New Cellularand Molecular Biotechnology Journal

fa سنتز کمپلکس نیکل (II) تثبیت شده بر نانوذرات مغناطیسی و ارزیابی کارایی آن در جداسازی پروتئین‌های OPH وOmpW Synthesis of nickel (II) complex stabilized on magnetic nanoparticles and evaluation of its efficiency in separating OPH and OmpW proteins فیزیولوژی Physiology مقاله پژوهشی Research Article سابقه و هدف: تخلیص پروتئین با بازده و خلوص بالا چالشی جدی در تهیه پروتئینهای نوترکیب است. این مطالعه یک استراتژی آسان و جدید جهت ساخت و توصیف میکروکرههای مغناطیسی متشکل از یک هسته مغناطیسی پوششدار شده با سیلیکا و یک پوسته پلیوینیلاستات اصلاح شده با ایمینودیاستیکاسید و کمپلکس شده با Ni2+، ((Fe3O4@SiO2@PVA@IDA-Ni2+، برای جداسازی و تخلیص پروتئین ارگانوفسفر هیدرولاز  (OPH)و پروتئین غشاء خارجی<a href="#_ftn1" name="_ftnref1" title="">[1]</a> (OmpW) حاوی هیستیدین ارائه می دهد. مواد و روش ها: نانوذرات در چهار مرحله زیر سنتز شدند: 1) سنتز نانوذرات وینیل دار ،(2) پیوند پلی وینیل الکل(PVA)  به این نانوذرات، (3) تبدیل گروه های هیدروکسیل PVA به اسید ایمینودی استیک و (4) کلات شدن با یونهای نیکل برای تشکیل گروههای کیلیت. خصوصیات ساختاری و شاخصهای فیزیکوشیمیایینانوذرات توسط آنالیزهایFTIR،DLS ، SEM ، TEM،EDX ، TGAو  VSM تعیین شد. زیر واحدهای پروتئین نوترکیب(OPH) و OmpW بهصورت نوترکیب بیان شده و تخلیص گردیدند و ساختار آنها مورد تایید قرار گرفت. در این مطالعه ژن کدکننده پروتئین نوترکیب OPH و OmpW در ناقل بیانی pet-26b (+) کلون شدند و در E.coli BL21 (DE3)  به عنوان میزبان بیان و به محیط کشت باکتری ترشح گردیدند. بیان ژن و فرآیندخالصسازی از طریق سدیم دودسیلسولفات-ژلپلیآکریلآمید ( (SDS-Pageو تست برادفورد ((Bradford ارزیابی شد. یافته ها: طبق نتایج، نانوذرات پلیمری مغناطیسی دارای ساختار کروی و یکنواخت، با خاصیت مغناطیسی بالا، محلهای اتصال فراوان و فرآیند سنتز آسان است. طبق تصاویر SEM قطرمتوسط نانوساختار در محدودهnm  19/56-62/24 مشاهده شد. تشکیل نانوساختار Fe3O4@SiO2@PVA/IDA-Ni2+ با پیکهای مشخص درCm-11405و1600 مربوط به ارتعاش کششی متقارن و نامتقارن گروه O=C−O− و حذف پیک در Cm-11740 تأیید شد. این نانوساختار درجه بالایی از بازیابی باندهای پروتئینی بدون توجه به طبیعت پروتئین نشان داد. پروتئینهای OmpW وOPH به عنوان پروتئین نوترکیب با برچسب هیستیدین بیان و با استفاده از نانوساختار نهایی خالص شدند. نتیجه گیری: با توجه به نتایج SDS-PAGE، وضوح بالایی در جداسازی پروتئین وجود داشت. نانوساختار سنتز شده دارای حداکثر ظرفیت جذب پروتئین حدود 25/1 میلیگرم پروتئین در هر میلیگرم نانوذرات میباشد. <div>  <hr align="left" size="1" width="33%" ></div> <div class="WordSection1" dir="RTL" style="text-align: left;">Abstract</div> <div class="WordSection2" dir="RTL" style="text-align: left;">Background and purpose: High efficiency and purity protein purification is a serious challenge in the production of recombinant proteins. This study is proposing an easy and new strategy for fabricating and describing magnetic microspheres consisting of a silica-coated magnetic core and a polyvinyl acetate shell modified with iminodiastic-acetic acid and complexed with Ni2+, (Fe3O4@SiO2@PVA@IDA-Ni2+) for the separation and purification of organophosphorus hydrolase (OPH) protein and histidine-containing outer membrane protein (OmpW). Materials and Methods: The nanoparticles were synthesized in the following four steps: 1) synthesis of nanoparticles with vinyl groups on their surface, 2) grafting of polyvinyl alcohol (PVA) to these particles, 3) conversion of the hydroxyl groups of PVA to iminodiacetic acid, and 4) charging with nickel ions to form chelate groups. Structural properties and physicochemical parameters of nanoparticles were determined by FTIR, DLS, SEM, TEM, EDX, TGA and VSM analyzes. Recombinant protein subunits OPH and OmpW were expressed and purified as recombinant and their structure was confirmed. In this study, the genes encoding the recombinant proteins OPH and OmpW were cloned into the expression vector pet-26b (+) and expressed in E. coli BL21 (DE3) as a host and secreted into bacterial culture medium. Gene expression and purification were assessed by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel (SDS-Page and Bradford test).</div> <pre dir="rtl" style="text-align: left;"> Results: The results confirm that uniform and spherical magnetic polymer nanoparticles with high magnetization and superparamagnetic properties were successfully synthesized. According to the SEM images, the average diameter of the nanostructure was observed in the range of 24.56-62.19 nm. The formation of Fe3O4@SiO2@PVA/IDA-Ni2+ nanoparticles was confirmed by the peaks identified at 1405 and 1600 Cm-1 corresponding to the symmetric and asymmetric stretching vibration of the O=C−O− group and the removal of the peak at 1740 Cm-1. These microspheres showed a high degree of recovery of protein bands regardless of the nature of the protein. OmpW and OPH proteins as a His-tagged recombinant protein were expressed and purified using the final nanoparticles. </pre> <div dir="rtl" style="text-align: left;">Conclusion: According to the SDS-PAGE results, there was a high degree of resolution in protein separation. The synthesized nanoparticles have a high protein binding capacity of about 1.25 mg of protein per mg of nanoparticles.  </div> نانوذرات مغناطیسی, جداسازی پروتئین, پوشش پلیمری, پلیوینیلالکل, کیلیت فلزی, .Iau Science Magnetic nanoparticles, Protein separation, Polymer coating, Polyvinyl alcohol, Metal chelating, Iau Science. 81 98 http://ncmbjpiau.ir/browse.php?a_code=A-10-1821-2&slc_lang=fa&sid=1 Maedeh Faraji مائده فرجی 100319475328460014473 100319475328460014473 No Manzarbanou Asnaashariisfahani منظر بانو اثنی عشری اصفهانی 100319475328460014474 100319475328460014474 No Habibollah Baharvand حبیب الله بهاروند h.baharvand@ippi.ac.ir 100319475328460014475 100319475328460014475 Yes 2. Faculty of Polymer Science, Iran Polymer and Petrochemical Institute 2. دانشکده علوم پلیمر، پژوهشگاه پلیمر و پتروشیمی ایران Hassan Kabiri Fard حسن کبیری فرد 100319475328460014476 100319475328460014476 No