New Cellularand Molecular Biotechnology Journal

fa استخراج آنزیم کراتینیناز و بررسی اثر غلظت های مختلف نانوذرات طلا بر فعالیت آنزیم Extracting the creatininease enzyme and investigating the effect of different concentrations of gold nanoparticles on the enzyme activity میکروبیولوژی Microbiology مقاله مروری Review Article سابقه و هدف: استفاده از آنزیم کراتینیناز یک روش آنزیمی جهت سنجش میزان کراتین و کراتینین در مایعات بدن با هدف بررسی سلامت کلیه ها است. هدف از این تحقیق، بررسی اثر نانوذرات طلا بر فعالیت و پایداری آنزیم کراتینیناز به جهت استفاده در کیت های سنجش کراتین و کراتینین است. مواد و روش ها: در این مطالعه ابتدا باکتری E.Coli BL21  حاوی وکتور تکثیری pET28a حاوی ژن آنزیم کراتینیناز در محیط LB مایع کشت و سپس در دمای 28 درجه القا بیان گردید. در ادامه پس از سونیکاسیون، تخلیص آنزیم  با کمک کروماتوگرافی تمایلی انجام شد. پس از تایید بیان با SDS-PAGE ، غلظت آنزیم بیان شده با روش برادفورد سنجش شد. در ادامه فعالیت آنزیم با روش رنگ سنجی در حضور و عدم حضور نانوذرات طلا بررسی و مقایسه گردید. نهایتا اثر نانوذرات طلا بر ساختار آنزیم کراتینیناز با روش طیف سنجی فلورسانس، بررسی گردید. یافته ها: فعالیت آنزیم کراتینیناز در عدم حضور نانوذرات طلا U/ml 6/14  و در حضور نانوذرات طلا با غلظت های 97/1، 94/3، 88/7، 82/11، 76/15، 7/19و 4/39 نانوگرم بر لیتر به ترتیب U/ml 1/14، 4/12، 2/11، 1/10، 4/8، 5/7، 7/4 محاسبه گردید که نشان از کاهش فعالیت آنزیم کراتینیناز در حضور نانوذرات طلا دارد. از طرفی طیف سنجی فلورسانس آنزیم کراتینیناز در حضور و عدم حضور نانوذرات طلا در طول موج تهییج 295 نانومتر کاهش شدت فلورسانس در حضور نانوذرات طلا را نشان داد. نتیجه گیری: نانوذرات طلا باعث کاهش فعالیت آنزیم کراتینیناز شدند. همچنین نانوذرات طلا باعث کاهش شدت فلورسانس آنزیم کراتینیناز گردیدند که می تواند نشانگر تغییر در ریزمحیط اسیدآمینه تریپتوفان در ساختار آنزیم کراتینیناز باشد، در نتیجه استفاده از نانوذرات طلا گزینه مناسبی برای پایدارسازی فعالیت و ساختار آنزیم کراتینیناز جهت استفاده در کیت های تجاری نیستند. اهداف: استفاده از آنزیم کراتینیناز یک روش آنزیمی جهت سنجش میزان کراتین و کراتینین در مایعات بدن با هدف بررسی سلامت کلیه ها است. هدف از این تحقیق، بررسی اثر نانوذرات طلا بر فعالیت و پایداری آنزیم کراتینیناز به جهت استفاده در کیت های سنجش کراتین و کراتینین است. مواد و روش ها: در این مطالعه ابتدا باکتری E.Coli BL21  حاوی وکتور تکثیری pET28a حاوی ژن آنزیم کراتینیناز در محیط LB مایع کشت و سپس در دمای 28 درجه القا بیان گردید. در ادامه پس از سونیکاسیون، تخلیص آنزیم  با کمک کروماتوگرافی تمایلی انجام شد. پس از تایید بیان با SDS-PAGE ، غلظت آنزیم بیان شده با روش برادفورد سنجش شد. در ادامه فعالیت آنزیم با روش رنگ سنجی در حضور و عدم حضور نانوذرات طلا بررسی و مقایسه گردید. نهایتا اثر نانوذرات طلا بر ساختار آنزیم کراتینیناز با روش طیف سنجی فلورسانس، بررسی گردید. یافته ها: فعالیت آنزیم کراتینیناز در عدم حضور نانوذرات طلا U/ml 6/14  و در حضور نانوذرات طلا با غلظت های 97/1، 94/3، 88/7، 82/11، 76/15، 7/19و 4/39 نانوگرم بر لیتر به ترتیب U/ml 1/14، 4/12، 2/11، 1/10، 4/8، 5/7، 7/4 محاسبه گردید که نشان از کاهش فعالیت آنزیم کراتینیناز در حضور نانوذرات طلا دارد. از طرفی طیف سنجی فلورسانس آنزیم کراتینیناز در حضور و عدم حضور نانوذرات طلا در طول موج تهییج 295 نانومتر کاهش شدت فلورسانس در حضور نانوذرات طلا را نشان داد. نتیجه گیری: نانوذرات طلا باعث کاهش فعالیت آنزیم کراتینیناز شدند. همچنین نانوذرات طلا باعث کاهش شدت فلورسانس آنزیم کراتینیناز گردیدند که می تواند نشانگر تغییر در ریزمحیط اسیدآمینه تریپتوفان در ساختار آنزیم کراتینیناز باشد، در نتیجه استفاده از نانوذرات طلا گزینه مناسبی برای پایدارسازی فعالیت و ساختار آنزیم کراتینیناز جهت استفاده در کیت های تجاری نیستند.   Aim and Background: The use of creatininase is an enzymatic method for measuring amount of creatine and creatinine in body fluids to assess kidney health. The aim of this study was to investigate the effect of gold nanoparticles on the activity and stability of creatininase enzyme for use in creatine and creatinine assay kits. Materials & Methods: In this study, E. coli BL21 containing pET28a amplification vector containing creatininase gene was first cultured in liquid LB medium and then induced at 28°C. After sonication, purification of enzyme was performed by affinity chromatography.  After confirmation of expression by SDS-PAGE, The expressed enzyme concentration was measured by Bradford method. Then the activity of the enzyme was examined and compared by colorimetric method in the presence and absence of gold nanoparticles. Finally, the effect of gold nanoparticles on the structure of creatininase enzyme was investigated by fluorescence spectroscopy. Results: Creatininase activity in the absence of gold nanoparticles 14.6 U/ml and in the presence of gold nanoparticles with concentrations of 1.97, 3.94, 7.88, 11.82, 15.76, 19.7 and 39.4 ngr/l 14/1, 12.4, 11.2, 10.1, 8.4, 7.5, 4.7 U/ml were calculated which indicates a decrease in creatininase activity in the presence of gold nanoparticles. On the other hand, fluorescence spectroscopy of creatininase in the presence and absence of gold nanoparticles at the excitation wavelength of 295 nm showed a decrease in fluorescence intensity in the presence of gold nanoparticles. Conclusion: Gold nanoparticles reduced the activity of the creatininase enzyme. Gold nanoparticles also reduced the fluorescence intensity of creatininase enzyme, which could indicate a change in the microenvironment of the amino acid tryptophan in the structure of the creatininase enzyme, so using gold nanoparticles is not a good option for stable structure and activity of creatininase for use in commercial kits.   کراتینیناز, بیان, نانوذرات طلا, رنگ سنجی, طیف سنجی فلورسانس Iau Science. Creatininase, Expression, Gold nanoparticles, Colorimetry, Fluorescence spectroscopy, Iau Science. 47 58 http://ncmbjpiau.ir/browse.php?a_code=A-10-1452-5&slc_lang=fa&sid=1 Shirin Jalili شیرین جلیلی 100319475328460013443 100319475328460013443 No Policing sciences and social studies research institute, Tehran. Iran. پژوهشگاه علوم انتظامی و مطالعات اجتماعی ناجا، تهران، ایران Fereshteh Rahmati فرشته رحمتی f.rahmati@iau-tnb.ac.ir 100319475328460013444 100319475328460013444 Yes Department of Biochemistry, Faculty of Biological Sciences, North-Tehran Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran. گروه بیوشیمی، دانشکده علوم زیستی، واحد تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران. Mehdi Abdollahzadeh Parsa مهدی عبداله زاده پارسا 100319475328460013445 100319475328460013445 No Department of Biochemistry, Faculty of Biological Sciences, North-Tehran Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran. گروه بیوشیمی، دانشکده علوم زیستی، واحد تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران.