fa بهبود و توسعه میزان بیان ، حلالیت و تسهیل تخلیص آنزیم نوترکیب پروتئاز (rPR) ویروس HIV با روش TOPO-Cloning در باکتری B‏L21 E.coli ژنتیک Genetics مقاله پژوهشی Research Article <p dir="RTL" style="text-align: justify;"><strong>سابقه و هدف :</strong> پروتئاز <span dir="LTR">HIV</span> نقش مهمی در بلوغ ویروس و تحریک پاسخ ایمنی میزبان دارد. به همین دلیل می&shy;تواند هم به عنوان یک هدف درمانی و هم در تست های تشخیصی کاربرد داشته باشد. در مطالعات قبلی، تولید <span dir="LTR">rPR</span> با مشکلاتی مثل سمیت، آبگریز بودن و تخلیص روبرو بوده است. هدف از این مطالعه، استفاده از سیستم بیانی <span dir="LTR">pET102/D.TOPO</span> برای غلبه بر مشکلات اشاره شده بود.</p> <p dir="RTL" style="text-align: justify;"><strong>مواد و روش ها</strong><strong>:</strong> پس از جداسازی ژن پروتئاز از ژنوم <span dir="LTR">HIV</span>، فرایند کلونینگ با استفاده از سیستم <span dir="LTR">TOPO Cloning</span> در وکتور بیانی <span dir="LTR">pET102/D</span><span dir="LTR">.TOPO</span> انجام شد. بعد از القای بیان ژن با <span dir="LTR">IPTG</span>، پروتئین تولید شده با&nbsp; استفاده از روش کروماتوگرافی حاوی ستون <span dir="LTR">Ni-NTA</span> تخلیص شد و غلظت آن با استفاده از کیت بررسی پروتئین <span dir="LTR">BCA</span> سنجیده شد. تولید پروتئین نوترکیب با <span dir="LTR">SDS-PAGE</span> و وسترن بلاتینگ بررسی شد.</p> <p dir="RTL" style="text-align: justify;"><strong>یافته&shy; ها :</strong> کلونینگ ژن پروتئاز<span dir="LTR">HIV-1 </span>&nbsp;با استفاده از سیستم &nbsp;کلونینگ&nbsp; <span dir="LTR">TOPO</span> در وکتور بیانی <span dir="LTR">pET102/D</span> بوسیله <span dir="LTR">PCR</span> با موفقیت صورت گرفت و با <span dir="LTR">&nbsp;sequencing</span> تایید شد. غلظت <span dir="LTR">rPR</span> پس از تخلیص بین 60 تا 85 میکروگرم در میلی لیتر بود. بیان و تولید <span dir="LTR">rPR</span> به شکل محلول، با موفقیت انجام شد. و &nbsp;با <span dir="LTR">SDS-PAGE</span> و وسترن بلات تایید شد.</p> <p style="text-align: justify;"><strong><span dir="RTL">بحث و نتیجه گیری :</span> </strong><span dir="RTL">در سیستم کلون سازی مورد استفاده به دلیل بیان </span>rPR<span dir="RTL"> به صورت فیوز شده با تیوردوکسین و دارای برچسپ&shy;های هیستیدینی، مشکل سمیت،آبگریز بودن و تخلیص تا حد زیادی برطرف شد. با توجه به میزان </span>rPR<span dir="RTL"> تولید شده، می&shy;توان از آن در تست های تشخیصی و </span><span dir="RTL">جهت </span><span dir="RTL">بررسی و طراحی مهارکننده های پروتئاز در </span><span dir="RTL">مطالعات بعدی </span><span dir="RTL">استفاده کرد. </span></p> <p dir="rtl" style="text-align: left;"><strong>Aim and Background</strong><strong>:</strong> HIV protease plays an important role in the maturation of the virus and host immune response stimulation; therefore it is important as a therapeutic target and can be used in diagnostic tests. In previous studies, producing rPR has been faced with problems such as toxicity, hydrophobic and purification. The purpose of this study is the use of expression system pET102/D.TOPO to overcome the mentioned problems. &nbsp;</p> <p dir="rtl" style="text-align: left;"><strong>Methods:</strong> Protease gene was isolated from the serum of an infected individual. Cloning process was performed by TOPO Cloning system. Protease gene transformed into <em>E.coli</em> BL21and induced with IPTG. Produced recombinant protein was purified by affinity chromatography (Ni-NTA column). Protein concentration was checked by BCA protein assay kit. Recombinant protein was identified by <em>SDS</em>-<em>PAGE</em> and western-blotting.</p> <p dir="rtl" style="text-align: left;"><strong>Results:</strong> HIV-1 protease gene Cloning using TOPO Cloning vector expression system pET102 / D was confirmed by PCR and sequencing. rPR concentration after purification was 60 to 85 micrograms per milliliter. rPR Expression and Immunogenicity by SDS-PAGE and Western blotting were confirmed.</p> <p dir="rtl" style="text-align: left;"><strong>Conclusion:</strong> Expression and production of rPR in soluble form was a success. In used Cloning system, because of the expression of rPR in fused form with thioredoxin and histidine tags, problems of toxicity, hydrophobicity and purification were noticeably solved. According to the generated rPR, it can be used to evaluate the diagnostic tests and for designing protease inhibitors in subsequent studies.</p> HIV, کلون سازی مولکولی, پروتئاز, پروتئین نوترکیب Human Immunodeficiency Virus, TOPO Cloning, protease, recombinant protein 21 28 http://ncmbjpiau.ir/browse.php?a_code=A-10-629-2&slc_lang=fa&sid=1 Asaad Azarnezhad اسعد آذر نژاد 10031947532846005388 10031947532846005388 No Department of Medical Biotechnology, Allied Medical Sciences, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, I.R. Iran گروه بیوتکنولوژی پزشکی، دانشکده پیراپزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران Arshad Hosseini ارشد حسینی ash-hosseini@tums.ac.ir 10031947532846005389 10031947532846005389 Yes Department of Medical Biotechnology, Allied Medical Sciences, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, I.R. Iran گروه بیوتکنولوژی پزشکی، دانشکده پیراپزشکی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران Zohreh Sharifi زهره شریفی 10031947532846005390 10031947532846005390 No Department of Medical Biotechnology, Faculty of School of Allied Medical Sciences, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, I.R. Iran مرکز تحقیقات انتقال خون، موسسه تحقیق و پژوهش در انتقال خون، تهران ، ایران