دوره 10، شماره 39 - ( 4-1399 )                   جلد 10 شماره 39 صفحات 38-29 | برگشت به فهرست نسخه ها

XML English Abstract Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Khani F, Keramati M, Kazemi B, Amini Tehrani Z, Shahcheraghi F. Optimization of pH and glucose concentration of culture media for enhancement of hyaluronic acid production by Streptococcus equisimilis group C and G. NCMBJ 2020; 10 (39) :29-38
URL: http://ncmbjpiau.ir/article-1-1289-fa.html
خانی فاطمه، کرامتی ملیحه، کاظمی بنفشه، امینی تهرانی زهرا، شاهچراغی فرشته. بهینه سازی pH و غلظت گلوکز محیط کشت جهت افزایش تولید هیالورونیک‌اسید توسط سویه‌های Streptococcus equisimilis گروه‌های Cو G. مجله تازه هاي بيوتكنولوژي سلولي و مولكولي. 1399; 10 (39) :29-38

URL: http://ncmbjpiau.ir/article-1-1289-fa.html


دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان
متن کامل [PDF 4196 kb]   (2141 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (3738 مشاهده)
متن کامل:   (1029 مشاهده)

تولید هیالورونیک­اسید توسط سویه­های Streptococcus equisimilis گروه­های  Cو  G

فاطمه خانی1، ملیحه کرامتی 2، بنفشه کاظمی1، زهرا امینی تهرانی2، فرشته شاهچراغی3

1- دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان

2 - بخش نانوبیوتکنولوژی، انستیتو پاستور ایران ، تهران           

3- بخش میکروب شناسی، انستیتوپاستور ایران، تهران


چکیده

سابقه و هدف: هیالورونیک­اسید بیوپلی­مری طبیعی و خطی است که به­دلیل خصوصیت ویسکوالاستیک، ظرفیت بالای جذب آب و زیست­سازگاری کاربردهای وسیعی در پزشکی، دارورسانی و صنایع آرایشی دارد. امروزه تولید صنعتی آن از طریق فرمنتاسیون سویه­های استرپتوکوکی است. تحقیق کنونی گزارشی از غربالگری و بهینه­سازی شرایط تولید هیالورونیک­اسید توسط سویه­های استرپتوکوکی بالینی گرو ه­های C و G جدا شده از بیماران ایرانی است.

مواد و روش­ها: یازده سویه استرپتوکوک اکوئیسیمیلیس(S.equisimilis)  شامل نه سویه گروه C و دو سویه گروه G شناسایی و تولید اولیه هیالورونیک­اسید به­روش کمپلسومتری با کاربازول تعیین شد و بر اساس نتایج سه سویه با بیش­ترین تولید جهت بهینه­سازی انتخاب شدند. جهت تعیین pH بهینه، دوازده نقطه در دامنه 1/3-5/7 و غلظت گلوکز در یازده نقطه در دامنه 3/0تا 15 میلی­گرم در میلی­لیتر و در pH بهینه ارزیابی و بازده هیالورونیک­اسید توسط سویه­های منتخب تعیین شد. 

یافته­ ها: میانگین غلظت هیالورونیک­اسید تولید شده در یازده سویه بالینی بین6/216 تا 7/729میکروگرم در میلی­لیتر متغییر بود. سه سویه با بیش­ترین تولید شامل سویه­های GCS-08،GGS-88 و GGS-132و میانگین غلظت هیالورونیک­اسید به­ترتیب 0/573، 7/579 و 7/729میکروگرم در میلی­لیتر جهت مطالعه­های بهینه­سازی انتخاب شدند. pH بهینه و مقدار هیالورونیک­اسید برای هر سویه به­ترتیب (5/6  pHو 3/744)GCS-08 ، (8/4 pH و 9/598) GGS-88 و (8/6 pH و 8/1041)  GGS-132بود. کشت در محیط حاوی گلوکز با غلظت 15 میلی­گرم در میلی­لیتر باعث افزایش تولید هیالورونیک­اسید توسط سویه­ها به­ترتیب 6/1096GCS-08: ، 3/1234 GGS-88:و 6/ 1993GGS-13: میکروگرم در میلی­لیتر شد.

نتیجه­گیری: نتایج نشان دهنده اثر معنی­دار pH و رابطه مستقیم غلظت گلوکز بر بازده هیالورونیک­اسید است که می­تواند باعث افزایش تولید تا 73/2برابر شود. شناسایی سویه تولید کننده در pH اسیدی 8/4 مزیتی برای تولید صنعتی هیالورونیک­اسید در شرایط غیر معمول است.

واژه­ های کلیدی: هیالورونیک­اسید،S.equisimilis ، فرمنتاسیون، بهینه­سازی، گلوکز،pH


 

مقدمه

هیالورونیک­اسید بیوپلی­مر خطی طبیعی مشتمل بر تکرار واحدهای دی ساکاریدی بتا-1و4 گلوکورونیک­اسید و بتا 1و3 ان- استیل گلوکزامین با وزن مولکولی متنوع از 5000 دالتون تا 20 میلیون دالتون است (1). به­دلیل ویسکوزیته عالی، ظرفیت جذب آب فوق­العاده بالا، غیرایمونوژن و زیست­سازگاری کاربرد بیولوژیک، داروسازی و مهندسی بافت، ترمیم زخم، جراحی چشم و مفاصل و جراحی­های زیبایی پیدا کرده است (2). روش­های اولیه تولید صنعتی آن استخراج از چشم گاو و تاج خروس است که به­دلیل کیفیت متغییر و پتانسیل آلودگی با ویروس­ها امروزه با روش­های تخلیص از باکتری­های تولیدکننده کپسول هیالورونیک­اسید از جمله استرپتوکوک­ها جایگزین شده است (3). مهم­ترین سویه­های گسترده­ای در پیشگیری و درمان بیماری­ها، تحقیقات پزشکی و به­کار برده شده به این منظور شامل استرپتوکوک پیوژنز (S.pyogenes) استرپتوکوک اکوئیسیمیلیس (S. equisimilis) و استرپتوکوک زواپیدمیکوس (S.zooepidemicus) هستند. تحقیقات نشان داده است که تولید هیالورونیک­اسید در استرپتوکوک­ها با مکانیسم یکسان و با پلی­مریزاسیون پیش­سازهای مونوساکاریدی توسط آنزیم هیالورونیک­اسید سنتاز انجام می­شود (4). استفاده از سویه­های میکروبی به­دلیل امکان کنترل شرایط رشد، کنترل روش­های فرمنتاسیون، استخراج و خالص­سازی منجر به بهبود فرآیند و بازده تولید و کیفیت فرآورده شده است. در فرآیندهای فرمنتاسیون مهم­ترین عوامل تأثیرگذار در بازده فرآیند انتخاب سویه مناسب، بهینه­سازی شرایط کشت و تولید و استفاده از روش­های بهینه خالص­سازی است. مطالعه­ها نشان می­دهد که بهینه­سازی شرایط کشت از قبیل دما، pH، میزان هوادهی، سرعت هم­زدن، میزان اکسیژن حل شده، میزان استرس ناشی از pH و نوع راکتور زیستی به­طور قابل توجهی تولید هیالورونیک­اسید را تحت تأثیر قرار می­دهند (5). بیوسنتز هیالورونیک­اسید فرآیند چند مرحله­ای است. که با رشد سلول و ساخت دیواره باکتریایی در پیش­سازهایی از قبیل گلوکز 1- فسفات، UDP- گلوکز و UDP-N- استیل گلوکز آمین مشترک است و رقابت بین بیوسنتز هیالورونیک­اسید و رشد سلول برای مصرف این پیش­سازها وجود دارد، بنابراین کنترل منابع کربنی و شرایط رشد در کاهش میزان تشکیل توده سلولی و افزایش میزان هیالورونیک­اسید مؤثر است (6). در بررسی منابع کربنی، گلوکز مؤثرترین ماده شناسایی شده است با این حال افزایش غلظت آن گاهی تأثیر چندانی در تولید هیالورونیک­اسید نداشته و افزایش به نفع رشد و افزایش توده سلولی است. میزان اسیدیته محیط تولید به­طور قابل توجهی در بازده تولید مؤثر است کاهش pH از حد بهینه آن منجر به کاهش رشد باکتری و در نتیجه کاهش تولید هیالورونیک­اسید می­شود (7).

سرعت تولید هیالورونیک­اسید وابسته­به سرعت واکنش­های مسیر بیوسنتز هیالورونیک­اسید در سویه­ های استرپتوکوکی است. مقایسه بیوسنتز هیالورونیک نشان داده است که سرعت واکنش­ های آنزیمی هیالورونیک­اسید سنتاز در سویه­های استرپتوکوک اکوئیسیمیلیس 2-4/2 برابر بیش­تر از سویه­های استرپتوکوک پیوژنز و استرپتوکوک زواپیدمیکوس است (8). هم­چنین این سویه­ها پروتئین­های ترشحی کم­تری نسبت­به استرپتوکوک پیوژنز دارند که این موضوع موجب کاهش پیچیدگی فرآیندهای تخلیص و در نتیجه افزایش کیفیت و بازده تخلیص بیوپلی­مر خواهد شد (4). در مطالعه کنونی ابتدا با غربالگری سویه­های استرپتوکوک اکوئیسیمیلیس گروه­هایC(GCS)  و G(GGS) جدا شده از بیماران ایرانی مقدار هیالورونیک­اسید تولید شده در هر یک از سویه­ها تعیین شد و سپس بررسی شرایط بهینه برای سویه­های منتخب و تأثیر pH و گلوکز به­عنوان دو عامل بسیار مهم در بازده هیالورونیک­اسید مورد ارزیابی قرار گرفت. لازم­به ذکر است هیچ گزارش قبلی در مورد تعیین مقدار و بررسی تولید هیالورونیک­اسید در استرپتوکوک اکوئیسیمیلیس گروه  Gوجود ندارد. به­طور مسلم شناسایی سویه­های تولید کننده مؤثر و کم خطر و تعیین شرایط حداقلی جهت حداکثر تولید موجب کاهش هزینه­های تولید هیالورونیک­اسید در مقیاس صنعتی خواهد شد.

مواد و روش­ها: 

مشخصات سویه­ها، شرایط رشد و نگهداری:

سویه­های مورد استفاده در این تحقیق، سویه­های استرپتوکوک اکوئیسیمیلیس گروهC  (9 سویه) و گروه G (2 سویه) ایزوله­های غیر تهاجمی جدا شده از گلو و شناسایی شده در طی تحقیق انجام شده در انستیتو پاستور ایران است (9). این سویه­ها به­صورت لیوفیلیزه در دمای 4 درجه سانتی­گراد نگهداری شده اند. با این حال مجدد پس از کشت و رشد در محیط کشت (ایبرسکو، ایرانBrain Heart Infusion (BHI, آزمون­های بررسی هاله لیز در محیط کشت بلاد آگار و آزمون­های بیوشیمیایی با استفاده از قندهای لاکتوز، سوربیتول، تره هالوز و ریبوز انجام شد (10).

غربالگری اولیه و تعیین مقدار هیالورونیک­اسید در سویه­های گروهGGS, GCS

غربالگری اولیه سویه­ها بر اساس مورفولوژی و مشاهده کلنی­های موکوئیدی ناشی از تولید کپسول هیالورونیک­اسید و نیز بر اساس قطر هاله همولیز پس از رشد در محیط کشت بلاد آگار انجام گرفت. سپس جهت تعیین مقدار کمی هیالورونیک­اسید، چند کلنی از هر یک از سویه­ ها از محیط بلاد آگار به 5 میلی­لیتر محیط کشت BHI انتقال داده شد پس از یک شبانه روز کشت و تعیین مقدار دانسیته نوری در 600 نانومتر، هر یک از سویه­ها به­نسبت V/V 10%  در دانسیته نوری 5/0 پس از سانتریفیوژ و شستشو با 10 میلی­لیتر بافر فسفات به محیط تولید شامل اجزا ذکر شده در جدول 1 در pH حدود 0/7، تلقیح شد. رشد در دمای 37 درجه سانتی­گراد و سرعت 200 دور در دقیقه به­مدت 16 ساعت برای کلیه سویه­ها انجام شد.

جدول 1- مواد و مقادیر لازم جهت تهیه محیط تولید هیالورونیک­اسید pH  حدود 0/7

(mg/ml)غلظت

مواد

5/1

Na2HPO4.12H2O

5/0

KH2PO4

5/0

Mg2SO4.7H2O

10

Yeast Extract

5

Glucose

 

 

استخراج هیالورونیک­اسید

جهت آزاد شدن کپسول هیالورونیک­اسید، معادل حجم اولیه محیط تولید، نرمال سالین حاوی (w/v) 1/0 % SDS اضافه و به­مدت 10 دقیقه به آرامی مخلوط شد. سپس با سانتریفیوژ 13000 دور در دقیقه به­مدت 5 دقیقه توده سلولی جداسازی شد. به­منظور حذف پروتئین­های موجود در سوپرناتانت محلول تری­کلرواستیک­اسید 100% با نسبت 1:4 اضافه و انکوباسیون شبانه در دمای 4 درجه سانتی­گراد انجام شد. پس از حذف پروتئین با رسوب­دهی، جهت جداسازی هیالورونیک­اسید چهار برابر حجم محلول باقی مانده، اتانول مطلق اضافه شد با سانتریفیوژ 15000 دور در دقیقه به ­مدت 20 دقیقه رسوب هیالورونات­سدیم جمع­آوری شده و در نهایت رسوب در 200 میکرولیتر آب حل شد(11)

.بررسی میزان تولید هیالورونیک­اسید با استفاده از واکنش کاربازول و رسم منحنی استاندارد گلوکورونیک­اسید

 به­منظور تعیین غلظت هیالورونیک­اسید استخراج شده، از گلوکورونیک­اسید با غلظت­های متغییر50-400 میکروگرم در میلی­لیتر (400 و 50،100،150،200،300) به­میزان 50 میکرولیتر و 50 میکرولیتر از نمونه استخراج شده و رقیق شده با آب با نسبت­های 1:32 و 1:16 به چاهک­های پلیت 96 خانه­ای اضافه شد. 200 میکرولیتر از محلول سدیم بورات حل شده در سولفوریک­اسید با غلظت 25 میلی­مولار به نمونه­ها و استانداردها اضافه شده و سپس در 80 درجه سانتی­گراد به­مدت20 دقیقه در آون انکوبه شد. بعد از سرد شدن تا حد دمای اتاق کاربازول % 125/0 ( 50 میکرولیتر) حل شده در اتانول مطلق با دقت افزوده شد و مجدد در دمای 80 درجه سانتی­گراد به­مدت 20 دقیقه دیگر انکوبه شد. پس از سرد شدن به­مدت 15 دقیقه در دمای اتاق، جذب نوری در 550 نانومتر قرائت شده و پس از رسم منحنی استاندارد، غلظت بیوپلی­مر تعیین شد. کلیه غلظت­های مربوط­به منحنی استاندارد و نمونه­ها در تکرارهای سه­تایی انجام شد و میزان انحراف از استاندارد، انحراف نسبی و ضریب هم­بستگی خط در هر بار آزمون مورد ارزیابی قرار گرفت تا از صحت، تکرارپذیری و خطی بودن منحنی استاندارد و شرایط صحیح آزمون اطمینان حاصل شود. دقت تعیین مقدار در روش کمپلکسومتری با کاربازول در مورد پلی-ساکاریدهای دارای واحدهای گلوکورونیک­اسید مانند هیالورونیک­اسید در حد یک میکروگرم در میلی­لیتر است (12).

بررسی اثرهای  pHو میزان گلوکز در بازده هیالورونیک­اسید

پس از تعیین مقدار کمی تولید هیالورونیک­اسید در هر یک از سویه­ها، اثرهای pH و غلظت گلوکز در میزان تولید در مورد سه سویه منتخب ((GGS-132, GGS-88, GCS-08 بررسی شد. بدین منظور ابتدا محیط کشت مطابق جدول 1 و با غلظت گلوکز 5 میلی­گرم در میلی­لیتر تهیه شد با این تفاوت که pH با افزودن اسید فسفریک و یا هیدروکسیدسدیم در 12 نقطه تعیین شده مطابق جدول 2 تنظیم شد. تولید، استخراج و تعیین مقدار هیالورونیک­اسید برای هر یک از سویه­های منتخب همانند روشی که توضیح داده شد انجام شد پس از تعیین شرایط بهینه pH برای هر یک از سویه­ها محیط تولید شامل مقادیر مختلف گلوکز مطابق جدول 2 تهیه و مجدد تعیین مقدار هیالورونیک­اسید برای سه سویهGGS-132 GGS-88, GCS-08 انجام شد.

جدول 2- دامنه pH و غلظت- های مختلف گلوکز

pH

8/4

5/4

1/4

8/3

5/3

1/3

5/7

8/6

5/6

0/6

8/5

5/5

غلظت گلوکز (میلی­گرم در میلی­لیتر)

0/3

4/2

5/1

9/0

3/0

-

0/15

5/10

0/9

5/7

0/6

6/4

 

آنالیز آماری

جهت مقایسه بازده هیالورونیک­اسید در سویه­های منتخب GCS-08، GGS-88 و GGS-132 و نیز تعیین اثرهای عوامل pH و غلظت گلوگز بر بازده، اساس آزمونt.test  با استفاده از نرم­افزار SPSS 22 انجام شد و ارزش p کم­تر از 05/0 معنی­دار در نظر گرفته شد.

یافته­ها

شناسایی سویه­های استرپتوکوک اکوئیسیمیلیس  و تعیین اولیه مقدار هیالورونیک­اسید

مورفولوژی و هاله لیز و تخمیر قندها یازده سویه استرپتوکوکی شامل نه سویه متعلق­به گروهC  و دو سویه متعلق­به گروهG  مورد ارزیابی قرار گرفت. نتیجه کشت دو سویه منتخب GGS-88, GCS-08 که نشان دهنده کلنی­های بزرگ خاکستری رنگ موکوئیدی است در شکل شماره 1 آمده است.

شکل 1- نتایج همولیز GCS-08, GGS-88 در محیط کشت بلاد آگار که همولیز گاما و تشکیل کلونی­ها بزرگ خاکستری رنگ و موکوئیدی GGS-88و همولیز بتا و کلنی­های سفید رنگ GCS-08 قابل مشاهده است.

پس از تأیید کلیه سویه­ها، تعیین مقدار هیالورنیک­اسید کشت­های باکتریایی در تکرارهای سه­تایی برای هر سویه و براساس منحنی استاندارد انجام شد. منحنی استاندارد (شکل2) با استفاده از غلظت­های مختلف گلوکورونیک­اسید در برابر جذب نوری و ضریب هم­بستگی 9902/0 نشان­دهنده ارتباط خطی بین مقدار گلوکورونیک­اسید و جذب نوری است. در روش سنجش مقدار هیالورونیک­اسید با کاربازول افزودن اسیدسولفوریک در دمای بالا موجب تجزیه هیالورونیک­اسید به مونومرهای تشکیل­دهنده آن یعنی گلوکورونیک­اسید و ان-استیل­گالاکتوز آمین و تبدیل گلوکورونیک­اسید به یورونیک­اسید می­شود که با کاربازول کمپلکس پایدار بنفش رنگ پایداری را تشکیل خواهد داد ( شکل 2 ).

شکل 2- شکل بالا: منحنی استاندارد غلظت­های مختلف گلوکورونیک­اسید و جذب کمپلس در 550 نانومتر، شکل پایین: میکروپلیت در مرحله نهایی تشکیل کمپلس بنفش رنگ یورونیک­اسید و کاربازول که غلظت­های متغییر مربوط به منحنی استاندارد در تکرارهای سه­تایی در سمت راست میکروپلیت قابل مشاهده است و سایر چاهک­ها مربوط به هیالورنیک استخراج شده از سویه­های باکتریایی در رقت­های 1:16 و 1:32 و تکرارهای سه­تایی است.

همان­طور که در جدول 3 آمده است میزان هیالورونیک­اسید یازده سویه از 6/216  تا 7/729 میکروگرم در میلی­لیتر متغییر است. مقدار هیالورونیک­اسید در هر دو سویه متعلق­به گروه G:  GGS-132, GGS-88 به­ترتیب 8/2±7/579 و 6/6±6/729 میکروگرم در میلی­لیتر است که نسبت­به سویه­های گروه C مقدار بیش­تری است بنابراین هر دو سویه جهت بررسی­های بیش­تر انتخاب شدند. از بین سویه­های گروه C سویهGCS-08 با مقدار تولیدی7/5±0/573 میکروگرم در میلی­لیتر به­عنوان سویه منتخب در این گروه شناسایی شد که در جدول 3 پررنگ­تر از سایر سویه­ها مشخص شده است.

غلظت هیالورونیک­اسید *

نام سویه

غلظت

هیالورونیک­اسید *

نام سویه

6/6±6/729

GGS-132

8/2±7/579

GGS-88

8/4±1/469

GCS-05

7/2±6/216

GCS-04

9/2±2/353

GCS-17

7/5±0/573

GCS-08

5/5±3/231

GCS-87

5/2±0/517

GCS-19

1/9±4/414

GCS-131

4/4±3/406

GCS-91

 

 

1/6±3/520

GCS-9542

جدول 3- میزان هیالورونیک­اسید تولید شده توسط سویه­های بالینی

*غلظت­های محاسبه شده میانگین سه بار تکرار است.

اثرهایpH  در میزان بازده هیالورونیک­اسید

جهت بررسی اثر pH، غلظت گلوکز در محیط تولید به­مقدار 5 میلی­گرم در میلی­لیتر ثابت در نظر گرفته شد (جدول 1) و pH محیط در دامنه 1/3-5/7 در دوازده نقطه مطابق با جدول 2 تهیه و پس از تولید و استخراج و تخلیص تعیین مقدار هیالورونیک­اسید (شکل3) انجام شد. همان­طورکه شکل3 و جدول 4 نشان می­دهد حداکثر بازده هیالورونیک­اسید در سویه GCS-08 درpH  5/6 (3/8±3/744میکروگرم در میلی­لیتر)، GGS-132 در pH 8/6 (1/9±8/1041میکروگرم در میلی­لیتر) و GGS-88 در pH به­نسبت اسیدی 8/4(9/5±9/598 میکروگرم در میلی­لیتر) بوده است.

شکل 3- تأثیرpH بر بازده هیالورونیک­اسید در سویه­های GGS-88،GGS-132و GCS-08

تأثیر غلظت گلوکز در بازده هیالورونیک­اسید در pH بهینه

در مطالعه حاضر،  pHبهینه برای هر یک از سویه­هایGGS-132 ،GCS-08 و GGS-88متفاوت است، اما در مقابل، غلظت گلوکز اثر مستقیم بر بازده تولید هیالورونیک­اسید داشته است (شکل 4).

شکل 4- غلظت هیالورونیک­اسید در سویه­های GGS-88، GGS-132 و GCS-08  در برابر غلظت­های متفاوت گلوکز

همان­طورکه در شکل4 و جدول 4 آمده است مقدار هیالورونیک­اسید تولید شده GCS-08 وGGS-88  و GGS-132 در مقدار 15 میلی­گرم در میلی­لیتر گلوکز توسط هر یک از آن­ها به­ترتیب 3/4±4/1096 و 9/6±3/1234 و 6/5±6/1993 میکروگرم در میلی­لیتر بود که نسبت­به مقدار اولیه به­ترتیب 91/1و 13/2 و 73/2 برابر افزایش را نشان داد.

جدول 4- میزان اولیه و پس از بهینه­سازی pH و گلوکز هیالورونیک­اسید در سویه­های GGS-88,GGS-132, GCS-08

نام سویه

غلظت

اولیه

 

pH بهینه

غلظت در pH بهینه

غلظت در pH و گلوکز بهینه

GCS-08

7/5±0/573

 5/6

3/8±3/744

3/4±4/1096

GCS-88

8/2±7/579

8/4

9/5±9/598

9/6±3/1234

GGS-132

6/6±6/729

8/6

1/9±8/1041

6/5±6/1993

*غلظت­های محاسبه شده میانگین سه بار تکرار است.

بحث

هیالورونیک­اسید در استرپتوکوک­ها متابولیت ثانویه محسوب می­شود و تولید آن به فاکتورهای مختلفی از جمله عوامل ژنتیکی و محیط رشد و مواد مغذی به­طور کامل وابسته است (13). بنابراین اولین مرحله در فرآیندهای تولید هیالورونیک­اسید، انتخاب سویه مناسب جهت تولید است. در مطالعه حاضر با غربالگری سویه­های استرپتوکوکی گروه­هایC  و G سویه­های مؤثر در تولید بیوپلی­مر هیالورونیک­اسید شناسایی شدند و نشان داده شد که گلوکز و pH به­عنوان دو عامل مؤثر بر میزان تولید هیالورونیک­اسید در سویه­های استرپتوکوکی نقش دارند. در این مطالعه مشخص شد که سویه استرپتوکوکی متعلق­به گروه G تنها با بهینه­سازی شرایط محیط کشت قادر به تولید 6/5±6/1993 میکروگرم در میلی­لیتر هیالورونیک­اسید است که در مقایسه با مطالعه­های قبلی سویه­های طبیعی و غیر موتانت مقدار تولید قابل توجهی است (17-14). از طرفی نشان داده شد که سویه دیگری از همین گروه (GGS-88) دارای پتانسیل تولید در pH اسیدی و پایین­تر از حد معمول است. باید به این موضوع توجه داشت که کاهش بازده هیالورونیک­اسید در اثر افزایش pH بیش از 5/7 و کاهش کم­تر از 0/6 در سویه­های متعلق­به گروه C گزارش شده است (13). کاهش بازده هیالورونیک­اسید به­دلیل کاهش pH محیط کشت ناشی از مصرف زیاد منابع کربنی است که منجر به تولید اسید لاکتیک و اسید استیک و در نهایت کاهش pH محیط کشت می­شود (14). مطالعه­های قبلی نشان دادند که اغلب سویه­های استرپتوکوک اکوئیسیمیلیس و استرپتوکوک زواپیدمیکوس گروه C بیش­ترین بازده تولید در pH دامنه 5/6-5/7 دارند (18،13).

Aroskar و همکاران نشان دادند سویه استرپتوکوک زواپیدمیکوس قادر به رشد و تولید هیالورونیک­اسید در pH اسیدی 5/5 نیز است (19). هم­چنین نتایج مطالعه­های اثر pH در بازده تولید هیالورونیک­اسید توسط استرپتوکوک زواپیدمیکوس و یا سویه استرپتوکوک اکوئیسیمیلیس نشان داد که اثر pH به لحاظ آماری به­طور مشخصی معنی­دار بوده و در سویه­های مورد مطالعه کاهش pH موجب کاهش بازده هیالورونیک­اسید می­شود (20،7).

تاکنون اطلاعاتی در مورد مقدار بهینه pH در سویه­های استرپتوکوکی گروه G گزارش نشده است و مطالعه کنونی برای اولین بار نشان داد که در pH اسیدی 8/4 سویه GGS-88 به­طور مؤثر و معنی­داری 05/0<  pدارای بازده قابل توجه هیالورونیک­اسید است. به­نظر می­رسد مهم­ترین عامل تولید هیالورونیک­اسید در pH اسیدی وجود فعالیت آنزیمی هیالورونیک­اسید سنتاز است و تفاوت  pHبهینه فعالیت این آنزیم به­احتمال وابسته­به ساختار و توالی­های آمینو اسیدی آن است که شناسایی ساختارهای آنزیمی در مهندسی سویه­های استرپتوکوکی بسیار مؤثر خواهد بود.

سویهGGS-132  دیگر سویه متعلق­به GGS رفتار و خصوصیتی مشابه سویه­های گروه C را نشان داد و pH بهینه برای این سویه نزدیک به نقطه خنثی و مشابه گزارش­های قبلی است (18،13). رشد و تولید در pH اسیدی می­تواند به­عنوان مزیت قابل توجهی برای سویه GGS-88 در نظر گرفته شود چرا که در محیط­های کشت استرپتوکوکی هم­زمان با رشد و تکثیر که لازمه افزایش تعداد باکتری­های تولیدکننده است، ورود متابولیت­های ناشی از رشد به محیط کشت افزایش یافته و در نهایت سبب کاهش pH می­شود. در این شرایط در مورد فرآورده­ای مانند هیالورونیک­اسید افزودن قلیا جهت حفظ بهینه pH الزامی است که در مقیاس صنعتی هزینه­ها و پیچیدگی کنترل pH را به دنبال خواهد داشت. از طرفی با انتخاب سویه مناسب و دارای قابلیت رشد و تولید هیالورونیک­اسید در pH اسیدی، امکان استفاده از بسیاری از خروجی­های صنایع غذایی مانند ملاس نیشکر و آب پنیر به­عنوان محیط کشت فراهم می­شود که در نهایت منجر به کاهش هزینه­های تولید فرآورده خواهد شد (21).

بررسی تأثیر غلظت گلوکز حاکی از اثر مستقیم غلظت در تولید هیالورونیک­اسید است. به این ترتیب که با افزایش گلوکز تا غلظت 15 میلی­گرم در میلی­لیتر، میزان بازده هیالورونیک­اسید، نیز افزایش یافت که مطابق با یافته­های پیشین است. (20).

بررسی اثرهای منابع کربنی مانند گلوکز، گالاکتوز، سوکروز، مالتوز، فروکتوز و منابع نیتروژنی مانند عصاره مخمر، پپتون، عصاره گوشت و انفوزیون مغزی-قلبی در تولید هیالورونیک­اسید توسط استرپتوکوک اکوئیسیمیلیس نشان داده است که از بین منابع کربنی و نیتروژنی به­ترتیب گلوکز و عصاره مخمر بهترین گزینه­ها در تولید هیالورونیک­اسید در سویه­های استرپتوکوک اکوئیسیمیلیس گروه C هستند و در شرایط بهینه غلظت هر یک از این منابع (به­ترتیب 15 و 30 میلی­گرم در میلی­لیتر) وpH  حدود 8/7 بیش­ترین مقدار تعیین شده 7/176 میکروگرم در میلی­لیتر گزارش شده است (20). با این­حال در مطالعه کنونی در pH بهینه و در حداکثر گلوکز بررسی شده 15 میلی­گرم در میلی­لیتر میانگین غلظت هیالورونیک­اسید بر حسب میکروگرم در میلی­لیتر در سویه­های منتخب (4/1096) GCS-08، (3/1234) GGS-88 و (6/1993) GGS-132 بود که حتی در کم­ترین مقدار حدود 2/6 برابر مقدار گزارش شده قبلی است. یکی از دلایل مهم کارایی بیش­تر گلوکز در مقایسه با سایر منابع کربنی جذب مستقیم آن توسط مکانیسم­های برداشت باکتری است که به­سرعت توسط آنزیم­های حدواسط به پیش­سازهای اولیه تبدیل می­شود. اما در مورد سایر منابع کربنی، واکنش­های حدواسط و شکسته شدن قند اولیه و تبدیل به گلوکز الزامی است که در شرایط کاهش انرژی می­تواند به­عنوان عامل محدودکننده واکنش­های مسیر بیوسنتز هیالورونیک­اسید عمل نماید (20،22).

بیوسنتز هیالورونیک­اسید در استرپتوکوک­ها نیازمند انرژی فراوان و در رقابت با رشد باکتری جهت مصرف گلوکز به­عنوان تأمین کننده انرژی یا بیوسنتز قندهای مونومری پیش­ساز اولیه بتا-1و4 گلوکورونیک­اسید و بتا 1و3 ان- استیل گلوکزامین است. در واقع در صورت عدم محدودیت گلوکز حداکثر رشد و تکثیر باکتری رخ خواهد داد. در حالی­که بالاترین بازده هیالورونیک­اسید و وزن مولکولی مطلوب در شرایط رشد کم­تر از حد بهینه، به­دست خواهد آمد زمانی­که باکتری­ها به آهستگی در حال رشد هستند و منابع انرژی و کربن برای سایر فرآیندها در دسترس است (3).

بررسی انجام شده در مورد تدثیر غلظت گلوکز بر میزان تولید هیالورونیک­اسید در سویه استرپتوکوک پیوژنز در دامنه غلظتی 20،40،60،80 و 100 میلی­گرم در میلی­لیتر نشان داد که بیش­ترین مقدار هیالورونیک­اسید (07/90 میکروگرم در میلی­لیتر) در غلظت 80 میلی­گرم در میلی­لیتر به­دست آمده است این یافته نشان داد که رابطه میزان غلظت گلوکز بر بازده هیالورونیک­اسید دارای محدودیت است و همواره افزایشی نخواهد بود (14).

در مطالعه کنونی با غربالگری اولیه و شناسایی سویه­های تولیدکننده مؤثر و سپس بررسی دو عامل اصلی و تأثیرگذار در تولید هیالورونیک­اسید در مقیاس آزمایشگاهی مقادیر 1-2 میلی­گرم در میلی­لیتر (جدول 4) در سویه­های منتخب به­دست آمد. از طرفی باید به این نکته توجه شود که در تولید هیالورونیک­اسید به­جزء pH و غلظت گلوکز سایر عوامل محیطی مانند سرعت هم­زدن و حجم هوادهی، دما و افزودن عوامل محرک مسیرهای بیوسنتز هیالورونیک­اسید و هم­چنین مراحل پایین دستی شامل جداسازی و تخلیص نقش مهم و تأثیرگذاری در میزان بازده نهایی دارند که در ادامه این مطالعه با نقش هر یک از این عوامل به­تنهایی و یا در مجموع برای هر یک از سویه­های منتخب مورد بررسی و مطالعه قرار خواهد گرفت. 

نتیجه­گیری

در تولید هیالورنیک­اسید بر اساس فرمنتاسیون، اولین مرحله انتخاب سویه­های مؤثر و سپس بهینه­سازی عوامل تأثیرگذار در فرآیند تولید است. با بررسی عوامل گلوکز و pH محیط در سویه­های استرپتوکوکی گروه C و برای اولین بار G مشخص شد که بازده تا 73/2 برابر قابل افزایش است. هم­چنین شناسایی سویه تولیدکننده در pH اسیدی مزیتی جهت تولید صنعتی هیالورونیک­اسید در شرایط غیرمعمول است. بنابراین سویه شناسایی شده در شرایط معین بهینه رشد جهت تولید در مقیاس نیمه صنعتی و صنعتی قابل استفاده است.

سپاسگزاری

منابع مالی تحقیق از محل طرح پژوهشی به شماره 781 مصوب شورای پژوهشی انستیتو پاستور ایران تامین شده است.

 

 

 

 

 

منابع

1. DeAngelis PL. Glycosaminoglycan polysaccharide biosynthesis and production: today and tomorrow. Applied microbiology and biotechnology. 2012;94(2):295-305.

 

2. Schiraldi C, La Gatta A, De Rosa M. Biotechnological production and application of hyaluronan: INTECH Open Access Publisher; 2010.

 

3. Boeriu CG, Springer J, Kooy FK, van den Broek LA, Eggink G. Production methods for hyaluronan. International Journal of Carbohydrate Chemistry. 2013;2013.

 

4. Liu L, Liu Y, Li J, Du G, Chen J. Microbial production of hyaluronic acid: current state, challenges, and perspectives. Microb Cell Fact. 2011;10(1):1-9.

 

5. Reddy KJ, Karunakaran K. Purification and characterization of hyaluronic acid produced by

Streptococcus zooepidemicus strain 3523-7. Journal of BioScience & Biotechnology. 2013;2(3).

 

6. O'Regan M, Martini I, Crescenzi F, De Luca C, Lansing M. Molecular mechanisms and genetics of hyaluronan biosynthesis. International Journal of Biological Macromolecules. 1994;16(6):283-6.

 

7. Johns MR, Goh L-T, Oeggerli A. Effect of pH, agitation and aeration on hyaluronic acid production byStreptococcus zooepidemicus. Biotechnology letters. 1994;16(5):507-12.

 

8. Kumari K, Weigel PH. Molecular cloning, expression, and characterization of the authentic hyaluronan synthase from group C Streptococcus equisimilis. Journal of Biological Chemistry. 1997;272(51):32539-46.

 

9. Keramati M, Roohvand F, Aslani MM, Khatami S, Aghasadeghi M, Sadat M, et al. Screening, Cloning and Expression of Active Streptokinase from an Iranian Isolate of S. equisimilis Group C in E. coli. Iranian journal of basic medical sciences. 2013;16(4):620.

 

10. Garrity GM, Bell J, Lilburn T, Bergey’S M. Systematic Bacteriology. The Proteobacteria, Part C: The Alpha-, Beta-, Delta-, and Epsilonproteobacteria, Bergey’s Manual Trust, Department of Microbiology and Molecular Genetics. 2004;2.

 

11. Cavalcanti AD, Melo BA, Oliveira RC, Santana MH. Recovery and Purity of High Molar Mass Bio-hyaluronic Acid Via Precipitation Strategies Modulated by pH and Sodium Chloride. Applied biochemistry and biotechnology. 2018:1-13.

 

12. Cesaretti M, Luppi E, Maccari F, Volpi N. A 96-well assay for uronic acid carbazole reaction. Carbohydrate Polymers. 2003;54(1):59-61.

 

13. Saranraj P, Sivakumar S, Sivasubramanian J, Geetha M. Production, optimization and spectroscopic studies of hyaluronic acid extracted from Streptococcus pyogenes. Int J Pharm Biol Arch. 2011;2(3).

 

14. Al-Saadiaa KA, Naji HF, Al-Saadi AH. Production and optimisation of hyaluronic acid extracted from Streptococcus pyogenes. Journal of Contemporary Medical Sciences. 2016;1(4):13-5.

 

15. Pires AMB, Santana MHA. Metabolic effects of the initial glucose concentration on microbial production of hyaluronic acid. Applied biochemistry and biotechnology. 2010;162(6):1751-61.

 

16. Blank LM, McLaughlin RL, Nielsen LK. Stable production of hyaluronic acid in Streptococcus zooepidemicus chemostats operated at high dilution rate. Biotechnology and bioengineering. 2005;90(6):685-93.

 

17. Huang W-C, Chen S-J, Chen T-L. Production of hyaluronic acid by repeated batch fermentation. Biochemical engineering journal. 2008;40(3):460-4.

 

18. Patil KP, Kamalja KK, Chaudhari BL. Optimization of medium components for hyaluronic acid production by Streptococcus zooepidemicus MTCC 3523 using a statistical approach. Carbohydrate Polymers. 2011;86(4):1573-7.

 

19. Aroskar V, Kamat S, Kamat D. Effect of various physical parameters and statistical medium optimization on production of hyaluronic acid using S. equi subsp. zooepidemicus ATCC 39920. IIOAB Letters. 2012;2(1).

 

20. Chen Y-H, Li J, Liu L, Liu H-Z, Wang Q. Optimization of flask culture medium and conditions for hyaluronic acid production by a streptococcus equisimilis mutant nc2168. Brazilian Journal of Microbiology. 2012;43(4):1553-61.

 

21. Pires AM, Macedo AC, Eguchi SY, Santana MH. Microbial production of hyaluronic acid from agricultural resource derivatives. Bioresource technology. 2010;101(16):6506-9.

 

22. Chen WY, Marcellin E, Steen JA, Nielsen LK. The role of hyaluronic acid precursor concentrations in molecular weight control in Streptococcus zooepidemicus. Molecular biotechnology. 2014;56(2):147-56.

23. Krahulec J, Krahulcová J. Increase in hyaluronic acid production by Streptococcus equi subsp. zooepidemicus strain deficient in β-glucuronidase in laboratory conditions. Applied microbiology and biotechnology. 2006;71(4):415-22.

 

نوع مطالعه: مقاله پژوهشی | موضوع مقاله: سلولی و مولکولی
دریافت: 1399/4/4 | پذیرش: 1399/4/4 | انتشار: 1399/4/4

ارسال نظر درباره این مقاله : نام کاربری یا پست الکترونیک شما:
CAPTCHA

بازنشر اطلاعات
Creative Commons License این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است.

کلیه حقوق این وب سایت متعلق به مجله تازه های بیوتکنولوژی سلولی - مولکولی می باشد.

طراحی و برنامه نویسی : یکتاوب افزار شرق

© 2024 CC BY-NC 4.0 | New Cellular and Molecular Biotechnology Journal

Designed & Developed by : Yektaweb