سطح گلوکاگون خون در رت­های دیابتی شده

با استرپتوزوتوسین

رحمان جعفری هفشجانی، حسین سازگار^*، نوشا ضیاء جهرمی

گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران

چکیده

سابقه و هدف: باتوجه­ به آمار بالای دیابت در ایران و جهان و هم­چنین به ­علت عوارض جانبی کم­تر گیاهان دارویی نسبت­به داروهای شیمیایی و صنعتی در این مطالعه به بررسی اثر ماده مؤثره گیاه خار مریم (سیلی­مارین) بر بیان ژن Neuro D1 که یکی از ژن­های تکوین و بازسازی سلول­های بتا وآلفا پانکراس هست هم­چنین بررسی سطح گلوکاگون خون در رت­ها، پرداختیم.

مواد و روش­ها: 42 سر رت نر نژاد ویستار به­صورت تصادفی انتخاب شدند و به هفت گروه شش تایی تقسیم شدند. رت­های دیابتی شده دوزهای مختلف سیلی­مارین و متفورمین را هر سه روز یک­بار دریافت کردند و بعد از 40 روز با کلروفوم بی­هوش کرده بعد از خون­گیری از قلب رت­ها سطح سرمی گلوکاگون توسط کیت سنجش گلوکاگون به روش الیزا اندازه­گیری شد و سپس مراحل تشریح و عمل برداشت بافت پانکراس و مراحل استخراج RNA و cDNA سازی و بررسی بیان­ژن با تکنیک Real-Time PCR انجام گردید.

یافته­ ها: نتایج این تحقیق نشان داد  STZ باعث تخریب بافت پانکراس وایجاد دیابت نوع یک می­شود. کاربرد سیلی­مارین باعث بهبود دیابت و کاهش قند خون و افزایش سطح سرمی گلوکاگون در رت­های دریافت­کننده دوزهای مختلف سیلی­مارین نسبت­به گروه کنترل منفی (دیابتی) شد. هم­چنین میزان بیان ژن NeuroD1 نسبت­به ژن GAPDH (ژن رفرنس) افزایش معنی­داری پیدا کرد.

نتیجه­ گیری: بیان­ژن  NeuroD1در رت­های دیابتی شده با STZ به­واسطه سیلی­مارین، افزایش معنی­داری را نشان می­دهد (000/0P-Value= ) که نتیجه آن بهبود بافت پانکراس و کاهش قند خون و افزایش وزن رت­ها و سیلی­مارین با بازسازی سلول­های آلفای پانکراس و هم­چنین با اتصال به پروموتر ژن گلوکاگون باعث افزایش بیان این ژن می­شود.

واژه­های کلیدی: دیابت نوع یک، استروپتوزوتوسین، گلوکاگون، سیلی­مارین، ژن NeuroD1.

جدول 1- توالی ژن Neuro D1

سپس به­وسیله سیستم Rotor-Gene6000 و با استفاده از کیت سابرمستر ریل تایم ساخت شرکت تاکارا ژاپن مطابق دستورالعمل آن استفاده شد پروتکل دمایی مورد استفاده در دستگاه Rotor-Gene6000  در روش Real-Time PCR در جدول شماره 2 آورده شده است.CTهای مربوط به واکنش توسط نرم­افزار سیستم Real-Time PCR استخراج و ثبت گردید. بعد از اتمام واکنشReal-Time PCR  سیکل آستانه هر نمونه به­صورت جداگانه به­دست آمده شد که با مقایسه سیکل آستانه ژن مورد نظر با ژن مرجع (GAPDH)، می­توان میزان بیان ژن موردنظر را به­صورت کمی از فرمول  fold change =2-∆∆ct به­دست آورد و میزان بیان ژن NeuroD1 را در هفت گروه مختلف اندازه­گیری شد.

جدول 2- پروتکل دمایی برای ژن

تجزیه و تحلیل آماری

آنالیز آماری داده­های این تحقیق با استفاده از نرم­افزار SPSS ویرایش 21 انجام شد. از آنجا که داده­ها از توزیع نرمال برخوردار بودند، با روش آنالیز واریانس یک­طرفه (ANOVA) و با آزمون پشتیبان post test LSD ارزیابی شدند و نتایج به­صورت Mean ± SEM ارائه و تفاوت بین گروه­های مختلف با 05/0>P معنی­دار تلقی شد.

یافته­ها

بررسی کیفی RNA استخراج شده

در شکل 1 RNA استخراج شده بر روی ژل دو درصد نشان داده شده است.

شکل 1- RNA تام سلولی الکتروفورز شده در ژل آگارز ۲ درصد

تغییرهای قند خون رت­ها

در ابتدا تغییرهای قند خون در گروه­های مورد مطالعه را مورد بررسی قرار گرفت. برای اندازه­گیری قند خون هر 10 روز یک بار قند خون ناشتای رت­ها (14 ساعت گرسنگی) با خون­گیری از ناحیه دم و با استفاده از دستگاه گلکومتر اندازه­گیری شد و نتایج گروه­های تیمار و شاهد در نمودار 1 آمده است.

نمودار 1- تغییرهای قند خون رت­ها

*تعداد ستاره متفاوت در هر گروه معنی­دار بودن را نشان می­دهد. (05/0P-Value< )

میزان قند خون با تزریق استرپتوزوتوسین به­شدت افزایش یافت؛ اما پس از آن با دریافت سیلی­مارین در طول مدت درمان همان­طور که مشاهده می­شود میزان قند خون در هر گروه با توجه­به میزان دوز دریافتی سیلی­مارین تغییر یافت. تغییرهای قند خون در گروه­های تحت درمان (سیلی­مارین و متفورمین)، گروه شاهد دیابتی (B) و گروه شاهد سالم (A) در طول دوره تیمار نسبت­به هم تغییرهای معنی­دار داشته و بیش­ترین تغییرها در گروه­های دریافت کننده دوز mg/kg 100 (D) و mg/kg 150 (E) نسبت­به سایر گروه­های تیمار است و تمامی گروه­ها در انتهای دوره درمان تغییرهای معناداری نسبت­به شروع دوره دیابتی شدن داشتند (05/0P-Value˂). ولی بین گروه شاهد سالم (A) و گروه سالم دریافت کننده سیلی­مارین (G) تغییر معناداری مشاهده نشد (05/0P-Value>).

نتایج Real-Time PCR

نتایج حاصل از بررسی میزان بیان ژن Neuro D1 در گروه ها  A و B

بررسی میزان بیان ژن Neuro D1 در گروه شاهد سالم (A) و گروه شاهد دیابتی به­عنوان کنترل منفی (B) نشان داد که در سطح آماری 95 درصد میزان بیان ژن Neuro D1 در رت­های دیابتی و سالم دارای اختلاف معناداری است.

(000/ 0P -Value=)

نمودار 2- بررسی میزان بیان ژن Neuro D1 در گروه  شاهد سالم و کنترل منفی

نتایج حاصل از بررسی میزان بیان ژن  NeuroD1در گروه­های A-F

بررسی میزان بیان ژن NeuroD1 در گروه­های (A-F) در نمودار 3 نشان داده شده است.

نمودار 3-  بررسی میزان بیان ژن NeuroD1در گروه­های (A-F)

*وجود تعداد ستاره­های متفاوت نشان­دهنده وجود گروه­های معنی­دار است.

با توجه­به نتایج به­دست آمده بیان ژن NeuroD1 قبل از ایجاد دیابت در همه گروه­ها بیان داشته و پس از ایجاد دیابت درگروه­های بیمار به­شدت افت پیدا کرده و بعد از استفاده از داروهای سیلی­مارین و متفورمین تا حدودی این کاهش بیان جبران شده است. هم­چنین میزان بیان این ژن در گروه شاهد دیابتی (B) که دارویی دریافت نکرده است بسیار افت پیدا کرده و نسبت­به گروه سالم شاهد (A) نتایج معنی­دار است.

میزان بیان این ژن به­ترتیب گروه دریافت کننده دوز mg/kg 50 سیلی­مارین (C)، گروه دریافت کننده دوز mg/kg 150 متفورمین (F)، گروه دریافت کننده دوز mg/kg 150 سیلی­مارین (E)، دریافت کننده دوز mg/kg 100 (D)، بیش­ترین بیان را داشته­اند؛ اما میزان بیان گروه­های D و E نسبت­به گروه­های شاهد دیابتی (B) و گروه­های بیمار دریافت کننده دوز mg/kg 50 سیلی­مارین (C) و گروه دریافت کننده دوز mg/kg 150 متفورمین (F) معنی­دار بود. (05/0P-Value˂ )؛ اما میزان بیان در گروه­های شاهد دیابتی (B) و گروه­های بیمار دریافت کننده دوز mg/kg 50 سیلی­مارین (C) و گروه دریافت کننده دوز mg/kg 150 متفورمین (F) معنی­دار نبود (05/0P-Value> ).

دوز mg/kg 100 داروی سیلی­مارین تأثیر بسزایی نسبت­به همه دوزهای تیمار سیلی­مارین و هم­چنین داروی متفورمین در بیان ژن NeuroD1 داشته است و اختلاف آن با گروه شاهد سالم معنی­دار نبود. (05/0P-Value> ). هم­چنین گروه دریافت کننده دوزهای mg/kg 100 سیلی­مارین (D) اثردهی بهتری نسبت­به دوز mg/kg 150 (E) داشته است که نشان دهنده عدم وابسته­به دوز بودن اثردهی سیلی­مارین است.به­احتمال دوز mg/kg 150 به­دلیل غلظت بالای آن توسط موش بیش­تر دفع شده است علی­رقم این یافته­ها، نیاز به انجام تحقیقات بیش­تری است.

نتایج حاصل از بررسی میزان بیان ژن NeuroD1 در گروه های A و G

بررسی میزان بیان ژن NeuroD1 در گروه­های شاهد سالم (A) و سالم دریافت کننده سیلی­مارین (G) در نمودار 4 نشان داده شده است.

نمودار 4 - بررسی میزان بیان ژن NeuroD1در گروه­های A و G

این نتایج نشان داد که میزان بیان ژن NeuroD1 در گروه سالم دریافت کننده دوز mg/kg 150 سیلی­مارین G)) نسبت به گروه سالم شاهد (A) کمی افزایش یافته ولی این افزایش بیان معنی­دار نبود (946/0P-Value= )

نتایج کلی سنجش مقادیر گلوکاگون

میانگین مقادیر پلاسمایی گلوکاگون برحسب نانوگرم/میلی­لیتر بود و با سطح معنی­داری (01/0p<) گزارش شد. آنالیز آماری داده­ها در گلوکاگون نشان داد که دوز100، رت­های سالم و تیمار با کنترل منفی ارتباط معنی­داری دارد، رت­های دریافت کننده دوز50 و متفورمین، 150 ارتباط معنی­داری با کنترل منفی ندارد (نمودار 5).

نمودار 5- تغییرها در سطوح پلاسمایی گلوکاگون در رت­ها

*وجود تعداد ستاره­های متفاوت نشان­دهنده وجود گروه­های معنی­دار است (05/0P-Value˂ ).

بحث

علت اصلی دیابت آن است که در بدن یا انسولین ساخته نمی­شود و یا این که مقدار آن به­قدری ناچیز است که نیازهای بدن را برآورده نمی­سازد. در دیابت نوع I سلول­های بتا پانکراس که انسولین ترشح می­کنند تخریب شده. در نتیجه انسولین ساخته نمی­شود و در جریان خون وجود ندارد یا مقدار آن بسیار کم است در حال حاضر بیماران مبتلا به دیابت نوع یک با تزریق روزانه انسولین، قند خود را کنترل می­کند (16).

که در این مطالعه از عصاره دانه خار مریم که حاوی ترکیب­های شیمیایی متعدد شامل چندین لیگنان فلاونوئیدی است که در مجموع به آن سیلی­مارین می­گویند که دارای قدرت آنتی­اکسیدانی بسیار قوی است، استفاده شد. سیلی­مارین به­خاطر اثرهای آنتی­اکسیدانی از تخریب سلول­های سازنده انسولین جلوگیری و سبب بهبود بافت آسیب دیده پانکراس می­شود. در تأیید این نظریه، مطالعات تجربی و کلینیکی متعدد نشان داده­اند ترکیب­های دارای خاصیت آنتی­اکسیدان دارای اثرهای مطلوبی بر روی اختلال­های متابولیکی ناشی از افزایش قند خون دارند. گیاه خار مریم باعث افزایش عملکرد آنزیم­های دفع کننده رادیکال­های آزاد در کبد می­شود. این آنزیم­ها شامل سوپر اکسید دسموتاز، گلوتاتیون پراکسیداز و کاتالازها است (18،19).

سیلی­مارین یک ترکیب فلاونوئیدی و دارای خاصیت آنتی­اکسیدانی است که اثرهای محافظتی آن بر روی پراکسیداسیون اکسیداتیو به اثبات رسیده است (20). پیش­تر نشان داده شده است که سیلی­مارین مانع از افزایش گلوکز پلاسما و پراکسیداسیون لیپید پانکراس در دیابت ناشی از آلوکسان در موش صحرایی است (21-23). علاوه­بر این مکانیسم­های محافظت کننده از سیلی­مارین شامل تعدادی از وقایع مختلف بیوشیمیایی است. نشان داده شده است که سیلی­مارین از طریق تحریک پلی­مراز I و رونویسی rRNA سنتز RNA ریبوزومی (rRNA) را افزایش می­دهد (24-26). saitoh و همکاران در سال 2007با بررسی سلول­ها بنیادی جنینی و تمایز آن­ها به سلول­های انسولین­ساز به این نتیجه رسیدند که بیان هم­زمان PDX-1 و Neurod-1 منجر به تبدیل سلول­های بنیادی جنینی به سلول­های انسولین­ساز می­شود (27). valenzuela و همکاران نیز در تحقیقی دیگر به این نتیجه رسیدند که از این رو سیلی­مارین که یک آنتی­اکسیدان قوی است باعث کاهش رادیکال­های آزاد می­شود و اثرهای دفاعی زیادی برای بدن دارد هم­چنین گلوتاتیون را کاهش می­دهد (28). soto و همکاران در تحقیقی دیگر در سال 2003 نشان دادن سیلی­مارین باعث افزایش فعالیت پانکراسی آنزیم­های آنتی­اکسیدانی می­شود: و افزایش گلوتاتیون پراکسیداز، سوپر اکسید دیسموتاز و کاتالاز می­شود، این آنزیم­ها باعث از بین رفتن رادیکال­های آزاد و سموم حاصل از استرپتوزوتوسین می­شود (16). سلول­های انسولین ساز با بیان مداوم این ژن در سلول­های بنیادی جنینی توسط Blyszczuk و همکاران تولید شدند. آن­ها تلاش کردند تا نشان دهند با استفاده از روش ساده ترانسفکشن ژن Pax4 می­توان سلول­های بنیادی جنینی را به سلول­های انسولین­ساز تمایز داد. در این روش آن­ها ابتدا اجسام جنینی را از سلول­های بنیادی جنین به­وجود آوردند و سپس از اجسام جنینی به­وجود آمده سلول­های منفرد را برای ترانسفکت ژن Pax4 جداسازی کردند. سلول­های بنیادی جنینی ترانسفکت شده بعد از چهار روز به سلول­های ترشح کننده انسولین تمایز یافتند. در طی این مدتی که اجسام شبه جنینی به­صورت قطره­های آویزان هستند ژن­های مخصوص آندودرم در آن­ها بیان می­شوند (29). در تحقیق ما هم بیان ژن Pax4 به­وسیله داروی سیلی­مارین افزایش یافته که این نتایج بیانگر است که سیلی­مارین باعث ترمیم و افزایش سلول­های جزایر به­واسطه پیش­سازهای آن­ها می­شود. collombat و همکاران در سال 2009 در مقاله­ای تحت عنوان بیان بیش از حد ژن Pax4 در پانکراس موش و تبدیل سلول­های بنیادین به سلول­های آلفا و پس از آن به سلول­های بتا به این نتیجه رسیدند که بیان نابجا و بیش ازحد ژن Pax4 بر پانکراس در حال تکوین موش­های تراریخته منجر به پیدایش جزایر لانگرهانس بزرگ می­شود که این جزایر به­طور عمده از سلول­های بتا تشکیل شده­اند (30). این نتایج نشان دهنده این است که بیان این ژن باعث افزایش سلول­های بتا و آلفا می­شود که نتایج به­دست آمده از الایزا ما هم گویای این نتیجه است. soto و همکاران در سال 2014 در مطالعه­ای تحت عنوان اثر سیلی­مارین در بیان ژن Pdx-1 و گسترش سلول­های بتای پانکراس در یک مدل پانکراتومی که توسط soto و همکاران در سال 2014 بر روی 72 سر موش صحرایی نژاد ویستار انجام شد، به این نتیجه رسیدند که ممکن است سیلی-مارین تکثیر سلول­های تولیدکننده انسولین را افزایش دهد (31). نتایج به­دست آمده از این تحقیق گویایی تأثیر سیلی­مارین بر بهبود سلول­های تخریب شده بافت پانکراس و هم­چنین افزایش معنی­دار بیان ژن Neuro D1 و افزایش وزن رت­ها و کاهش قند خون افزایش گلوکاگون خون در رت­های تیمار با دوزهای مختلف سیلی­مارین نسبت­به گروه کنترل منفی شده است. از سوی دیگر collombat و همکاران در سال 2009 با بررسی نقش Mafa در سلول­های بتا پانکراس دریافتند که بیان ژن Mafa همراه با ژن PDX-1 و Neuro D1 به‌طور قابل‌ توجهی باعث بیوسنتز انسولین می­شود. این نتایج نشان می­دهد که این ژن­ها نقش بسیار مهمی در سلول­های جزایر لانگرهانس پانکراس دارند و می­توانند یک هدف درمانی جدید برای دیابت باشد (30). با توجه­به نتایج به­دست آمده بیان ژن NeuroD1 قبل از ایجاد دیابت در همه گروه­ها بیان داشته و پس از ایجاد دیابت درگروه­های بیمار به­شدت افت پیدا کرده و بعد از استفاده از داروهای سیلی­مارین و متفورمین تا حدودی این کاهش بیان جبران شده است. هم­چنین میزان بیان این ژن در گروه شاهد دیابتی (B) که دارویی دریافت نکرده است بسیار افت پیدا کرده و نسبت­به گروه سالم شاهد (A) نتایج معنی­دار است. در نهایت zhao و همکاران در سال 2016 با بررسی تأثیر اکستانید-4 بر بیان Neurod-1 و Glut-2  در سلول­های تولید­کننده انسولین مشتق از سلول­های بنیادی جنینی در موش به این نتیجه رسیدند که اکستانید-4 به‌طور قابل‌توجهی رونویسی ژن Neurod1 و Glut2 را تسهیل کرد و قادر به ایجاد تمایز سلول­های بنیادی جنینی به سلول­های تولید­کننده اندوکرین و انسولین شد (32). نتایج پژوهش حاضر نیز حاکی از آن بود که سیلی مارین باعث بهبود بافت پانکراس و بیان ژن Neuro D1 و در نتیجه باعث افزایش سطح گلوکاگون می شود.

نتیجه­گیری

نتیجه­گیری در این تحقیق نشان داده شد که سیلی­مارین باعث بهبود بافت پانکراس و بیان ژن Neuro D1 و در نتیجه باعث افزایش سطح گلوکاگون می­شود. نتایج به­دست آمده از این تحقیق گویایی تأثیر سیلی­مارین بر بهبود سلول­های تخریب شده بافت پانکراس و هم­چنین افزایش معنی­دار بیان ژن Neuro D1 و افزایش وزن رت­ها و کاهش قند خون افزایش گلوکاگون خون در رت­های تیمار با دوزهای مختلف سیلی­مارین نسبت­به گروه کنترل منفی شده است. در نتیجه شواهد ارائه‌ شده در این تحقیق حاکی از آن است که سیلی‌مارین نه‌تنها باعث کاهش دیابت ایجاد شده با استرپتوزتوزسین می­شود بلکه باعث بهبودی پانکراس و بازگرداندن آن به عملکرد طبیعی اش نیز می‌شود.

سپاسگزاری

این مقاله برگرفته از پایان­نامه کارشناسی ارشد و تحت حمایت معاونت پژوهشی دانشگاه آزاد شهرکرد است و مؤلفین این تحقیق مراتب سپاس خود را نسبت­به معاونت پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد که امکان اجرای این طرح را فراهم کردند، ابراز می­دارند.