوذرات طلا بود که این کاهش فعالیت با افزایش غلظت نانوذرات طلا چشم­گیرتر بود. هم­چنین پارامترهای سینتیکی آنزیم کراتینیناز در حالت آزاد (Vmax=21.51 Unit/ML و Km=0.053 M/L) و در حضور نانوذرات طلا (Unit/ML03/11 Vmax= و M/L 053/0 Km=) نشان داد که Vmax در میانکنش با نانوذرات طلا کاهش چشم­گیری یافته است در حالی­که Km ثابت مانده است، این مسئله نشان می­دهد که حضور نانوذرات طلا به­صورت یک مهارکننده غیررقابتی عمل کرده و باعث کاهش فعالیت آنزیم کراتینیناز شده­اند. از طرفی بررسی ساختاری آنزیم کراتینیناز با کمک طیف­سنجی فلورسانس در طول موج تهییج 295 نانومتر، در حضور و عدم حضور نانوذرات طلا، کاهش میزان شدت فلورسانس در حضور نانوذرات طلا را نشان داد که با افزایش غلظت نانوذرات طلا، کاهش شدت فلورسانس بیش­تری حاصل شد. کاهش نشر فلورسانس ذاتی می­تواند نشان­دهنده تغییر در ریز محیط آمینواسید فلورسانت تریپتوفان در ساختار آنزیم کراتینیناز باشد. از آنجایی­که آمینو اسیدهای فلوروفور با حضور در محیط­های آبی کاهش نشر و در محیط­های هیدروفوب رفتار افزایش نشر را نشان می­دهند، لذا کاهش نشر فلورسانس آنزیم در حضور نانوذرات طلا، به­احتمال بیانگر بروز تغییرات در ساختار سوم آنزیم است. در نتیجه استفاده از نانوذرات طلا به جهت پایدارسازی آنزیم کراتینیناز گزینه مناسبی به نظر نمی­رسد.
با توجه­به ناپایداری آنزیم کراتینیناز، محدودیت زمانی جهت بررسی فعالیت و ساختار این آنزیم وجود داشت. لذا در این مطالعه، بررسی فعالیت و ساختار آنزیم بلافاصله پس از تخلیص آنزیم انجام پذیرفت. چرا که با گذشت 48 الی 72 ساعت از تخلیص آنزیم به شرط استفاده از گلیسرول و نگهداری در دمای 20- درجه سانتی­گراد، شاهد کاهش چشم­گیر فعالیت آن بودیم. هم­چنین تمامی بررسی­ها در شرایط دمایی یکسان صورت پذیرفت. با توجه­به نتایج حاصل از اثر نانوذرات طلا بر آنزیم کراتینیاز، روش­های دیگری برای پایدارسازی آنزیم کراتینیناز پیشنهاد می­شود از جمله: بررسی اثر مهارکننده­ها و فعال کننده­ها بر روی آنزیم کراتینیناز، ایجاد جهش­های هدفدار در توالی آنزیم و بررسی پایداری و فعالیت آنزیم، بررسی پایداری آنزیم در برابر عوامل گوناگون دیگر و هم­چنین بررسی ساختار کریستالوگرافی آنزیم کراتینیناز به جهت شناخت بهتر آنزیم و انتخاب گزینه بهتر برای پایدارسازی آنزیم به جهت مصارف تجاری.
نتیجه­گیری
یافته­های این مطالعه نشان داد که کشت باکتری E.Coli BL21 حاوی وکتور تکثیری pET28a در محیط کشت LB مایع و القای آن در دمای 28 درجه سانتی­گراد به­مدت 16 ساعت، آنزیم کراتینیناز با میزان بیان بالا جهت استفاده در کیت­های سنجش کراتین و کراتینین در اختیارمان قرار می­دهد. در ادامه بررسی اثر نانوذرات طلا بر پایداری آنزیم کراتینیناز نشان داد، با توجه­به کاهش فعالیت آنزیم کراتینیناز در حضور نانوذرات طلا و هم­چنین احتمال تغییر در ریز محیط آمینو اسید فلورسانت در ساختار آنزیم کراتینیناز در حضور نانوذرات طلا، این ترکیب­های گزینه مناسبی جهت پایداری آنزیم کراتینیناز نیستند. لذا استفاده از روش­ها و ترکیب­های دیگر جهت پایدارسازی آنزیم کراتینیناز به­منظور استفاده در کیت­های تجاری سنجش کراتین و کراتینین توصیه می­گردد.
سپاسگزاری
نویسندگان این مقاله از همکاری آزمایشگاه الکتروشیمی دانشگاه تهران که در انجام این طرح تحقیقاتی همکاری لازم را داشته­اند تقدیر و تشکر می­نمایند.
تضاد منافع
بدین­وسیله نویسندگان مقاله تصریح می­نمایند که هیچ­گونه تعارض منافعی در قبال مطالعه حاضر وجود ندارد.

































منابع
1. Rosano GL, Morales ES, Ceccarelli EA. New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5year update. Protein science. 2019 Aug;28(8):1412-22.
2. Puetz J, Wurm FM. Recombinant proteins for industrial versus pharmaceutical purposes: a review of process and pricing. Processes. 2019 Jul 24;7(8):476.
3. Hinkel LA, Willsey GG, Lenahan SM, Eckstrom K, Schutz KC, Wargo MJ. Creatine utilization as a sole nitrogen source in Pseudomonas putida KT2440 is transcriptionally regulated by CahR. bioRxiv. 2021 Jan 1.
4. Kong J, Li Z, Zhang H, Gao XD, Nakanishi H. Production of encapsulated creatinase using yeast spores. Bioengineered. 2017 Jul 4;8(4):411-9.
5. Rikitake, K., et al., Creatinine amidohydrolase (creatininase) from Pseudomonas putida: ePurification and some properties. The Journal of Biochemistry, 1979. 86(4): p. 1109-1117.
6. Tabata M, Totani M, Endo J. Coimmobilized enzyme columns in determining serum creatinine using creatininase, creatinase and sarcosine oxidase by flow-injection analysis and chemiluminescence detection. Analytica chimica acta. 1992 Jun 5;262(2):315-21.
7. Hou GS, Lin Y, Liang SL. Expression of Creatininase from Pseudomonas putida in Escherichia coli and Its Enzymatic Characteristics Analysis. Xiandai Shipin Keji. 2017;33:77-82.
8. Luo Y, Bai CC, Liu MX, Wang D, Chen MY, Yu SS, Bu XY, Wang XH. PEGylation of boronate-affinity-oriented surface imprinting magnetic nanoparticles with improved performance. Talanta. 2022 Feb 1;238:122992.
9. Treetharnmathurot B, Ovartlarnporn C, Wungsintaweekul J, Duncan R, Wiwattanapatapee R. Effect of PEG molecular weight and linking chemistry on the biological activity and thermal stability of PEGylated trypsin. International journal of pharmaceutics. 2008 Jun 5;357(1-2):252-9.
10. Sun M, Cheng G, Ge X, Chen M, Wang C, Lou L, Xu X. Aqueous Hg (II) immobilization by chitosan stabilized magnetic iron sulfide nanoparticles. Science of the Total Environment. 2018 Apr 15;621:1074-83.
11. Stepankova V, Bidmanova S, Koudelakova T, Prokop Z, Chaloupkova R, Damborsky J. Strategies for stabilization of enzymes in organic solvents. Acs Catalysis. 2013 Dec 6;3(12):2823-36.
12. Iyer PV, Ananthanarayan L. Enzyme stability and stabilization—aqueous and non-aqueous environment. Process biochemistry. 2008 Oct 1;43(10):1019-32.
13. Moehlenbrock MJ, Minteer SD. Introduction to the field of enzyme immobilization and stabilization. InEnzyme stabilization and immobilization 2017 (pp. 1-7). Humana Press, New York, NY.
14. Verma A, Nakade H, Simard JM, Rotello VM. Recognition and stabilization of peptide α-helices using templatable nanoparticle receptors. Journal of the American Chemical Society. 2004 Sep 8;126(35):10806-7.
15. Lakowicz JR, editor. Principles of fluorescence spectroscopy. Springer science & business media; 2013 Apr 17.
16. Hellmann N, Schneider D. Hands on: using tryptophan fluorescence spectroscopy to study protein structure. InProtein Supersecondary Structures 2019 (pp. 379-401). Humana Press, New York, NY.
17. He F. Bradford protein assay. Bio-protocol. 2011 Mar 20:e45-.
18. Grace AN, Pandian K. Antibacterial efficacy of aminoglycosidic antibiotics protected gold nanoparticles—A brief study. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 2007 Apr 5;297(1-3):63-70.
19. Appleyard G, Woods DD. The pathway of creatine catabolism by Pseudomonas ovalis. Microbiology. 1956 Apr 1;14(2):351-65.
20. Amini-Bayat Z, Bakhtiari N. Cloning, Expression and Purification of Creatininase From Pseudomonas Pseudoalkaligene KF707 in E. coli. Biomacromolecular Journal. 2017 Jul 1;3(1):75-82.
21.  Nishiya Y. Structural comparison of creatinases for investigating substrate binding. Int J Anal Bio-Sci Vol. 2014;2(4).
22. Berberich JA, Chan A, Boden M, Russell AJ. A stable three-enzyme creatinine biosensor. 3. Immobilization of creatinine amidohydrolase and sensor development. Acta Biomaterialia. 2005 Mar 1;1(2):193-9.
23. Bai X, Li D, Ma F, Deng X, Luo M, Feng Y, Yang G. Improved thermostability of creatinase from Alcaligenes Faecalis through non-biased phylogenetic consensus-guided mutagenesis. Microbial cell factories. 2020 Dec;19(1):1-3.






 
نوع مطالعه: مقاله مروری | موضوع مقاله: میکروبیولوژی
دریافت: 1400/12/25 | پذیرش: 1401/7/10 | انتشار: 1401/7/10

ارسال نظر درباره این مقاله : نام کاربری یا پست الکترونیک شما:
CAPTCHA

ارسال پیام به نویسنده مسئول


بازنشر اطلاعات
Creative Commons License این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است.

کلیه حقوق این وب سایت متعلق به مجله تازه های بیوتکنولوژی سلولی - مولکولی می باشد.

طراحی و برنامه نویسی : یکتاوب افزار شرق

© 2024 CC BY-NC 4.0 | New Cellular and Molecular Biotechnology Journal

Designed & Developed by : Yektaweb