بهبود تولید پروتئین­های نوترکیب در باکتری اشرشیاکلی

شکوفه رضایی، احمدفرهاد طالبی^*

گروه زیست فناوری میکروبی، پردیس علوم و فناوری­های نوین ، دانشگاه سمنان، سمنان، ایران.

چکیده

امروزه با استفاده از مهندسی ژنتیک، پروتئین‌های نوترکیب می‌توانند در حجم انبوه، کیفیت مطلوب و هزینه پایین برای پاسخگویی به خواسته‌های صنایع مختلف تولید شوند. پروتئین‌های نوترکیب می‌توانند در روش‌های بیانی مختلفی نظیر سیستم‌های بیانی عاری از سلول یا بر پایه سلول­های پروکاریوتی یا یوکاروتی بیان شوند. با توجه به مزایای استفاده از سلول­های پروکاریوتی، یکی از سیستم­های متداول برای تولید پروتئین­های نوترکیب، استفاده از باکتری اشریشیاکلی (E.coli) است. هدف از مطالعه حاضر بررسی دقیق­تر بیان پروتئین نوترکیب در باکتری E. coli و ارائه راه­کارهای مناسب برای دستیابی به کشت با تراکم سلولی بالا و با قابلیت بیان بیشینه است. از این رو با مطالعه حدود 63 مقاله چاپ شده در زمینه مهندسی ژنتیک، سیستم­های بیانی گوناگون برای تولید پروتئین­های نوترکیب معرفی و سپس راهکارهای عمومی برای بیان بالاتر آنها بررسی شدند. رویکردهای متعددی برای افزایش بازدهی و حلالیت به­کار گرفته شده است؛ تغییر سرعت سنتز پروتئین­ها، استفاده از پروتئین­های اتصالی، موتاسیون در پروتئین هدف، بیان هم­زمان چاپرون­های ملکولی و بهینه سازی شرایط کشت از جمله روش­هایی است که در این مطالعه ارزیابی شده­اند. کلونینگ مجازی در بستر توسعه روش­های نرم­افزاری و پایگاه­های اطلاعاتی غنی­تر به کمک ابزار و آزمون­های آزمایشگاهی آمده و توانسته است به رفع محدودیت­های بیان نوترکیب پروتئین­ها در میزبان­هایی با سیستم بیانی متفاوت منجر شود.

واژه ­های کلیدی: کلونینگ مجازی، میزبان پروکاریوتی، تراریختگی، سیستم­های بیانی، پروتئین نوترکیب.

مقدمه

پروتئین­ها ماکرومولکول­هایی هستند که در سیستم متابولیکی و کاتابولیکی موجودات زنده نقش مهمی ایفا می­کنند. طی سال­های 1971 تا 1973 دستاوردهای جدید مطالعه­های ژنتیکی منجر به تحولاتی بنیادین در حوزه زیست­شناسی مولکولی شد. به مجموعه روش­های جدید ابداع شده فن­آوری DNA نوترکیب یا مهندسی ژنتیک گفته می­شود. از جمله فعالیت­های تکنیک مهندسی ژنتیک، کلون­سازی ژن است که با این روش می­توان ژن یک پپتید مورد نظر را از میزبان طبیعی جدا کرد و به ژنوم یک میزبان جدید انتقال داد. در نتیجه بیان این ژن هترولوگ، پپتید نوترکیب توسط میزبان مورد نظر تولید خواهد شد.

جدول1. گروه­های مختلف پروتئین­های نوترکیب.

پیشرفت تکنولوژی سبب کسب اطلاعات بیش­تر در زمینه توالی DNA، ساختار و فرآیند رونویسی ژنوم در گونه­های مختلف شده است. این داده­ها در پایگاه­های اطلاعاتی DNA جمع­آوری شده که شامل بسیاری از ژن­هایی است که عملکرد بیولوژیکی آن­ها هنوز کشف نشده است. با استفاده از ابزار آنلاین بیوانفورماتیک می­توان ژن­های جدید و فرآیند رونویسی آن­ها را شناسایی کرد. شناسایی ژن­های جدید با استفاده از تجزیه و تحلیل پایگاه اطلاعاتی DNA به­عنوان کلونینگ مجازی (in silico cloning) شناخته می­شود. کلونینگ مجازی نه تنها اطلاعات جدیدی را در مورد ژن­ها و عملکرد بیولوژیکی آن­ها ارائه می­دهد، بلکه ممکن است منجربه شناسایی داروها و کشف فعالیت­های آن­ها شود.

ﺑــﺎ ﺗﻮﺟــﻪ­ﺑــﻪ اﻫﻤﻴــﺖ ﻛــﺎرﺑﺮدی ﻛــﻪ تولید ﭘــﺮوﺗﺌﻴﻦ­های نوترکیب ﻣــﻲ­ﺗﻮاﻧــﺪ داﺷــﺘﻪ ﺑﺎﺷــﺪ، ﻫــﺪف ﻣﻄﺎﻟﻌــﻪ حاضر ﺿــﻤﻦ بررسی شرایط بیان پروتئین نوترکیب و تأثیر عوامل مختلف بر بیان آن و بر شناخت سیستم­های کارآمد جهت دست­یابی به ﺑﻴــﺎن بالاتر و ﺑﻬﻴﻨــﻪ ﺳــﺎزی تولید ﭘــﺮوﺗﺌﻴﻦ نوترکیب در باکتری E.coli در ﺷـــﺮاﻳﻂ آزﻣﺎﻳـــﺸﮕﺎﻫﻲ متمرکز اﺳﺖ.

1.                 تولید پروتئین­های نوترکیب در  E.coli

1-1. مزایا و معایب باکتری E.coli در تولید پروتئین­های نوترکیب

در سال 1885 باکتری E.coli توسط تئودور اشریش باکتری­شناس آلمانی کشف شد. این باکتری میله­ای گرم منفی به­صورت بی­هوازی اختیاری و در بازه دمایی 8 تا 48 درجه سانتی­گراد رشد می­کند. بیشینه دمای رشد آن در 37 درجه سانتی­گراد است. علی­رغم محدودیت­های E. coli برای تولید برخی از پروتئین­های بزرگ، ولی تاکنون پروتئین­های مهم بسیاری با بکارگیری این میزبان تولید شده­اند (5). مزایای دیگر این باکتری میزبان عبارتند از: قابلیت بیان پروتئین­های پروکاریوتی و یوکاریوتی گوناگون، به­دلیل مضاعف شدن سریع (حدود 30 دقیقه) با بهره­مندی از محیط کشت ساده و ارزان است. تخریب سلول­های E.coli جهت جداسازی پروتئین هدف ساده است. هم­چنین سازوکار تخمیر آن در اکثر کشورها گسترش یافته، وجود ناقلین بیانی و سویه­های مهندسی شده کارآمد در E.coli سبب افزایش کارایی بیان پروتئین در حجم انبوه و نیز مقرون به صرفه شده­است. در مقابل، از جمله مشکلات تولید پروتئین­های توترکیب در  E.coli از دست رفتن ساختار فضایی طبیعی پلی­پپتیدهای بالغ حین فرآیند تاخوردگی زنجیره­های تازه سنتز شده­است. عواملی مانند افزایش تراکم مولکولی پروتئین در نتیجه افزایش سطح بیان و تغییرهای عوامل­ محیطی این روند را تسریع می­کنند. از دست رفتن کنفورماسیون علاوه­بر کاهش سطح پروتئین­های عملکردی، به­دلیل در معرض بودن سطوح هیدروفوب، افزایش توده­های پلی­پپتیدی را در غالب اینکلوژن بادی منجر می­شود. از جمله مشکلات دیگر این میزبان پروکاریوتی این است که توانایی حذف اینترون­ها و هم­چنین تغییرها پس از ترجمه یوکاریوتی مانند متیلاسیون، گلیکوزیلاسیون، تشکیل پیوندهای دی­سولفیدی را ندارد، که به­ترتیب می­توان با جایگزین کردن cDNA مربوطه در ناقل  و جستجوی میزبان مناسب برای اعمال تغییرهای پس از ترجمه برای رفع مشکلات فوق اقدام کرد. از سوی دیگر عدم حضور سویه E.coli در لیست به­طور کامل ایمن و قادر نبودن این میزبان در ترشح پروتئین نوترکیب از دیگر معایب E.coli محسوب می­شود.

با وجود تمامی مشکلات ذکر شده، هنوز E.coli به­عنوان میزبان رایج در اکثر آزمایش­ها مورد استفاده قرار می­گیرد. در جدول 2 خلاصه­ای از مقایسه میزبان­های رایج در تولید پروتئین نوترکیب خلاصه شده است.

جدول2. سیستم­های بیانی گوناگون برای تولید پروتئین­های نوترکیب (6).

1-2. فاکتور­های مهم در بیان پروتئین­های نوترکیب در E.coli

به­منظور دست­یابی به بیان بالای پروتئین نوترکیب در E.coli، برخی از راه­کارهای مؤثر در جدول 3 خلاصه شده است. (7).

جدول 3. راه­کارهای عمومی برای بیان بالاتر پروتئین نوترکیب (7).

توضیحات کامل مربوط به مهمترین عوامل در ادامه مورد بحث قرار می­گیرد.

1-2-1.  ناقلین پلاسمیدی

ناقلین بیانی بسیاری جهت بیان پروتئین نوترکیب در سویه E.coli، با اعمال دستکاری­های ژنتیکی و به­کارگیری عناصر مختلف کنترل کننده ژنتیکی که در رونویسی، ترجمه، پایداری پروتئین تأثیرگذار است، طراحی شده است. از جمله مهم­ترین عوامل مولکولی که بیش­تر مورد بررسی قرار گرفته، شامل موارد ذیل است (8):

·         ماهیت توالی پروموتری؛ با این وجود که پروموترهای بسیار قوی سبب رونویسی سطوح بالای RNA می­شوند، E.coli قادر به بیان بسیاری از پروتئین­ها نیست. در واقع عوامل تأثیرگذار دیگری به­جز قدرت پروموتر وجود دارد، که در ادامه ذکر شده است.

·         ماهیت توالی خاتمه­دهنده رونویسی؛ اتمام کارآمد رونویسی برای تحقق افزایش بیان ژن بسیار حائز اهمیت است. به­طوری که توالی خاتمه دهنده سبب پایداری mRNA و در نهایت منجربه بالا رفتن سطح بیان پروتئین می­شود.

·         قدرت مکان اتصال ریبوزوم(RBS).

·         تعداد نسخه ژن کلون شده (تعداد ناقل بیانی) در سلول؛ علی­رغم تصورات عموم همیشه بالا بودن تعداد نسخه یک ناقل بیانی (قیاس با تعداد نسخۀ pBR322)، دلیل­بر افزایش بیان پروتئین مطلوب نیست. در حال حاضر اغلب ناقلین بیانی با منشاء همانندسازی pBR322 یا pUC به­صورت تجاری در دسترس هستند. هم­چنین تغییر تعداد نسخه برای تنظیم بیان پروتئین در کم­تر مواردی مورد بررسی قرار می­گیرد.

·         مکان هدف قرارگیری پروتئین مطلوب در سلول میزبان.

·         کدون مصرفی.

·         تجزیه توالی پروتئینی؛ یکی از مهم­ترین عوامل موثر در تجمع توده پروتئینی توالی اسید آمینه­ای آن پروتئین است. نخستین بار تأثیر انتهای آمینی جهت بررسی پایداری پروتئین در آزمایشگاه الکساندر ورشاوزکی انجام شد.

اغلب حاملین سویه E.coli از ناقل pBR322 که حاوی منشاء همانندسازی colE1 است، تشکیل می­شوند. دلایلی که جهت استفاده از مشتقات ناقل فوق وجود دارد شامل شناخت کامل توالی DNA، آگاهی از مکانیسم­های همانندسازی و تکثیر سلول است. عوامل مختلفی نظیر پروموتر و نشانگر انتخابی در اکثر ناقلین دیده می­شود و هم­چنین ژن گزارشگر، سیگنال ترشحی و خاتمه دهنده که بسته به پروتئین هدف در برخی وکتورها حضور دارد (9).

یکی از عوامل مؤثر در سیستم بیانی حفظ پایداری و تعداد نسخه­های ناقل است. افزایش تعداد نسخه­های ناقل، افزایش سطح بیان ژن را به­دنبال خواهد داشت. از این رو چنان­چه ژن هدف توسط یک رپرسور کنترل می­شود، با بالا رفتن تعداد نسخه­های ناقل، مولکول­های رپرسور و در پی آن فاکتورهای همانند­سازی و نگه­داری پلاسمید بیش­تری باید فراهم­ شود. اغلب طی این شرایط سرعت رشد سلول میزبان نسبت­به سلول­های حاوی تعداد ناقلین کم­تر کاهش می­یابد (10).

پروموتر: پروموتر کمابیش در 10 تا 100 جفت باز بالادست مکان اتصال ریبوزوم حضور دارد که به­وسیله یک ژن تنظیم کننده کنترل می­شود. پروموترهای هگزا نوکلئوتیدی E.coli در محل 35 جفت باز (ناحیه 35-) و 6 جفت باز (ناحیه 10-) بالادست نقطه آغاز رونویسی حضور دارند. علاوه­بر این پروموترهای مشتق شده از باکتری گرم مثبت و باکتریوفاژها نیز در E.coli قرار دارند. حداقل نیاز یک ناقل بیانی کارآمد حضور توالی پروموتری قوی با میل اتصال بالا به RNA پلیمراز که منتج به افزایش رونویسی ژن مطلوب گردد، است. ویژگی­های یک پروموتر کارآمد عبارتند از: 1) قوی باشد تا بیان پروتئین مطلوب را افزایش دهد. 2) بیان نشتی پایین و قابلیت تنظیمی بالایی داشته باشد که بیان پروتئین تحت کنترل قرار گیرد. 3) در میزبان­های مختلف فعال باشد. 4) القای آن ساده و مقرون به صرفه باشد (11).

تنظیم کارآمد پروموتر برای تولید پروتئین­هایی که در سلول تأثیرگذار هستند، ضروری است. به­عنوان مثال آنزیم EcoRI  در شرایط عدم حضور متیلاز اصلاح کننده و بیان ژن Lon سبب مرگ باکتری می­شود. هم­چنین عدم کنترل دقیق سیستم بیانی ممکن است پس از چندین چرخه تکثیر سلولی سبب حذف ناقل حاوی ژن هدف شود. به­دلیل افزایش سرعت رشد در میزبان فاقد ناقل، لذا ناپایداری ناقلین یکی از معایب اصلی برای بیان کارآمد پروتئین نوترکیب در مقیاس بالا است. در نتیجه با به­کارگیری پروموتر قوی و قابل تنظیم می­توان رونویسی از ژن هدف را به­گونه­ای کنترل کرد که در یک بازه زمانی معین انجام شود.

پروموتر­های قابل­کنترل: پروموتر­های قابل کنترلی که در E. coli استفاده می­شوند، عبارتند از: پروموتر اپرون lac، پروموتر trp، پروموتر tac، پروموتر T5 از فاژ T5، پروموتر ژن 10 از باکتریوفاژ T7 و پروموتر P_L از باکتریوفاژ λ. این پروموترها با استفاده از مهارکننده­ها و یا فعال­کننده­ها تنظیم می­شوند. مولکول­هایی که توسط یک کلید قابل­ تنظیم برای روشن یا خاموش کردن رونویسی ژن­ها فعالیت می­کنند، مهارکننده نام دارند. این پروموترها توسط هولوآنزیم RNA پلی­مراز متصل به فاکتور سیگما، راه اندازی می­شوند. فاکتور سیگما پروتئینی است که با اتصال به RNA پلی­مراز سبب شکل­گیری هولوآنزیم می­شودو به­طرف توالی پروموتری حرکت می­کند (4).

در جدول 4 به برخی از پروموترهای E. coli اشاره شده است.

جدول 4. پروموترهای به­کار رفته در E. coli (12، 13).

امروزه سیستم بیانی pET قوی­ترین سیستمی است که جهت بیان پروتئین نوترکیب به­کار گرفته می­شود. این سیستم بیانی توسط شرکت نواژن طراحی شده است. ناقل­های pET که در سال 1986 توسط استادیر و همکاران شناخته شدند، ژن هدف را توسط توالی­های رونویسی و ترجمه باکتریوفاژ T7 کنترل می­کند و لذا بیان ژن  توسط به کارگیری RNA پلی­مراز T7 در میزبان القاء می­شود. آنزیم RNA پلی­مراز T7 با قدرت زیاد هشت مرتبه سریع تر از RNA پلی­مراز E.coli رونویسی را انجام می­دهد. این ناقل از دو گروه تشکیل می­شود: 1) ناقل­ رونویسی: جهت بیان ژن­ هدف طراحی شده­است که متشکل از جایگاه اتصال به ریبوزوم و کدون آغاز ATG هستند. 2) ناقل­های ترجمه­ای: دارای جایگاه اتصال به ریبوزوم مؤثر، مربوط به پروتئین کپسید فاژ T7 هستند. این ناقل موقعیت چارچوب خواندنی (ORF) را نسبت به جایگاه کلونینگ BamHI از طریق یک پسوند تعیین می­کند. علامت (+) به­دنبال اسم ناقل­ حاکی از دارا بودن مبدأ همانندسازی F1 دارد. هم­چنین ژن­های مقاومت به آنتی­بیوتیک­ آمپی­سیلین و یا کانامایسین از جمله نشانگرهای انتخابی این ناقل است (14).

سویه­های DH5α، HB101، HMS174 و JM109 از باکتری  E.coli میزبان­های مناسبی برای سیستم بیانی pET هستند. تمامی سویه­های مذکور فاقد ژن RNA پلی­مراز T7 هستند، لذا ناقل pET برای بیان پروتئین مطلوب نیاز به میزبانی دارد که دارای یک نسخه کروموزومی از ژن RNA پلی­مراز T7 باشد. این نوع میزبان لیزوژن DE3 است که از فاژ لامبدا مشتق می­شود. میزبان مذکور متشکل از یک توالی واجد ژن lac1 و ژن RNA پلی­مراز T7 تحت کنترل پروموتر lacUV5 هستند،که این پروموتر توسط IPTG القا می­شود. توالی ذکر شده درون ژن int درج می­شود. در نتیجه ژن int غیرفعال شده و DE3 با استفاده از فاژ کمکی می­تواند به درون کروموزوم وارد و یا از آن خارج شود. از دیگر میزبان­های رایج در بیان پروتئین نوترکیب BL21 است که فاقد پروتئازهای lon و ompT است. شرکت نواژن دو نوع از مشتقات این میزبان را ارائه داده است: 1) نوع B834 که به­دلیل عدم توانایی تولید متیونین می­توان پروتئین مطلوب را با به­کارگیری S-methionine یا Selenomethionine نشاندار نمود. 2)نوع BLR که به­دلیل عدم حضور recA، سبب بالا بردن بازدهی ناقل مونومری می­شود (15).

علی­رغم اهمیت و مزایای سیستم بیانی pET، به­کارگیری از آن معایبی از قبیل بیان نشتی پروتئین مطلوب در شرایط غیرالقایی و ایجاد اینکلوژن­بادی را به­همراه دارد (14). لذا با به­کارگیری از ناقل­های واجد پروموترهای ترکیبی T7/lacO و توالی کدکننده رپرسور lacI، می­توان بر مشکلات این سیستم بیانی چیره شد. توالی اپراتور lac در پایین­دست پروموتر T7 جای­گذاری می­شود. جهت­گیری پروموترهای T7/lacO و LacI مخالف جهت یک­دیگر می­باشد. هم­چنین از نسخه­برداری پروموتر lacUV5 واقع در کروموزوم میزبان و نیز رونویسی از پروموتر T7/lacO ناقل، توسط RNA پلیمراز T7 توسط رپروسور Lac ممانعت می­شود (16).

1-2-2. پروتئین­های ادغامی

در سال­های گذشته تولید انبوه پروتئین­های نوترکیب به­گونه ترکیب شده با اپی­توپ­های پپتیدی در صنعت دارو گسترش یافته است. به­کارگیری از این برچسب­ها درجه خلوص پروتئین­های نوترکیب را افزایش می­دهد. لذا اهمیت استفاده از پروتئین­های ادغامی در ادامه ذکر شده است: 1) تخلیص آسان و سریع پروتئین با استفاده از کروماتوگرافی جذبی، 2) به­ندرت ساختار و فعالیت زیستی پروتئین را تحت تأثیر می­گذارد، 3) حذف آسان و اختصاصی جهت دست­یابی به پروتئین اصلی، 4) سنجش ساده و با­دقت پروتئین نوترکیب طی تخلیص و 5) توانایی استفاده در طیف وسیعی از پروتئین­ها.

دنباله­های پپتیدی Poly-Arg-، FLAG، C-myc، Poly-His- و S-tag رایج­ترین برچسب­های به­کار گرفته شده هستند. تخلیص هر یک از دنباله­ها در شرایط بافری خاص صورت می­گیرد. اثر پروتئین­های ادغامی کوچک بر ساختار سه­بعدی و فعالیت زیستی پروتئین نوترکیب به موقعیت و ترکیب اسیدآمینه­ای آن­ها وابسته است. اگر چه پروتئین­های بزرگ نیز جهت بالا بردن حلالیت پروتئین به­کار گرفته می­شوند. برای نمونه اتصال تیوردوکسین به پروتئین سبب افزایش قابلیت حل شدن آن و ممانعت از تشکیل انکلوژن بادی در سیتوپلاسم سلول می­شود. پروتئین A استافیلوکوکوس با افزایش حلالیت سبب ارتقا تاخوردگی پروتئین هدف شده و هم­چنین با استفاده از پپتید راهنما در این پروتئین سبب ترشح پروتئین هدف به خارج از سلول می­شود. علاوه­بر تیوردوکسین برای ارسال پروتئین هدف به فضای پری­پلاسم از DsbA استفاده می­شود. با این­وجود جهت ساخت کریستال و یا تولید آنتی­بادی این دنباله­های پپتیدی باید حذف شوند (17, 18).

از این رو بسته­به ویژگی­های زیست شیمی و عملکردی پروتئین هدف انتخاب مناسب­ترین سیستم فیوژن بسیار مهم است. در ادامه 2 نوع پرکاربرد این دنباله­های پپتیدی معرفی می­شود.

برچسب پلی­هیستیدین (His-tag): هیستیدین محکم­ترین پیوند را با بسترهای تثبیت شده با یون فلزی ایجاد می­کند. لذا در بسیاری از موارد با به­کارگیری کروماتوگرافی تمایلی فلز تثبیت شده (IMAC) قادر به تولید و تخلیص پروتئین­های هدف خواهند شد. روی حلقه ایمیدازول هسیتیدین، گروه­های الکترون­دهنده­ای وجود دارند که به­سرعت با کاتیون­های فلزی پیوندهای کوردینانس ایجاد می­کنند. پروتئین­های دارای پلی-هیستیدین پس از شستشوی بستر و با استفاده از کنترل pH بافر ستون یا افزودن ایمیدازول به­آسانی جدا می­شوند. طول برچسب پلی-هیستیدین و سیستم حلالیت بر بازدهی تخلیص این سیستم تأثیرگذار است. محدودیت به­کارگیری ایمیدازول به­دلیل ایجاد توده پروتئینی و نیز تأثیرگذاری آن در بررسی کریستالوگرافی و مطالعه­های رقابتی پروتئین هدف است. اتصال برچسب­های پلی- هیستیدین به پایانه –C یا –N به نوع پروتئین نوترکیب بستگی دارد. در رابطه با اثر برچسب­ها بر روی فعالیت زیستی پروتئین باید ذکر کرد که به­دلیل طول کوتاه و مقدار ناچیز بار این برچسب­ها به­ندرت بر فعالیت پروتئین مؤثر هستند (19).

S-tag: توالی S-tag یک دنباله پپتیدی با 15 اسید آمینه است که به­دلیل ترکیب اسید آمینه­ای متشکل از 4 اسیدآمینه کاتیونی، 3 اسیدآمینه آنیونی، 3 اسیدآمینه قطبی بدون بار و 5 اسیدآمینه غیرقطبی قابلیت حل شدن دارد. S-tag بر پایه شکل­گیری مجدد فعالیت ریبونوکلئولتیک سنجیده می­شود. پروتئین­های برچسب­دار با بسترهای حاوی S- پروتئین اتصال ایجاد می­کنند و جهت خارج کردن پروتئین هدف به بافری با 2pH= نیاز است. S-tag دارای قابلیت تخلیص پروتئین­های نوترکیب از سلول­های پستاندارن، عصاره سلولی باکتری­ها و سلول­های حشره­ای آلوده شده با باکولوویروس است. این سیستم به­طور معمول به­عنوان برچسب ادغامی دوم استفاده می­شود (20،21).

1-2-3. مکان پروتئین در سلول

بیان سیتوپلاسمی: یکی از محدودیت­های بیان سیتوپلاسمی پروتئین تشکیل اینکلوژن­بادی­ها است. لذا نیاز به فرآیند دوباره تاخوردن پروتئین و در نتیجه آن کاهش بازدهی تولید پروتئین و عدم اطمینان از این­که آیا پروتئین فعالیت زیستی خود را حفظ کرده، به­دنبال دارد. در حال حاضر تمامی عوامل مختلف فیزیکی و شیمیایی که منجربه تشکیل اینکلوژن­بادی می­گردد، شناخته نشده است. بررسی آماری 81 پروتئین بیان کرده است که 6 پارامتر می­تواند در تشکیل اینکلوژن­بادی نقش داشته باشند: 1) معدل بار، 2) تعداد زیرواحدهای تشکیل دهنده چرخش، 3) بخش­های پرولینی، 4) بخش­های سیستئینی، 5) بخش­های آبگریز و 6) تعداد کل اسیدهای آمینه. در واقع دو پارامتر اول موثرتر هستند (21،22). بر این اساس راه­حل­هایی برای کاهش ایجاد اینکلوژن­بادی و ارتقا تاخوردن پروتئین ایجاد شده که عبارتند از: رشد باکتری در دمای پایین­تر، گزینش سویه­های باکتریایی مناسب، بیان به­همراه چاپرون، جایگزینی اسیدهای آمینه، بهره­مندی از تیوردوکسین E.coli ادغامی یا به­صورت بیان هم­زمان، رشد یا القاء سلول­های در شرایط استرس اسمزی در حضور سوربیتول و گلیسیل بتائین، رشد در محیط حاوی قندهای غیرمتابولیزه، تنظیم pH مناسب و به­کارگیری از سویه­های فاقد تیوردوکسین ردوکتاز (23،24).

با وجود تمام محدودیت­ها ایجاد اینکلوژن­بادی دارای مزایا نیز است که در جدول 5 ذکر شده است.

جدول 5. مزایا و محاسن بیان پروتئین در مکان­های مختلف باکتری   E. coli(25).

بیان سیتوپلاسمی یک ژن توسط کدون آغازگری که به­طور عمومی اسیدآمینه متیونین را کد می­کند، راه­اندازی می­شود. اغلب حضور متیونین آغازی تأثیری بر ساختار پروتئین ایجاد نمی­کند، اما در موارد خاص باقی­ماندن این اسیدآمینه اضافی در زنجیره پروتئینی آثار منفی به­جای می­گذارد. به­عنوان نمونه متیونین اضافی در RANTES (عضوی از خانواده سایتوکین­ها)، سبب از بین رفتن فعالیت فیزیولوژیکی این مولکول می­گردد. علاوه­بر این حضور متیونین آغازی سبب تغییر ساختار فضایی هموگلوبین و نیز سبب نتیجه منفی در ویژگی ایمونولوژیک پروتئین­های دارویی می­شود. با بهره­مندی از تولید هم­زمان متیونین آمینوپپتیداز می­توان میتونین آغازی باقی­مانده را از پروتئین­ هدف حذف کرد (25).

1-2-4. تجزیه پروتئینی

باکتری E.coli حاوی آنزیم­های پروتئازی بسیاری است که با تنظیم فرآیند پروتئولیز به­صورت اختصاصی و غیراختصاصی نقش مؤثری در فیزیولوژی سلول ایفا می­کنند. برای مثال، آنزیم سیگنال پپتیداز I، پروتئاز اختصاصی است که حذف پپتید راهنما از انتهای آمینی پروتئین­های انتقال داده شده به خارج سلول را بر­عهده دارد. علاوه­بر این فرآیند پروتئولیز اختصاصی در پاسخ به شرایط محیطی SOS نیز توسط RecA دیده می­شود.

فرآیند پروتئولیز غیراختصاصی طبق شرایط رشد متفاوت است. برای نمونه، به­طور معمول پروتئین­های غیرطبیعی و یا پروتئین­هایی که تاخوردگی صحیح خود را از دست داده­اند، در شرایط مختلف رشد تجزیه می­شوند. علی­رغم این­که تخریب پروتئین طی مراحل اولیه کمبود مواد غذایی افزایش می­یابد، اما به­تدریج در شرایط تداوم کمبود مواد غذایی شدت آن کاهش می­یابد. برای مثال بیشینه فعالیت پروتئاز Clp، در انتهای فاز رشد تصاعدی و ابتدای فاز سکون مشاهده شده است (26،27).

Tobias و همکاران (28) جهت به حداقل رساندن پروتئولیز در باکتری E. coli قانونی به نام «انتهای N» را بیان کردند. در واقع این قانون حاکی از رابطه مستقیم پایداری متابولیکی پروتئین با اسیدهای آمینه انتهای آمینی است. برای مثال با افزودن اسیدهای آمینه تریپتوفان، لیزین، آرژنین، لوسین، و تیروزین در انتهای آمینی پروتئین مورد آزمایش نیمه عمر آن 2 دقیقه افزایش می­یابد. درصورتی­که دیگر اسیدهای آمینه به­جز پرولین 10 دقیقه به نیمه عمر پروتئین­ می­افزایند. حضور اسیدهای آمینه با زنجیره جانبی کوتاه پس از متیونین آغازی حذف آن را از طریق میتونین آمینو پپتیداز سرعت می­بخشد. طبق مطالعه­های حاضر، جای­گیری لوسین در موقعیت دوم (بعد از حذف میتونین) سبب ناپایداری پروتئین می­شود. عامل مهم دیگر حضور اسیدآمینه لایزین در انتهای آمینی است که در پروتئولیز نقش دارد. اسیدآمینه لایزین با اتصال به زنجیره مالتی یوبیکویتین منجربه تجزیه پروتئین توسط پروتئازهای وابسته به یوبیکویتین در یوکاریوت­ها می­گردد. هم­چنین طبق نظریه PEST رابطه میان نوع اسید آمینه و ناپایداری پروتئین مطرح شده است. بر اساس آنالیز بیوانفورماتیکی، نواحی غنی از اسیدهای آمینه ترئونین، سرین، گلوتامیک اسید و پرولین که به­وسیله اسیدهای آمینه خاصی احاطه شده­اند به­دلیل فسفوریله شدن PEST باعث افزایش اتصال کلسیم و در نتیجه افزایش فرآیند پروتئولیز توسط پروتئازهای وابسته به کلسیم می­گردد (29).

راه­حل­های جهت کاهش تجزیه پروتئین ها ارائه می­شود: 1) انتقال پروتئین هدف به فضای پریپلاسم و یا ترشح به خارج سلول، 2) به­کار گیری سویه­های فاقد پروتئاز، 3) رشد سلول در دمای پایین، 4) بیان پروتئین­های ادغامی، 5) اتصال متوالی چندین کپی از ژن مطلوب، 6) تولید هم­زمان چاپرون­ها، 7) بیان هم­زمان ژن pin باکتریوفاژ T4، 8) قرار گرفتن برخی اسیدهای آمینه با اسیدهای آمینه خاص جهت حذف مکان برش پروتئازها، 9) بهبود هیدروفوبیسیتی پروتئین نوترکیب و 10) بهینه کردن شرایط فرمانتاسیون (3) و (30).

در سلول E.coli به­علت کم بودن تعداد پروتئاز­های پری­پلاسم نسبت­به سیتوپلاسم لذا فرآیند پروتئولیز در فضای پری­پلاسم کم­تر از سیتوپلاسم رخ می­دهد. برای نمونه پروانسولین انتقال یافته به پریپلاسم در حدود 10 مرتبه پایدارتر از زمانی است که آن پروتئین در سیتوپلاسم بیان می­شود. علی­رغم وجود فعالیت پروتئولیتیک در فضای پری­پلاسم، ترشح پروتئین به خارج از سلول راهکار موفق­تری است. متأسفانه درحال حاضر فناوری ترشح پروتئین نوترکیب به­وسیله باکتری E.coli گسترش پیدا نکرده است (31).

القاء پروتئین­های شوک حرارتی طی پاسخ به شرایط تنش­زا، سبب بیان ژن Lon و تولید پروتئاز La و پروتئازهای دیگر می­شود، بنابراین افزایش تجزیه پروتئین را به­همراه خواهد داشت. راه­حل این مشکل بهره­مندی از سویه­های فاقد جایگاه ژنی rpoH است. ژن rpoH، کد کننده زیرواحد ³²σی RNA پلی­مراز است که در ایجاد فرآیند پروتئولیز باکتری E. coli ایفای نفش می­کند. اغلب برای بیان پروتئین نوترکیب از سویه­هایی که در توالی ژن rpoH و Clp La آن­ها جهش ایجاد شده، استفاده می­شود. ولی باید متذکّر شد که عدم وجود پروتئازها و در نتیجه افزایش توده­های پروتئینی غیر طبیعی، ایجاد سمیت در میزبان را می­افزاید (32).ُ

1-3. راه­حل­های کاهش تاخوردگی نادرست پروتئین و ممانعت از تشکیل اینکلوژن­بادی­

1-3-1. به­کارگیری چاپرون­ها

در بیان بسیاری از پروتئین­های نوترکیب، تاخوردگی نادرست پروتئین مشاهده می­شود. طبق توضیحات بخش بیان سیتوپلاسمی چند راه­کار جهت کاهش ایجاد انکلوژن بادی ارائه شد. تحت شرایط تنش محیطی و یا اتمام زود هنگام ترجمه منتج به از دست رفتن ساختار فضایی پروتئین و ایجاد اینکلوژن بادی می­شود. این مشکلات با بهره­مندی از مکانیسم­های محافظت­شده سلول برای تازدن مجدد پروتئین و افزایش حلالیت پروتئین قابل حل شدن است. چاپرون­های مولکولی موجود در سلول واسطه­های تازننده پروتئین هستند. هم­چنین چاپرون­ها در حفظ کیفیت و پایداری پروتئوم بسیار تأثیرگذار هستند (30).

علی­رغم بیان همیشگی چاپرونین­ها در سلول، در شرایطی نظیر شوک گرمایی یا در شرایط استرس بیان آن­ها افزوده می­شود. به همین دلیل آن­ها را به پروتئین­های استرسی و یا پروتئین­های شوک گرمایی (Hsps) تقسیم­بندی می­کنند (33). چاپرونین­ها را طبق مکانیسم عمل آن­ها به 3 بخش طبقه­بندی می­کنند. چاپرون­های تازننده[1] متشکل از GroEL و DnaK هستند که با بهره­مندی از ATP فعالیت می­کنند. چاپرون­های نگه­دارنده[2] نظیر IbpB که پروتئین­های نیمه تاخورده را تا کم شدن شرایط تنش­زا بر سطح خود نگه می­دارند و دسته سوم چاپرون­های تجزیه کننده[3] مانند ClpB که در شرایط استرس سخت مانع از تجمع توده­های پروتئینی می­شود.

در سیتوپلاسم E. coli سیستم­های چاپرونی DnaK-DnaJ-GrpE، GroEL-GroES و Trigger Factor در تاخوردن مجدد پروتئین­ها نقش دارند (34،35). TF پروتئینی است که به جایگاه خروج پپتید ریبوزوم متصل می­شود. DnaK ممکن است پروتئین­های تازه ساخته شده را دربرگیرد. DnaK و GroEL با کمک نگه­دارنده­ها در تاخوردگی صحیح پروتئین­ها نقش دارند (36). Hsp نگهدارنده­ای است که بیش­تر مطالعه شده است. Hsp33 که در شرایط القای حرارتی کشف شد، در حالت تعادل یک مونومر احیاء شده است. زمانی که سلول در معرض اکسیژن فعال قرار گیرد، تشکیل پیوند دی سولفیدی درون مولکولی سبب ایجاد چاپرون فعال با ساختار فضایی دایمر می­شود (37).

باکتری E.coli با پراکنده کردن توده­های پروتئینی به­وسیله ClpB قادر به مقابله با شرایط استرس سخت است. ClpB عضوی از خانواده Hsp100 است که شامل ClpA، ClpX و ClpY است. نقش اولیه این چاپرون­ها در تجزیه پروتئین است (38). برای مثال بیان پروتئین آلدئید دهیدروژناز 3A1 (ALDH3A1)  قرنیه انسانی در باکتری E. coli، به­دلیل حلالیت و درجه خلوص پایین این پروتئین با مشکل مواجه می­شود. لذا برای بهبود حلالیت و افزایش سطح بیان، پروتئین نوترکیب ALDH3A1 با 6 دنباله هیستیدینی ادغام شده و به­صورت هم­زمان با دو گروه از چاپرون­های مولکولی GroES/GroEL و DnaK/DnaJ/GrpE بیان شده است. در نهایت مقدار چشم­گیر پروتئین نوترکیب ALDH3A1 به فرم محلول و فعال در E. coli تولید شده است (39).

1-3-2. کاهش سرعت تولید

کاهش سرعت تولید پروتئین فرصت مناسبی برای ایجاد تاخوردگی صحیح پروتئین فراهم می­کند. از موثرین­ترین روش­های کاهش تولید پروتئین، کاهش دمای انکوباسیون است (40). دمای پایین سبب کاهش تجمع پروتئین می­شود، که در درجه حرارت بالاتر به­دلیل وابستگی دما به برهم­کنش­های هیدروفوبی حائز اهمیت است (41،42). زمانی­که میزبان با مشکل تشکیل انکلوژن بادی مواجه است، بیان پروتئین نوترکیب باید در محدوده دمایی 25-15 درجه سانتی­گراد انجام شود. اگرچه گزارشی بیان موفق را در دمای 4 درجه سانتی­گراد به­مدت 72 ساعت توصیف کرده­است (43). با این حال بیان پروتئین در دمای خیلی پایین سبب کاهش سرعت رشد سلول و کاهش غلظت پروتئین می­شود. لذا ممکن است چاپرون­های مولکولی به اندازه کافی کارآمد نباشند، در نتیجه تاخوردگی پروتئین­ تحت تأثیر قرار گیرد (44). مثال شناخته شده از این استراتژی عبارتند از: بیان هم­زمان چاپرون­های سازگار با سرما برای ایجاد تاخوردگی صحیح پروتئین نوترکیب است. بیان هم­زمان همولوگ سرمادوست چاپرون GroELS باکتری E.coli که در واقع چاپرون Cpn60 و Cpn10 از باکتری Oleispira antarctica است، برای باکتری E.coli، یک سیستم تازننده کارآمد در دمای 12-4 درجه سانتی­گراد فراهم می­آورد. در نتیجه سبب بهبود رشد میزبان در دمای پایین و افزایش حلالیت پروتئین می­گردد (45).

1-3-3. به­کارگیری فناوری پروتئین ادغامی

یکی از مشکلات طرح­های پروتئومیک عدم حلالیت پروتئین­های نوترکیب است. مطالعه­ها بیانگر این است که در باکتریE.coli  فقط نیمی از پروتئین­های نوترکیب (حتی پروتئین­های با منشأ باکتریایی) به­صورت محلول بیان می­شوند. طی سال­های اخیر ثابت شده است که برای ارتقا حلالیت پروتئین­های نوترکیب، می­توان آن­ها را با پروتئین­های حامل با قابلیت انحلال بالا فیوز کرد. باید دقت کرد که تمامی پروتئین­ها با قابلیت انحلال­پذیری بالا جهت افزایش حلالیت کارآمد نیستند (46،47). جهت کاهش ایجاد انکلوژن بادی راه­حل دیگری مطرح می­شود، که ژن هدف را در انتهای 3َ ژن کد کننده محصولی که به فرم محلول و مقدار بالا بیان می­شود، درج کنند. این پروتئین­های ادغامی متشکل است از: پروتئین متصل شونده به مالتوز MalE از باکتری E. coli (فاقد پپتید راهنما برای هدایت به خارج سلول)، تیوردوکسین، گلوتاتیون ترانسفراز از شیستوزوما، پروتئین A استافیلوکوکی. برای مثال اینترلوکین­هایIL6, IL4,IL3,IL2  حتی در دمای ^oC15 نیز به­صورت اینکلوژن بادی بیان می­شوند، اما بعد از ادغام توالی ژن آن­ها به ژن تیوردوکسین trxA، هریک از پروتئین­های نوترکیب به فرم محلول حاصل می­شوند و تا 20 درصد کل پروتئین سلول را تشکیل می­دهد (48).

علی­رغم موفقیت آمیز بودن این سیستم، ممکن است میزان تاخوردگی­های نادرست پروتئین­های ادغامی حتی نسبت­به نوع غیرادغامی پروتئین هدف افزایش یابد و یا با وجود محلول بودن، فاقد فعالیت زیستی باشند. برای مثال در فرآورده­های درمانی مانند فاکتور انعقادی Xa یا اینتروپپتیداز، دنباله ادغامی به­طور معمول کارآمد نیست، لذا باید حذف شود (49).

1-3-4. پروتئین NusA

علی­رغم این­که پروتئین­های ادغام شده برای افزایش قابلیت انحلال­پذیری، بایستی از انحلال­پذیری بالایی برخوردار باشند ولی تنها این خصوصیت کافی نیست و تاکنون مکانیسم دقیق پروتئین­ها شناخته نشده­است. علاوه­بر مکانیسم عمل افزایش انحلال­پذیری، تأثیر پروتئین­های ادغامی بر ممانعت از تشکیل انکلوژن بادی به­طور کامل آشکار است.  علی­رغم این­که پروتئین­های ادغامی انحلال­پذیر، تاخوردگی صحیح پروتئین هدف را تسهیل می­کنند، اما کارآمدی تاخوردگی پروتئین بیش­تر بسته به پروتئین هدف نیست. تاکنون برای افزایش انحلال­پذیری، پروتئین­های ادغامی گوناگون نظیر پروتئین­های متصل شونده به مالتوز و NusA معرفی شده­اند (50). لازم­به ذکر است که کارایی و ویژگی­های زیست شیمی این پروتئین­های ادغامی متفاوت از یکدیگر است. پروتئین NusA علاوه بر افزایش حلالیت، اغلب سبب بهبود تاخوردگی پروتئین هدف نیز می­شود. برخی پروتئین­های نامحلول در E.coli با اتصال انتهای آمینی پروتئین هدف به NusA به فرم محلول بیان خواهند شد. به­طور معمول پروتئین NusA به­صورت اتصال به دنباله هیستیدین به­کار گرفته می­شود (51).

1-3-5. انتقال به فضای پری­پلاسم

پروتئین هدف­گذاری شده برای هدایت به فضای پری­پلاسمی و یا خارج سلولی، باید از طریق غشای سیتوپلاسمی انتقال یابد. اغلب از طریق مسیرهای ترشحی عمومی که متشکل از پروتئین­های غشایی نظیر SecG, SecE, SecY, SecA است، عبور می­کنند. پروتئین­ها برای انتقال اغلب دارای یک نقطه با تاخوردگی کم و یا حاوی پپتید راهنما هستند. پپتید راهنما یک دنباله آمینی 30-8 اسیدآمینه­ای است که در حین انتقال دنباله مذکور به­وسیله آنزیم سیگنال پپتیداز حذف می­شود. در فضای پری­پلاسمی چاپرون­های خاصی وجود دارد که در تاخوردگی صحیح پروتئین و تشکیل پیوند دی­سولفیدی نقش به­سزایی دارد. به­علت فضای احیاکنندگی موجود در سیتوپلاسم، شرایط برای ایجاد تاخوردگی صحیح و تشکیل پیوند دی­سولفیدی محیا نیست. لذا بایستی پروتئین هدف را به پری­پلاسم هدایت کرد.

از مزایای دیگر انتقال پروتئین به پری­پلاسم باید متذکّر شد؛ علاوه­بر کاهش فراوانی پروتئاز­های پری­پلاسم نسبت­به سیتوپلاسم که در بخش بیان سیتوپلاسمی مطرح شد، تفکیک و جداسازی پروتئین های انتقال یافته به پری­پلاسمی در مقایسه با جداسازی مجدد از عصاره کل سلول ساده­تر است. از نگاهی دیگر، انتقال پروتئین به فضای پری­پلاسمی به­عنوان یک محدودیت برای بیان پروتئین­های نوترکیب با اندازه بزرگ و در حجم بالا، به حساب می­آید. اغلب زمانی­که پروتئین­های بزرگ به پپتید راهنما متصل می­شوند، دیگر قابلیت انتقال به پری­پلاسمی را ندارند (52).

1-3-6. شکل­گیری پیوند دی­سولفید درون سیتوپلاسم

یکی از عوامل محدودکننده تشکیل پیوند دی­سولفیدی درون سیتوپلاسمی ایجاد شرایط احیایی به علت وجود عواملی نظیر گلوتاتیون، تیوردوکسین­ها و گلوتاردوکسین­ها و هم­چنین عدم حضور آنزیم­های پری­پلاسمی نظیر DsbC و  DsbA در سیتوپلاسم است. آنزیم­های DsbC و  DsbA علاوه­بر این­که با فعالیت اکسیداسیونی جفت­ سیستئین­های پروتئین­ قابلیت ایجاد پیوندهای دی­سولفید را دارند، بلکه با استفاده از ویژگی دی­سولفید ایزومرازی، توانایی اصلاح پیوند تشکیل شده را نیز دارا نیستند (53).

به­تازگی پژوهشگران موفق شدند که جهش یافته­های دوتایی در ژن تیوردوکسین ردوکتاز و گلوتاتیون اکسیدوردوکتاز را جداسازی کنند. هر چند که از قابلیت بقا برخوردارند اما سرعت رشد پایینی دارند و فقط توسط احیاکننده خارجی مانند دی تیوتریتول القا می­شوند. با این وجود در شرایط عدم حضور دی تیوتریتول نیز مشتق باکتریایی با سرعت رشد بالا جداسازی شده است. به­طور معمول پروتئین فعالیت زیستی خود را در شرایطی که پیوند دی­سولفیدی به شکل صحیح تشکیل شود، به­دست می­آورد. برخی از این پروتئین­ها نظیر آلکالین فسفاتاز E. coli، مالتاز، اوروکیناز و فعال کننده پلاسمینوژن بافتی هستند.

به­تازگی سویه­های مهندسی شده نظیر Shuffle و Origami عرضه شده است که حاوی جهش در دو ژن تیوردوکسین ردوکتاز و گلوتاتیون اکسیدوردوکتاز هستند. برای جایگزینی انتقال پروتئین به فضای پری­پلاسمی می­توان با بهره­مندی از این سویه­های جدید پروتئین­ها را درون سیتوپلاسم با حفظ فرم فعالشان بیان کرد. هم­چنین با به­کارگیری دی­سولفید ایزومراز DsbC به بیان درون سیتوپلاسمی پروتئین هدف افزوده می­شود (54، 55).

2.                کلونینگ مجازی(in silico cloning)   

پیشرفت تکنولوژی سبب کسب اطلاعات بیش­تر در زمینه توالی DNA، ساختار و فرآیند رونویسی ژنوم در گونه­های مختلف شده است. این داده­ها در پایگاه­های اطلاعاتی DNA جمع­آوری شده که شامل بسیاری از ژن­هایی است که عملکرد بیولوژیکی آن­ها هنوز کشف نشده است. با استفاده از ابزارهای آنلاین بیوتکنولوژی می­توان ژن­های جدید و فرآیند رونویسی آن­ها را شناسایی کرد. شناسایی ژن­های جدید با استفاده از تجزیه و تحلیل پایگاه اطلاعاتی DNA به­عنوان کلونینگ مجازی شناخته می­شود. کلونینگ مجازی نه تنها اطلاعات جدیدی را در مورد ژن­ها و عملکرد بیولوژیکی آن­ها ارائه می­دهد، بلکه ممکن است منجربه شناسایی داروها و کشف فعالیت­های آن­ها شود.

در دهه 1980، آگاهی از اطلاعات ژنومیک و ارتقا سطح تکنولوژی برای تحقیقات زیست­شناسی، منجر به تشکیل کنسرسیوم­هایی با هدف توالی­یابی ژنوم باکتری، مخمر، کرم و انسان شد. که در سال 2001 اولین پیش­نویس ژنوم انسان منتشر شد (56). این توالی­های در دسترس از ژن­های مختلف به دانشمندان فرصت شناسایی ژن­ها و پروتئین­های جدید را داد. علاوه­بر در دسترس بودن توالی ژنومی، منبع دیگری به نام برچسب­ توالی بیان شده (EST) برای شناسایی پروتئین­های جدید استفاده می­شود (57).EST، توالی کوتاهی است، که از یک یا دو انتهای DNA مکمل (cDNA) تشکیل شده است. cDNA توسط آنزیم ترانسکریپتاز معکوس از روی توالی RNA ساخته می­شود.EST  به­صورت تصادفی از روی cDNA گونه­های مختلف تشکیل شده­است. آن­ها برای شبیه­سازی ژن­ها یا پروتئین­های جدید، نقشه­برداری از ژنوم و شناسایی مناطق کدگذاری در توالی ژنوم مفید هستند (58).

2-1. استفاده از پایگاه اطلاعاتی EST در کلونینگ مجازی

تلاش برای استفاده از پایگاه­ EST در وب سایت مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی (NCBI) شروع می­شود. گام بعدی این است که از طریق جستجوی همولوگ (Blast)، هماهنگی قابل توجهی بین ESTهای توالی DNA ترجمه شده و پایگاه اطلاعاتی DNA، پیدا شود. میزان هم­ترازی (Alignment) بین توالی­ها توسط e-value نشان داده می­شود. میزان پایین e-value، احتمال بالاتر بودن شباهت توالی EST را نسبت­به توالی همولوگ نشان می­دهد. این مقدار نه تنها بر اساس درجه شباهت بین توالی­ها، بلکه براساس طول توالی همولوگ نیز تعیین می­شود. از آن جهت که توالی­های EST کوتاه هستند (میانگین حدود 400-500 نوکلئوتید) و ممکن است توالی کدگذاری را نشان ندهد، توصیه می­شود که علاوه­بر میزان e-value، ترازهای واقعی (actual alignment)  نیز بررسی شود. از طرفی، علاوه­بر انتخاب و گزینش گام به گام پایگاه­های اطلاعاتی EST، ممکن است همولوژی توالی جدید با ژن­ها یا پروتئین­های شناخته شده، نمایش داده شود. به­عنوان نمونه: برای کلونینگ کانال کلسیم نوع T، در پایگاه اطلاعاتی EST توالی­های همولوگ با کانال کلسیم نمایش داده شد، که یک کلون EST با همولوژی 45%  با کانال کلسیم کلون شده یافت شد و درنهایت توالی کامل کانال کلسیم جدید تعیین شد (59،60).

در تمام رویکردها، پس از اولین تجزیه و تحلیل، توالی EST با پایگاه اطلاعاتی EST هم­تراز می­شود تا توالی­های هم­پوشانی شده را در سایت NCBI پیدا کند. علاوه­بر به­دست آوردن توالی همولوگ، بینش گسترده­ای را در فراوانی رونوشت­های ژنی در بافت­های مختلف فراهم می­کند. هم­چنین این اطلاعات را می­توان در جستجوگر UniGene-NCBI به­دست آورد. جست­وجوی UniGene اطلاعات مربوط به شباهت پروتئین در گونه­های مختلف، نقشه­برداری کروموزومی، بیان در بافت­های مختلف و یا این­که آیا توالی­های mRNA در دسترس هستند، را ارائه می­دهد.

2-2. استفاده از پایگاه­های اطلاعات ژنومی در کلونینگ مجازی

حضور EST در یک پایگاه اطلاعاتی به میزان بیان ژن در بافت­ها، که از کتابخانه ژنومی جمع­آوری شده، وابسته است. بنابراین ناکارآمدی استفاده از پایگاه EST در کلونینگ مجازی، این است که شناسایی رونوشت ژن­هایی با سطح بیان پایین و محدود دشوار است. توالی ژنومی شامل اگزون­ها و اینترون­ها هستند. برای رونویسی DNA به RNA اگزون­ها بریده و به یکدیگر متصل می­شوند و سپس به پروتئین­ها ترجمه می­شوند. برای شناسایی ژن­ها در پایگاه­ اطلاعات ژنومی، برنامه_­های مربوط به پیش­بینی ژن در دسترس است (مانند Gene scan)، که ساختار اگزون-اینترون ژن­ها را در توالی ژنوم شناسایی می­کنند. همولوژی توالی­های ژنومی می­تواند در پایگاه­های اطلاعاتی خانواده­های شناخته شده ژن­ها بررسی شود. ساختار ژن ممکن است در پایگاه ژنومی در دسترس باشد. علاوه­بر این، پروموتر و عناصر تنظیم کننده در توالی ژنوم نیز شناسایی می­شوند (61). گاهی اوقات در کلونینگ مجازی توالی کامل یک ژن یا پروتئین ارائه نمی­شود. در این حالت، طول کامل توالی ممکن است با بسط سریع انتهای cDNA، (RACE) به­دست آید. در این روش RNA رونویسی شده در بافت مورد نظر به cDNA تبدیل می­شود. لینکرهای الیگونوکلئوتیدی به انتهای 5 یا َ3   cDNAمتصل می­شوند. از طریق PCR، می­توان با ترکیبی از الیگونوکلئوتیدهای ژن مطلوب و الیگونوکلئوتیدهای مختص لیگاندها، انتهای َ5 و َ3 ژن مطلوب را گسترش داد (62).  

گام مهم در ارزیابی رونویسی ژن­های جدید، تجزیه و تحلیل بیان ژن مطلوب در بافت­های مختلف است، که با RT-PCR انجام می­شود. هم­چنین رونویسی­های جدید ممکن است با استفاده از تکنولوژی ریزآرایه­ یا غربالگری استخراج شوند. مزیت آن­ها شناسایی عملکرد رونویسی ژن جدید است، زیرا ژن مطلوب به­طور متقارن بین گروه­ کنترل و آزمایش هدف بیان شده است. سپس ژن بیان شده می­تواند به­صورت مجازی کلون شود (63).

نتیجه­گیری

تولید پروتئین­های نوترکیب به­عنوان یکی از مهم­ترین شاخه­های زیست­فناوری مدرن است. از این رو پروتئین­های یوکاریوتی فراوانی از جنبه دارویی و اقتصادی مورد توجه هستند. اگر­چه سیستم­های بیانی مختلفی به­عنوان میزبان برای تولید پروتئین­های نوترکیب مورد استفاده قرار می­گیرند، باکتری E.coli به­عنوان میزبان غالب استفاده می­شود. این پروتئین­ها به­طور کلی دارای ساختارهای سوم و چهارم هستند و نیاز به پیوندهای دی­سولفید و اصلاحات بعد از ترجمه برای رسیدن به فعالیت زیستی و ساختار فضایی مناسب دارند. تولید این پروتئین­ها در E.coli چالش­های فراوانی را می­طلبد؛ زیرا محیط سلولی، ماشین فولدینگ و نقاط کنترل­کننده کیفیت ساختارهای فضایی پروتئین در آن به­طور کامل با یوکاریوت­ها متفاوت هستند. یکی از معمول­ترین مشکلاتی که با آن روبرو هستیم تشکیل ­توده­های پروتئینی اینکلوژن­بادی­ها است. افزایش محصول یک پروتئین نوترکیب و دست­یابی به ساختار صحیح و هم­چنین کاهش میزان رسوب پروتئین هدف در سلول در طی تولید، همیشه ذهن محققین را به خود معطوف ساخته است. بدین منظور طی سال­های اخیر و با پیشرفت روش­های مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، استراتژی­های متعددی برای افزایش بازدهی میزان حلالیت به­کار گرفته شده است. از جمله این روش­ها تغییر سرعت سنتز پروتئین­ها، استفاده از پروتئین­های اتصالی فیوژن، موتاسیون در پروتئین هدف، شرایط مساعد کشت و بیان هم­زمان چاپرون­های مولکولی است. معرفی توان و کاربرد هریک از این راه­کارها عمده هدف تحقیق حاضر است. در این راستا ترکیبی از تکنولوژی توالی­یابی، بیوانفورماتیک و تجزیه و تحلیل مجازی باعث افزایش سهولت پیش­بینی نقش ژن و تفسیر عملکرد آن خواهد بود. مجموعه این تکنیک­ها به­عنوان کلونینگ مجازی امروزه مورد استفاده قرار می­گیرد.