تولید هیالورونیکاسید توسط سویههای Streptococcus equisimilis گروههای Cو G
فاطمه خانی1، ملیحه کرامتی ⃰ 2، بنفشه کاظمی1، زهرا امینی تهرانی2، فرشته شاهچراغی3
1- دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان
2 - بخش نانوبیوتکنولوژی، انستیتو پاستور ایران ، تهران
3- بخش میکروب شناسی، انستیتوپاستور ایران، تهران
چکیده
سابقه و هدف: هیالورونیکاسید بیوپلیمری طبیعی و خطی است که بهدلیل خصوصیت ویسکوالاستیک، ظرفیت بالای جذب آب و زیستسازگاری کاربردهای وسیعی در پزشکی، دارورسانی و صنایع آرایشی دارد. امروزه تولید صنعتی آن از طریق فرمنتاسیون سویههای استرپتوکوکی است. تحقیق کنونی گزارشی از غربالگری و بهینهسازی شرایط تولید هیالورونیکاسید توسط سویههای استرپتوکوکی بالینی گرو ههای C و G جدا شده از بیماران ایرانی است.
مواد و روشها: یازده سویه استرپتوکوک اکوئیسیمیلیس(S.equisimilis) شامل نه سویه گروه C و دو سویه گروه G شناسایی و تولید اولیه هیالورونیکاسید بهروش کمپلسومتری با کاربازول تعیین شد و بر اساس نتایج سه سویه با بیشترین تولید جهت بهینهسازی انتخاب شدند. جهت تعیین pH بهینه، دوازده نقطه در دامنه 1/3-5/7 و غلظت گلوکز در یازده نقطه در دامنه 3/0تا 15 میلیگرم در میلیلیتر و در pH بهینه ارزیابی و بازده هیالورونیکاسید توسط سویههای منتخب تعیین شد.
یافته ها: میانگین غلظت هیالورونیکاسید تولید شده در یازده سویه بالینی بین6/216 تا 7/729میکروگرم در میلیلیتر متغییر بود. سه سویه با بیشترین تولید شامل سویههای GCS-08،GGS-88 و GGS-132و میانگین غلظت هیالورونیکاسید بهترتیب 0/573، 7/579 و 7/729میکروگرم در میلیلیتر جهت مطالعههای بهینهسازی انتخاب شدند. pH بهینه و مقدار هیالورونیکاسید برای هر سویه بهترتیب (5/6 pHو 3/744)GCS-08 ، (8/4 pH و 9/598) GGS-88 و (8/6 pH و 8/1041) GGS-132بود. کشت در محیط حاوی گلوکز با غلظت 15 میلیگرم در میلیلیتر باعث افزایش تولید هیالورونیکاسید توسط سویهها بهترتیب 6/1096GCS-08: ، 3/1234 GGS-88:و 6/ 1993GGS-13: میکروگرم در میلیلیتر شد.
نتیجهگیری: نتایج نشان دهنده اثر معنیدار pH و رابطه مستقیم غلظت گلوکز بر بازده هیالورونیکاسید است که میتواند باعث افزایش تولید تا 73/2برابر شود. شناسایی سویه تولید کننده در pH اسیدی 8/4 مزیتی برای تولید صنعتی هیالورونیکاسید در شرایط غیر معمول است.
واژه های کلیدی: هیالورونیکاسید،S.equisimilis ، فرمنتاسیون، بهینهسازی، گلوکز،pH
هیالورونیکاسید بیوپلیمر خطی طبیعی مشتمل بر تکرار واحدهای دی ساکاریدی بتا-1و4 گلوکورونیکاسید و بتا 1و3 ان- استیل گلوکزامین با وزن مولکولی متنوع از 5000 دالتون تا 20 میلیون دالتون است (1). بهدلیل ویسکوزیته عالی، ظرفیت جذب آب فوقالعاده بالا، غیرایمونوژن و زیستسازگاری کاربرد بیولوژیک، داروسازی و مهندسی بافت، ترمیم زخم، جراحی چشم و مفاصل و جراحیهای زیبایی پیدا کرده است (2). روشهای اولیه تولید صنعتی آن استخراج از چشم گاو و تاج خروس است که بهدلیل کیفیت متغییر و پتانسیل آلودگی با ویروسها امروزه با روشهای تخلیص از باکتریهای تولیدکننده کپسول هیالورونیکاسید از جمله استرپتوکوکها جایگزین شده است (3). مهمترین سویههای گستردهای در پیشگیری و درمان بیماریها، تحقیقات پزشکی و بهکار برده شده به این منظور شامل استرپتوکوک پیوژنز (S.pyogenes) استرپتوکوک اکوئیسیمیلیس (S. equisimilis) و استرپتوکوک زواپیدمیکوس (S.zooepidemicus) هستند. تحقیقات نشان داده است که تولید هیالورونیکاسید در استرپتوکوکها با مکانیسم یکسان و با پلیمریزاسیون پیشسازهای مونوساکاریدی توسط آنزیم هیالورونیکاسید سنتاز انجام میشود (4). استفاده از سویههای میکروبی بهدلیل امکان کنترل شرایط رشد، کنترل روشهای فرمنتاسیون، استخراج و خالصسازی منجر به بهبود فرآیند و بازده تولید و کیفیت فرآورده شده است. در فرآیندهای فرمنتاسیون مهمترین عوامل تأثیرگذار در بازده فرآیند انتخاب سویه مناسب، بهینهسازی شرایط کشت و تولید و استفاده از روشهای بهینه خالصسازی است. مطالعهها نشان میدهد که بهینهسازی شرایط کشت از قبیل دما، pH، میزان هوادهی، سرعت همزدن، میزان اکسیژن حل شده، میزان استرس ناشی از pH و نوع راکتور زیستی بهطور قابل توجهی تولید هیالورونیکاسید را تحت تأثیر قرار میدهند (5). بیوسنتز هیالورونیکاسید فرآیند چند مرحلهای است. که با رشد سلول و ساخت دیواره باکتریایی در پیشسازهایی از قبیل گلوکز 1- فسفات، UDP- گلوکز و UDP-N- استیل گلوکز آمین مشترک است و رقابت بین بیوسنتز هیالورونیکاسید و رشد سلول برای مصرف این پیشسازها وجود دارد، بنابراین کنترل منابع کربنی و شرایط رشد در کاهش میزان تشکیل توده سلولی و افزایش میزان هیالورونیکاسید مؤثر است (6). در بررسی منابع کربنی، گلوکز مؤثرترین ماده شناسایی شده است با این حال افزایش غلظت آن گاهی تأثیر چندانی در تولید هیالورونیکاسید نداشته و افزایش به نفع رشد و افزایش توده سلولی است. میزان اسیدیته محیط تولید بهطور قابل توجهی در بازده تولید مؤثر است کاهش pH از حد بهینه آن منجر به کاهش رشد باکتری و در نتیجه کاهش تولید هیالورونیکاسید میشود (7).
سرعت تولید هیالورونیکاسید وابستهبه سرعت واکنشهای مسیر بیوسنتز هیالورونیکاسید در سویه های استرپتوکوکی است. مقایسه بیوسنتز هیالورونیک نشان داده است که سرعت واکنش های آنزیمی هیالورونیکاسید سنتاز در سویههای استرپتوکوک اکوئیسیمیلیس 2-4/2 برابر بیشتر از سویههای استرپتوکوک پیوژنز و استرپتوکوک زواپیدمیکوس است (8). همچنین این سویهها پروتئینهای ترشحی کمتری نسبتبه استرپتوکوک پیوژنز دارند که این موضوع موجب کاهش پیچیدگی فرآیندهای تخلیص و در نتیجه افزایش کیفیت و بازده تخلیص بیوپلیمر خواهد شد (4). در مطالعه کنونی ابتدا با غربالگری سویههای استرپتوکوک اکوئیسیمیلیس گروههایC(GCS) و G(GGS) جدا شده از بیماران ایرانی مقدار هیالورونیکاسید تولید شده در هر یک از سویهها تعیین شد و سپس بررسی شرایط بهینه برای سویههای منتخب و تأثیر pH و گلوکز بهعنوان دو عامل بسیار مهم در بازده هیالورونیکاسید مورد ارزیابی قرار گرفت. لازمبه ذکر است هیچ گزارش قبلی در مورد تعیین مقدار و بررسی تولید هیالورونیکاسید در استرپتوکوک اکوئیسیمیلیس گروه Gوجود ندارد. بهطور مسلم شناسایی سویههای تولید کننده مؤثر و کم خطر و تعیین شرایط حداقلی جهت حداکثر تولید موجب کاهش هزینههای تولید هیالورونیکاسید در مقیاس صنعتی خواهد شد.
مواد و روشها:
سویههای مورد استفاده در این تحقیق، سویههای استرپتوکوک اکوئیسیمیلیس گروهC (9 سویه) و گروه G (2 سویه) ایزولههای غیر تهاجمی جدا شده از گلو و شناسایی شده در طی تحقیق انجام شده در انستیتو پاستور ایران است (9). این سویهها بهصورت لیوفیلیزه در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شده اند. با این حال مجدد پس از کشت و رشد در محیط کشت (ایبرسکو، ایرانBrain Heart Infusion (BHI, آزمونهای بررسی هاله لیز در محیط کشت بلاد آگار و آزمونهای بیوشیمیایی با استفاده از قندهای لاکتوز، سوربیتول، تره هالوز و ریبوز انجام شد (10).
غربالگری اولیه و تعیین مقدار هیالورونیکاسید در سویههای گروهGGS, GCS
غربالگری اولیه سویهها بر اساس مورفولوژی و مشاهده کلنیهای موکوئیدی ناشی از تولید کپسول هیالورونیکاسید و نیز بر اساس قطر هاله همولیز پس از رشد در محیط کشت بلاد آگار انجام گرفت. سپس جهت تعیین مقدار کمی هیالورونیکاسید، چند کلنی از هر یک از سویه ها از محیط بلاد آگار به 5 میلیلیتر محیط کشت BHI انتقال داده شد پس از یک شبانه روز کشت و تعیین مقدار دانسیته نوری در 600 نانومتر، هر یک از سویهها بهنسبت V/V 10% در دانسیته نوری 5/0 پس از سانتریفیوژ و شستشو با 10 میلیلیتر بافر فسفات به محیط تولید شامل اجزا ذکر شده در جدول 1 در pH حدود 0/7، تلقیح شد. رشد در دمای 37 درجه سانتیگراد و سرعت 200 دور در دقیقه بهمدت 16 ساعت برای کلیه سویهها انجام شد.
جدول 1- مواد و مقادیر لازم جهت تهیه محیط تولید هیالورونیکاسید pH حدود 0/7
(mg/ml)غلظت |
مواد |
5/1 |
Na2HPO4.12H2O |
5/0 |
KH2PO4 |
5/0 |
Mg2SO4.7H2O |
10 |
Yeast Extract |
5 |
Glucose |
جهت آزاد شدن کپسول هیالورونیکاسید، معادل حجم اولیه محیط تولید، نرمال سالین حاوی (w/v) 1/0 % SDS اضافه و بهمدت 10 دقیقه به آرامی مخلوط شد. سپس با سانتریفیوژ 13000 دور در دقیقه بهمدت 5 دقیقه توده سلولی جداسازی شد. بهمنظور حذف پروتئینهای موجود در سوپرناتانت محلول تریکلرواستیکاسید 100% با نسبت 1:4 اضافه و انکوباسیون شبانه در دمای 4 درجه سانتیگراد انجام شد. پس از حذف پروتئین با رسوبدهی، جهت جداسازی هیالورونیکاسید چهار برابر حجم محلول باقی مانده، اتانول مطلق اضافه شد با سانتریفیوژ 15000 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه رسوب هیالوروناتسدیم جمعآوری شده و در نهایت رسوب در 200 میکرولیتر آب حل شد(11)
.بررسی میزان تولید هیالورونیکاسید با استفاده از واکنش کاربازول و رسم منحنی استاندارد گلوکورونیکاسید
بهمنظور تعیین غلظت هیالورونیکاسید استخراج شده، از گلوکورونیکاسید با غلظتهای متغییر50-400 میکروگرم در میلیلیتر (400 و 50،100،150،200،300) بهمیزان 50 میکرولیتر و 50 میکرولیتر از نمونه استخراج شده و رقیق شده با آب با نسبتهای 1:32 و 1:16 به چاهکهای پلیت 96 خانهای اضافه شد. 200 میکرولیتر از محلول سدیم بورات حل شده در سولفوریکاسید با غلظت 25 میلیمولار به نمونهها و استانداردها اضافه شده و سپس در 80 درجه سانتیگراد بهمدت20 دقیقه در آون انکوبه شد. بعد از سرد شدن تا حد دمای اتاق کاربازول % 125/0 ( 50 میکرولیتر) حل شده در اتانول مطلق با دقت افزوده شد و مجدد در دمای 80 درجه سانتیگراد بهمدت 20 دقیقه دیگر انکوبه شد. پس از سرد شدن بهمدت 15 دقیقه در دمای اتاق، جذب نوری در 550 نانومتر قرائت شده و پس از رسم منحنی استاندارد، غلظت بیوپلیمر تعیین شد. کلیه غلظتهای مربوطبه منحنی استاندارد و نمونهها در تکرارهای سهتایی انجام شد و میزان انحراف از استاندارد، انحراف نسبی و ضریب همبستگی خط در هر بار آزمون مورد ارزیابی قرار گرفت تا از صحت، تکرارپذیری و خطی بودن منحنی استاندارد و شرایط صحیح آزمون اطمینان حاصل شود. دقت تعیین مقدار در روش کمپلکسومتری با کاربازول در مورد پلی-ساکاریدهای دارای واحدهای گلوکورونیکاسید مانند هیالورونیکاسید در حد یک میکروگرم در میلیلیتر است (12).
پس از تعیین مقدار کمی تولید هیالورونیکاسید در هر یک از سویهها، اثرهای pH و غلظت گلوکز در میزان تولید در مورد سه سویه منتخب ((GGS-132, GGS-88, GCS-08 بررسی شد. بدین منظور ابتدا محیط کشت مطابق جدول 1 و با غلظت گلوکز 5 میلیگرم در میلیلیتر تهیه شد با این تفاوت که pH با افزودن اسید فسفریک و یا هیدروکسیدسدیم در 12 نقطه تعیین شده مطابق جدول 2 تنظیم شد. تولید، استخراج و تعیین مقدار هیالورونیکاسید برای هر یک از سویههای منتخب همانند روشی که توضیح داده شد انجام شد پس از تعیین شرایط بهینه pH برای هر یک از سویهها محیط تولید شامل مقادیر مختلف گلوکز مطابق جدول 2 تهیه و مجدد تعیین مقدار هیالورونیکاسید برای سه سویهGGS-132 GGS-88, GCS-08 انجام شد.
جدول 2- دامنه pH و غلظت- های مختلف گلوکز
pH |
|||||
8/4 |
5/4 |
1/4 |
8/3 |
5/3 |
1/3 |
5/7 |
8/6 |
5/6 |
0/6 |
8/5 |
5/5 |
غلظت گلوکز (میلیگرم در میلیلیتر) |
|||||
0/3 |
4/2 |
5/1 |
9/0 |
3/0 |
- |
0/15 |
5/10 |
0/9 |
5/7 |
0/6 |
6/4 |
آنالیز آماری
جهت مقایسه بازده هیالورونیکاسید در سویههای منتخب GCS-08، GGS-88 و GGS-132 و نیز تعیین اثرهای عوامل pH و غلظت گلوگز بر بازده، اساس آزمونt.test با استفاده از نرمافزار SPSS 22 انجام شد و ارزش p کمتر از 05/0 معنیدار در نظر گرفته شد.
یافتهها
مورفولوژی و هاله لیز و تخمیر قندها یازده سویه استرپتوکوکی شامل نه سویه متعلقبه گروهC و دو سویه متعلقبه گروهG مورد ارزیابی قرار گرفت. نتیجه کشت دو سویه منتخب GGS-88, GCS-08 که نشان دهنده کلنیهای بزرگ خاکستری رنگ موکوئیدی است در شکل شماره 1 آمده است.