New Cellularand Molecular Biotechnology Journal

fa تکثیر و همسانه سازی ژن سه قسمتی lsc در وکتور pcDNA3.1 و بررسی بیان آن در لاین سلولی PCR and cloning of the lcs chimeric gene in pcDNA3.1 vector and its expression in the cell line سلولی و مولکولی Cellular and molecular مقاله پژوهشی Research Article سابقه‌ و هدف: اسهال دومین عامل رایج مرگ و میر کودکان زیر 5 سال است. مهمترین سویههای بیماریزایی اشریشیاکلی انتروتوکسیژنیک با تولید سم Lt و St موجب بیماری اسهال مسافران و اشریشیاکلی انتروهموراژیک با ترشح سم شبه شیگا موجب اسهال خونی میشود. زیرواحد B انتروتوکسین کلره در باکتری ویبریوکلرا در ایجاد بیماری اسهال نقش بهسزایی دارد.بهاحتمال با ترکیب اپی-توپهای CtxB، LtB و StB (LSC) و تولید واکسن تری والان میتوان آنتیبادی اختصاصی تری برای مقابله با این سموم ایجاد کرد. هدف از این تحقیق تکثیر ژن کایمر lsc جهت کلونینگ در وکتور pcDNA3.1(+) بهمنظور طراحی DNA واکسن و بررسی بیان در وکتور یوکاریوتیک است.   مواد و روش ها: توالی ژن lsc پس از طراحی پرایمر و تکثیر بهوسیله PCR به وکتورpcDNA3.1(+) منتقل شد. وکتور pcDNA3.1(+) و محصول PCR با استفاده از آنزیم HindIII و EcoRI مورد هضم قرار گرفت. کلونینگ ژن lsc در وکتورpcDNA3.1(+) و PCR انجام شد. کلونها مورد هضم آنزیمی قرار گرفتند. جهت اطمینان از بیان ژن lsc به سلول HEK-293T منتقل و با استفاده از روش وسترن بلاتینگ مورد تأیید قرار گرفت.   یافته ها: ژن lsc پس از PCR و کلونینگ در وکتورpcDNA3.1(+) با استفاده از هضم آنزیمی مورد تأیید قرار گرفت و قطعهای بهطول  bp933 رویت و تأیید شد. سپس با استفاده از کیت توربوفکت به سلول HEK-293T منتقل و بیان پروتئین نوترکیب به روش وسترن بلاتینگ مورد تأیید قرار گرفت و پروتئین به وزن 39 کیلودالتون تأیید شد.   نتیجه‌گیری: نتایج بهدست آمده از ژن کایمر بهخوبی در لاین سلولی بیان و توسط وسترن بلاتینگ تأیید شد که میتواند کاندید مناسبی برای مقابله با عفونت باکتریایی باشد. Aim and Background: Diarrhea is the second most common cause of under-5 mortality. The most important strains of Entrotoxigenic Escherichia coli causing Lt and St toxin cause diarrhea and Entrohemoragic E.coli causing Shiga-like toxin secretion. Chlorine enterotoxin B subunit (Ctx) plays a key role in the development of diarrhea in Vibrio cholerae. More specific antibodies could be developed to counter these toxins by combining the CtxB, LtB and StB (LSC) epitopes and the production of trivalent vaccine. The aim of this study was to cloning lsc gene into pcDNA3.1 to design a vaccine DNA. Materials and Methods: The lsc gene sequence was transferred to pcDNA3.1(+) vector after primer design and amplification by PCR. The pcDNA3.1(+) vector and the PCR product were digested using HindIII and EcoRI enzymes. Cloning of lsc gene was performed in pcDNA3.1(+) vector and PCR. The clones were digested enzymatically. To ensure expression of lsc gene, it was transferred to HEK-293T cell and confirmed by Western blotting. Results: The lsc gene was confirmed by PCR and cloning in pcDNA3.1(+) vector using enzymatic digestion and a fragment length of 933 bp was detected and confirmed. Transfection kit was then transferred to HEK-293T cell and expression of the recombinant protein was confirmed by Western blotting and the protein was 39 kDa. Conclusion: The results of the chimeric gene are well expressed in the cell line and confirmed by Western blotting that can be a good candidate for the fight against bacterial infection. همسانه‌سازی, ژن lsc, DNA واکسن, IAU science Cloning, lsc gene, DNA vaccine, IAU science 83 94 http://ncmbjpiau.ir/browse.php?a_code=A-10-1367-4&slc_lang=fa&sid=1 Sepideh Saroughi سپیده ساروقی 100319475328460011763 100319475328460011763 Yes Department of Genetics, Payam Noor University, Tehran, Iran گروه ژنتیک، دانشگاه پیام نور واحد ری، تهران، ایران Maryam Zare مریم زارع 100319475328460011764 100319475328460011764 No Department of Biology, Payam Noor University , Tehran, Iran. گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه پیام نور تهران، ایران. Rouhollah Kazemi روح الله کاظمی 100319475328460011765 100319475328460011765 No Green Gene Company, Tehran, Iran شرکت ژن سبز، تهران، ایران. Mohammad-Javad Motamedi جواد معتمدی 100319475328460011766 100319475328460011766 No Green Gene Company, Tehran, Iran شرکت ژن سبز، تهران، ایران. Jafar Amani جعفر امانی jafar.amani@gmail.com 100319475328460011767 100319475328460011767 No Chemical Injuries Research Center, Baqiyatallah University of Medical Sciences, Tehran, Iran انستیتو سیستم بیولوژی و مسمومیت‌ها، مرکز تحقیقات میکروبیولوژی کاربردی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله (عج)، تهران، ایران.