تأثیر سیلیمارین بر قند خون و بیان ژن Hnf4a
در رتهای نر ویستار دیابتی شده با استرپتوزوتوسین
فرشید غیبی حاجیور، سجاد نیکخواه، رحمان جعفری هفشجانی*
گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران
چکیده
سابقه و هدف: دیابت باعث کاهش سلولهای بتا و اختلال در عملکرد آنها میشود سیلی مارین این اختلال و کاهش را بهبود میبخشد و همچنین بهطور قابل توجهی باعث افزایش بیان انسولین میشود و هدف از این مطالعه بررسی تأثیر سیلیمارین بر قند خون و بیان ژن Hnf4a در رتهای نر دیابتی شده با استرپتوزوتوسین است.
مواد و روشها: در این تحقیق ۴۲ سر رت نر بهصورت تصادفی انتخاب شدند و به 7 گروه ششتایی تقسیم شدند، رتهای دیابتی با ماده استرپتوزوتوزسین دیابتی شدند و قند خون ناشتای آنها سنجیده شد. سپس به گروههای دریافت کننده سیلیمارین دوزهای 50، 100 و 150 داده شد. سپس رتها با دارو بی هوش و تشریح شدند. مقداری از بافت پانکراس جداسازی و برای بررسی بیان ژن Hnf4a بهروش Real-time PCR استفاده شد.
یافته ها: بررسی بیانHnf4a در دوز 150 میلیگرم بر کیلوگرم در رتهای دریافت کننده سیلیمارین نشان داد که در این دوز کاهش چشمگیری در ژن Hnf4a و بهعنوان دوز مؤثر معرفی میگردد (05/0P-Value< ) و میتوان در آینده از سیلیمارین بهعنوان یک داروی گیاهی برای درمان دیابت استفاده نمود.
نتیجه گیری: با بررسی نتایج بهدست آمده از این پژوهش میتوان گفت گیاه سیلیمارین دارای اثرهای ضد التهابی است و میتواند در کاهش قند خون در بیماری دیابت مؤثر واقع شود.
واژه های کلیدی: Hnf4a، سیلیمارین، رت، استرپتوزوتوسین.
مقدمه
ژن عامل هستهای کبد [1]Hnf4a یک عامل رونویسی است که عملکرد بسیار مهمی در تمایز ریختشناسی و عملکرد کبد ایفا میکند و همچنین بهعنوان عامل برجسته در تمایز هپاتوبلاستها بهحالت بالغ عمل میکند. این ژن بیان چندین ژن کبدی را بر عهده دارد. این ژن در توسعه کبد، کلیه و روده نقش دارد و جهش در این ژن با دیابت نوع اول در ارتباط است. همچنین بهتازگی مشخص شده است که Hnf4a یک تنظیم کننده بیان میکرو RAN (122) است و افزایش بیان این عامل طی تکامل کبدی جنین موش همجهت با افزایش بیان miR-122 است و این مطالعهها نشان دهنده نقش Hnf4a در تکامل کبد است (12، 25). ژن Hnf4a دارای 13 اگزون بوده و در انسان در موقعیت 20q13.12 قرار دارد. طی تحقیقی با استفاده از روشهای آماری دانشمندان بیان کردند که خانواده let-7 از میکرو RNAها بهعنوان یک تنظیم کننده منفی برای عامل هستهای کبدی (Hnf4a) عمل میکند. همچنین با استفاده از Real-time PCR سطح بیان خانواده Let-7 را در سلولهای HepG2 و MSC (یک رده سلولی کبد که سطح بالایی از Hnf4a را بیان میکند) مقایسه کردند که نتایج نشان داد که سطح بیان خانواده Let-7 در سلولهای HepG2 بسیار پایین بوده و این نتیجه بیان کننده نقش خانواده Let-7 در تنظیم بیان Hnf4a است (14).
استفاده از گیاهان دارویی از اولین درمانهای دیابت بوده است. داورهای گیاهی نسبتبه داورهای شیمیایی دارای سمیت کمتر و اثرهای جانبی کمتر هستند و اقبال عمومی برای مصرف آنها بیشتر است (4). از جمله گیاهان مؤثر در کاهش قند خون میتوان به خار مریم، خیار تلخ، شنبلیله، سیاهگیله و هندوانه ابوجهل اشاره کرد. گیاه خار مریم (Silybum marianum (L.) Gaertn) یک گیاه یک یا دو ساله از خانواده کاسنیان است که در درمان اختلالها و بیماریهای کبد استفاده می شود. این گیاه بومی جنوب اروپا و شمال آفریقا است و در مناطق مختلف ایران بهخصوص البرز مرکزی، خوزستان و آذربایجان رویش دارد. عصاره بذر گیاه خار مریم حاوی یک ترکیبهای فلاونوئیدی بهنام سیلیمارین است. فلاونوئیدها از ﺗﺮﻛﻴبهای ﺑﺴﻴﺎر ﻣﻬﻢ اﻛﺜﺮ ﮔﻴﺎﻫﺎن داروﻳﻲ، ﺳﺒﺰﻳﺠﺎت و ﻣﻴﻮهﻫﺎ هستند، فلاونوئیدها از ﻗﺒﻴﻞ ﻛﻮﺋﺮﺳﺘﻴﻦ ﻣﻮﺟﺐ ﺗﺮﺷﺢ اﻧﺴﻮﻟﻴﻦ و ﻣﻬﺎرﻛﻨﻨﺪه ﻗﻮی ﺗﺠﻤﻊ ﺳﻮرﺑﻴﺘﻮل در بافتهای ﺑﺪن است. سیلیمارین دارای خواص آنتیاکسیدان و افزایش میزان گلوتاتیون سلولی و ثبات غشای سلولی در طب سنتی جهت بهبود اختلالهای کبد تجویز میشود. تجویز این دارو برای افراد مبتلا به بیماریهای کبدی موجب افزایش حساسیت سلولی به انسولین و درنتیجه کاهش میزان قند خون شده است. سیلیمارین خواص مختلفی ازجمله: محافظت از کبد، فعالیت آنتیاکسیدانی، ضدالتهابی و ضد سرطان و همچنین ضد دیابت دارد (7، 18).
دیابت باعث کاهش سلولهای بتا و اختلال در عملکرد آنها میشود که سیلیمارین آن را بهبود میبخشد و همچنین بهطور قابل توجهی باعث افزایش بیان انسولین میشود. سیلیمارین شامل مخلوطی از چند ترکیب فنولی است که ایزومراز هم هستند که این ترکیبهای سلیبین، ایزوسیلیبین، سیلیکریستین و سیلیدیانین نامیده میشوند. با توجهبه عوارض جانبی کمتر گیاهان دارویی در این مطالعه به بررسی تأثیر سیلیمارین بر قند خون و بیان ژن Hnf4a در رتهای نر ویستار دیابتی شده با استرپتوزوتوسین پرداخته شد.
روش کار
جامعه مورد مطالعه و گروه بندی
در این تحقیق تعداد 42 سر رت نر ویراستار به وزن 220-180 از شرکت دانته شهرکرد خریداری گردید و به اتاق حیوانات واقع در دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد انتقال داده شد. حیوانات در قفسهای مخصوص خود نگهداری شدند و آب و غذا به اندازه کافی در اختیارشان قرار داده شد. برای تغذیه حیوانات از غذای مخصوص موش از شرکت خوراک دام کابیله اصفهان تهیه شده بود استفاده گردید و آب لولهکشی توسط شیشههای آبخوری در اختیارشان قرار میگرفت. سپس رتها در 7 گروه 6 تایی دستهبندی و در قفسهای مجزا نگهداری شدند آب و غذا برای همه یکسان بود و همچنین شرایط اتاق حیوانات در تمام طول دوره مطالعه در دمای 22-25 و رطوبت نسبی 50 درصد و سیکل روشنایی- تاریکی 12 ساعت در شبانه روز حفظ شد. لازمبه ذکر است که گروه A شامل سالم شاهد بودند که هیچ دارویی دریافت نکردند. گروه B شامل بیمار دیابتی (شاهد دیابتی) بودند که این گروه نیز هیچ دارویی دریافت نکردند. گروه C بیمار دیابتی که سیلیمارین را با دوز 50 میلیگرم بر کیلوگرم دریافت کردند و تعداد دفعات دریافت دارو 10 بار بود. گروه D بیمار دیابتی که سیلیمارین را با دور 100 میلیگرم بر کیلوگرم دریافت کردند و تعداد دفعات دریافت دارو 10 بار بود. گروه E بیمار دیابتی که سیلیمارین را با دور 150 میلیگرم بر کیلوگرم دریافت کردند و تعداد دفعات دریافت دارو 10 بار بود. گروه F بیمار دیابتی که متفورمین را با دور 150 میلی گرم بر کیلوگرم دریافت کردند و تعداد دفعات دریافت دارو 10 بار بود. گروه G شامل گروه سالم که سیلیمارین را با دور 150 میلیگرم بر کیلوگرم دریافت کردند و تعداد دفعات دریافت دارو 10 بار بود.
گروههای مورد آزمایش شامل شش سر رت نژاد ویستار بود که همه گروهها بهجز گروه شاهد سالم (A) و گروه شاهد دیابتی (B)، هر سه روز یکبار طی یک ماه (10 نوبت در ماه) دوزهای مختلف داروهای سیلیمارین و متفورمین حل شده در آب مقطر را بهصورت خوراکی (گاواژ) دریافت کردند.
قبل از انجام آزمایش تمامی موشها با استفاده از دستگاه گلوکومتر BIONAM ساخت کشور تایوان و با اخذ یک قطره خون از طریق دم، گلوکز خون آنها اندازهگیری شد.
برای ایجاد دیابت از داوری استرپتوزتوزسین (STZ) (خریداری شده از شرکت مرک آلمان) با دوز 50 میلیگرم بر هر کیلوگرم وزن رت (mg/kg 50) محلول در بافر سیترات 1/0 مولار با اسیدیته 5/4 با یکبار تزریق درون صفاقی دیابتی شدند. اثبات دیابتی بودن قند خون رتها 72 ﺳﺎﻋﺖ از زﻣﺎن ﺗﺰریﻖ (STZ) در ﻣﺤﺪوده بالاتر از 240 میلیﮔﺮم بر دﺳﯽﻟﯿﺘﺮ بود (29،30). سنجش قند خون همه گروهها هر ده روز یکمرتبه با رعایت 8 ساعت محرومیت از غذا انجام و گلوکز خون ثبت گردید. پس از پایان دوره آزمایش در روز سیام حیوانات بهمدت 12 ساعت ناشتا نگه داشته شدند و سپس با استفاده از کلروفرم بیهوش شده پس از تشریح، مقداری از بافت پانکراس به نسبت 1 به 4 در مایع حاوی RNAlater جهت اندازهگیری بیان ژن Hnf4a ذخیره شد. برای اندازهگیری بیان ژن مورد بر بررسی در پژوهش حاضر از روش Real-time PCR (RT –qPCR) استفاده شد. قابل توجه است که RNA پس از استخراج دستخوش تغییرهایی خواهد شد و برای رفع این مشکل بلافاصله پس از برداشت باید در مجاورت محلول ثبیت کننده (RNA later) قرار گیرد و همچنین بهدلیل حساسیت بالا تمام لوازم مورد نیار با محلول DEPC 1 درصد تیمار شدند (10).
انجام تکنیک Real-time PCR
استخراج RNA از بافت پانکراس بهوسیله هاون و ازت مایع و ترایزول ساخت شرکت کیان مطابق پروتکل استاندارد شرکتهای سازنده انجام گردید و Total RNA استخراج شد و سپس برای حذف آلودگی ژنومی از کیت آنزیم DNase (شرکتThermo ) مطابق دستورالعمل این شرکت استفاده شد. لازمبه ذکر است که پس از استخراج RNA برای اطمینان از کافی بودن آن و همچنین میزان خلوص و عدم آلودگی ژنومی آن، از نظر کیفی بهواسطه لود کردن روی ژل آگارز 2 درصد و هم از نظر کمی بهوسیله دستگاه نانودراپ میزان خلوص (OD) آن اندازهگیری شد که غلظت همه غلظت RNAها بیشتر از ng/µl 9000 بود.
سپس مقداری از RNA برای ساخت cDNA استفاده شد. به این منظور از کیت سنتز cDNA شرکت تاکارا طبق دستورالعمل شرکت سازنده این کیت استفاده شد. برای تعیین میزان بیان ژن Hnf4a از ژن GAPDH بهعنوان ژن کنترل داخلی (رفرنس) استفاده شد. پرایمرهای انتخابی این ژنها ساخت شرکت ماکروژن کشور کره جنوبی بودند. الگوی پرایمرهای مورد استفاده در پژوهش در جدول شماره (1) آمده است. همچنین اندازه باند پرایمرهای استفاده شده برای ژن Hnf4a 282bp بود.
جدول 1. پرایمرهای طراحیشده برای ژن Hnf4a و GAPDH
توالی |
پرایمر |
5′-ACAGACATAC GTGCAAGCAA-3′ |
Hnf4a Forward |
5′-CATCATTTTG TTCTGCGGTGT-3′ |
Hnf4a Reverse |
5′-TGGTGAAGGTCG GTGTGAACGGAT-3′ |
GAPDH Forward |
5′-TCCATGGTGGTG AAGACGCCAGTA-3′ |
GAPDH Reverse |
در مرحله بعد بهوسیله سیستم روتورژن 6000 و با استفاده از کیت سایبر مستر ریلتایم ساخت شرکت تاکارا کشور ژاپن مطابق دستورالعمل آن استفاده شد پروتکل دمایی مورداستفاده در دستگاه روتورژن در روش Real-time PCR در جدول شماره (2) آورده شده است.
در انتها CTهای مربوط به واکنشها توسط نرمافزار سیستم Real-time PCR استخراج و ثبت گردید. بعد از اتمام واکنش Real-time PCR سیکل آستانه هر نمونه بهصورت جداگانه بهدست آمد؛ که با مقایسه سیکل آستانه ژن Hnf4a با ژن مرجع (GAPDH)، میتوان میزان بیان ژن موردنظر را بهصورت کمی از فرمول fold change =2-∆∆ct بهدست آورد و میزان بیان ژن Hnf4a در هفت گروه مختلف اندازهگیری شد.
یافتهها
تغییرهای قند خون رتها
در این پژوهش ابتدا تغییرهای قند خون در گروههای مورد مطالعه بررسی شد. برای اندازهگیری قند خون هر 10 روز یک بار قند خون ناشتای رتها (14 ساعت گرسنگی) با خونگیری از ناحیه دم و با استفاده از دستگاه گلکومتر اندازهگیری شد و نتایج گروههای تیمار و شاهد در نمودار (1) آمده است.
جدول 2. پروتکل دمایی مورداستفاده برای ژن Hnf4a در دستگاه روتورژن
تعداد سیکل |
دما |
مدت زمان |
مرحله |
1 سیکل |
ºC94 |
4 دقیقه |
دناتوره اولیه |
|
ºC94 |
20 ثانیه |
دناتوره شدن |
40 سیکل |
ºC60 |
20 ثانیه |
اتصال |
|
ºC72 |
20 ثانیه |
گسترش |