fa کلون کردن قطعه اتصالی m2e آنفلوانزا- ctxB ویبریو کلرا در پلاسمید pET28a ژنتیک Genetics مقاله پژوهشی Research Article <p><strong>سابقه و هدف: </strong>از آنجا که دومین خارجی پروتئین ماتریکس آنفلونزا ایمونوژن ضعیفی است انتخاب مناسبی جهت تولید واکسن نمی باشد. زیرواحد B انتروتوکسین وبا بخش غیر سمی و موجب اتصال هولوتوکسین به GM1 موجود در سطح سلول های اپیتلیال روده می شود. CTB به شدت ایمونوژن می باشد. از اینرو اتصال این دو ژن کاربرد زیادی در تهیه واکسن نوترکیب آنفلونزا خواهد داشت. </p><p><strong>مواد و روش ها: </strong>از طریق PCR و با استفاده از پرایمر های اختصاصی حاوی جایگاه برش آنزیم محدود کننده ژن <i>ctxB </i><i />تکثیر شد. سویه استاندارد آنفلونزا نوع A ( A/ <i>PUERTO RICO </i>/8/34 ) تهیه و ژن <i>M2e </i><i />از طریق RT-PCR و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی حاوی جایگاه برش تکثیر گردید. جهت اتصال دو ژن <i>ctxB </i>و <i>M2e </i>واکنش PCR دوم به وسیله پرایمر R ژن <i>ctxB </i>و پرایمر F ژن <i>M2e </i>انجام گرفت. محصول PCR با استفاده از آنزیم های BamH1 و EcoR1 هضم و در وکتور pET28a کلون گردید. تائید کلونینگ با استفاده تعیین توالی صورت گرفت. پس از تائید، وکتور نوترکیب pET28a/M2e-ctxB در باکتری <i>E.coli </i>سویه Top10 ترانسفورم گردید. تائید نهایی فیوژن، کلونینگ و ترانسفورمیشن از طریق PCR کلنی، هضم آنزیمی و تعیین توالی صورت گرفت. </p><p><strong>یافته ها: </strong>آنالیز توالی نشان داد ژن <i>M2e </i>در فریم مناسب به ژن <i>ctxB </i>متصل شده بود. علاوه بر این ژن حاصل در محل برش آنزیم های BamH1 و EcoR1 در وکتور pET28a کلون گردیده بود. </p><p><strong>نتیجه گیری: </strong>از آنجا که توالی ژن <i>M2e </i>آنفلونزا دچار تغییرات آنتی ژنیک سالیانه نمی شود کاندید مناسبی جهت تولید واکسن آنفلونزا می باشد.با توجه به اینکه M2e ایمونوژن بسیار ضعیفی می باشد فیوژن آن با ایمونوژن های قوی مانند CTB می تواند روشی نوین در تهیه واکسن نوترکیب آنفلونزا باشد. </p> <p><strong> Aim and background.  </strong>The extra domain of the M2 protein of influenza is a weak immunogen, Hence this is not a suitable candidate for the vaccine development. The B subunit of the Cholera enterotoxin is nontoxic causing attachment of the holotoxin to the GM1 at the surface of the epithelial intestine cells, while, CTB is highly immunogenic. So fusion of these two genes would be very applicable in influenza vaccine development. </p><p><strong>Material and methods: </strong>using PCR with specific primers including restriction sites <i>ctxB</i> was amplified. Standard strain of influenza type A ( A/ <i>PUERTO RICO </i>/8/34 ) was prepared and M2e was amplified using RT-PCR with specific primers. The second PCR reaction was performed for the fusion of the <i>M2e</i> and <i>ctxB</i> using the F primer of <i>M2e</i> and R primer of <i>ctxB</i>. PCR product was digested with BamH1 and EcoRI and cloned into the pET28a. Verification of the cloning was performed using sequence analyzing. After analysis, the recombinant pET28a/M2e-ctxB was transferred into <i>E.coli</i> Top10. The final confirmation was performed using colony PCR, double digesting and sequence analysis. </p><p><strong>Results: </strong>Sequence analysis showed that M2e has been fused to <i>ctxB </i>in an exact frame. Moreover the fused gene was cloned into the restriction site of the BamH1 and EcoR1 in pET28a. </p><p><strong>Discussion </strong>: Despite stability of the sequence of M2e it is not immunogen but fusion to strong immunogens such as CTB would be a new suggestion for Influenza recombinant vaccine production. </p> پروتئین ماتریکس 2، آنفلونزا، واکسن نوترکیب، زیر واحد B توکسین وبا، فیوژن Matrix protein 2, Influenza, Recombinant vaccines, Cholera toxin B subunit, Fusion 29 35 http://ncmbjpiau.ir/browse.php?a_code=A-10-61-48&slc_lang=fa&sid=1 Nima Mirzaei نیما میرزایی nm_mirzaei@yahoo.com 10031947532846002077 10031947532846002077 Yes Young researcher club, Isalamic Azad university, Science and research branch دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات تهران، باشگاه پژوهشگران جوان، تهران، ایران Farhad Rezaei فرهاد رضائی 10031947532846002078 10031947532846002078 No Student of PhD, Department of Vorulogy, Tehran university of medical sciences دانشگاه علوم پزشکی تهران، گروه ویروس شناسی، تهران، ایران