دوره 10، شماره 39 - ( 4-1399 )
جلد 10 شماره 39 صفحات 102-91 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Mirzaei M, Rastegar Shariat Panahi M, Ghahremani E, Rezae E, Seid Moradi R, Farnoosh G et al . Improving the activity and stability of OPH enzyme using DNA Shuffling method. NCMBJ 2020; 10 (39) :91-102
URL: http://ncmbjpiau.ir/article-1-1294-fa.html
URL: http://ncmbjpiau.ir/article-1-1294-fa.html
میرزایی مرتضی، رستگار شریعت پناهی مونا، قهرمانی عنایت، رضایی احسان، صید مرادی رضوان، فرنوش غلامرضا و همکاران.. بهبود فعالیت و پایداری آنزیم OPH با استفاده از روش DNA شافلینگ. مجله تازه هاي بيوتكنولوژي سلولي و مولكولي. 1399; 10 (39) :91-102
مرتضی میرزایی 
، مونا رستگار شریعت پناهی ، عنایت قهرمانی ، احسان رضایی ، رضوان صید مرادی ، غلامرضا فرنوش ، علی محمد لطیفی
، مونا رستگار شریعت پناهی ، عنایت قهرمانی ، احسان رضایی ، رضوان صید مرادی ، غلامرضا فرنوش ، علی محمد لطیفی
مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی کاربردی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله، تهران، ایران
متن کامل [PDF 3729 kb]
(1530 دریافت)
| چکیده (HTML) (3258 مشاهده)
جدول ۱- رشد جمعیت اول سویههای جهش یافته در غلظتهای مختلف دیازینون
شکل 1- جذب نوری و ارزیابی تجزیۀ زیستی دیازینون (۲۰۰۰ میلیگرم/میلیلیتر دیازینون) با استفاده از سویههای بهبود یافته روند جهشزایی DES
شکل ۲- جذب نوری و ارزیابی تجزیه زیستی دیازینون (۳۰۰۰ میلیگرم/لیتر دیازینون) با استفاده از سویههای بهبود یافته روند جهشزایی DES
شکل ۳- مقایسه فعالیت کل سلول با سویههای بهبود یافته با DES در ۲۰۰۰ و ۳۰۰۰ میلیگرم در لیتر دیازینون.
متن کامل: (972 مشاهده)
بهبود فعالیت و پایداری آنزیم OPH با استفاده از روش DNA شافلینگ
مرتضی میرزایی1، مونا رستگار شریعت پناهی2، عنایت قهرمانی1، احسان رضایی3، رضوان صید مرادی1، غلامرضا فرنوش1، علی محمد لطیفی*1
1-مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی کاربردی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله، تهران، ایران
2-گروه بیوشیمی، دانشگاه پیام نور، تهران، ایران
3-مرکز تحقیقات زیستشناسی مولکولی، انستیتوی زیستشناسی و مسمومیتها، دانشگاه علوم پزشکی بقیهالله، تهران، ایران
4- مرکز تحقیقات پیشگیری از بیماریهای دهان و دندان، دانشگاه علوم پزشکی بقیهالله، تهران، ایران
چکیده
سابقه و هدف: از جمله روشهای مؤثر برای مهندسی پروتئین، بهویژه برای بهبود قابلیتهای سویههای صنعتی، روش ژنوم شافلینگ است. این مطالعه منطبق بر تکنیکهای مهندسی بیوکاتالیستی و بر اساس روش های DNA شافلینگ انجام شده است.
مواد و روشها: سویۀ وحشی سودوموناس آئروژینوزا بهشماره دسترسی JQ917006.1 تهیه گردید. سویههای جهش یافته بهروش DES و سازگاری با غلظت دیازینون بررسی شدند. پس از آماده سازی پروتوپلاست، برزدن ژنوم انجام شد که از کتابخانۀ جهش یافته حاصل شده بود. پروتوپلاستهای الحاقی از نظر فعالیت بررسی شدند.
یافتهها: فعالیت مربوط به سویههای IR1.G1، IR1.D8، IR1.D4 و IR1.D5 بهترتیب عبارتند از ۲۳۴/۰ U/ml، ۱/۰ U/ml، ۰۹۸/۰ U/ml و ۰۶۶/۰ U/ml و سویههای IRL1.F2 و IRL1.F3 و IRL1.F1 بهترتیب دارای فعالیت mg/L ۵۴۱/۰، mg/L ۵۲۳/۰ و mg/L ۵۰۹/۰ هستند.
نتیجه گیری: نتایج حاصل از ارزیابی نسل اول ژنوم شافلینگ (دور اول فیوژن پروتوپلاست) نشان داد که سویههای برخورده (شافل شده) که قادر به رشد در مجاورت توکسین (۳۰۰۰ میلیلیتر در لیتر غلظت دیازینون) بودند، فعالیت بهتری نسبتبه سویههای جهش یافته با استفاده از هر دو روش (گرادیان غلظت سم و روش DES) را از خود نشان دادند.
واژه های کلیدی: ژنوم شافلینگ، سویههای بهبود یافته، مهندسی پروتئین، دیازینون
مرتضی میرزایی1، مونا رستگار شریعت پناهی2، عنایت قهرمانی1، احسان رضایی3، رضوان صید مرادی1، غلامرضا فرنوش1، علی محمد لطیفی*1
1-مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی کاربردی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله، تهران، ایران
2-گروه بیوشیمی، دانشگاه پیام نور، تهران، ایران
3-مرکز تحقیقات زیستشناسی مولکولی، انستیتوی زیستشناسی و مسمومیتها، دانشگاه علوم پزشکی بقیهالله، تهران، ایران
4- مرکز تحقیقات پیشگیری از بیماریهای دهان و دندان، دانشگاه علوم پزشکی بقیهالله، تهران، ایران
سابقه و هدف: از جمله روشهای مؤثر برای مهندسی پروتئین، بهویژه برای بهبود قابلیتهای سویههای صنعتی، روش ژنوم شافلینگ است. این مطالعه منطبق بر تکنیکهای مهندسی بیوکاتالیستی و بر اساس روش های DNA شافلینگ انجام شده است.
مواد و روشها: سویۀ وحشی سودوموناس آئروژینوزا بهشماره دسترسی JQ917006.1 تهیه گردید. سویههای جهش یافته بهروش DES و سازگاری با غلظت دیازینون بررسی شدند. پس از آماده سازی پروتوپلاست، برزدن ژنوم انجام شد که از کتابخانۀ جهش یافته حاصل شده بود. پروتوپلاستهای الحاقی از نظر فعالیت بررسی شدند.
یافتهها: فعالیت مربوط به سویههای IR1.G1، IR1.D8، IR1.D4 و IR1.D5 بهترتیب عبارتند از ۲۳۴/۰ U/ml، ۱/۰ U/ml، ۰۹۸/۰ U/ml و ۰۶۶/۰ U/ml و سویههای IRL1.F2 و IRL1.F3 و IRL1.F1 بهترتیب دارای فعالیت mg/L ۵۴۱/۰، mg/L ۵۲۳/۰ و mg/L ۵۰۹/۰ هستند.
نتیجه گیری: نتایج حاصل از ارزیابی نسل اول ژنوم شافلینگ (دور اول فیوژن پروتوپلاست) نشان داد که سویههای برخورده (شافل شده) که قادر به رشد در مجاورت توکسین (۳۰۰۰ میلیلیتر در لیتر غلظت دیازینون) بودند، فعالیت بهتری نسبتبه سویههای جهش یافته با استفاده از هر دو روش (گرادیان غلظت سم و روش DES) را از خود نشان دادند.
واژه های کلیدی: ژنوم شافلینگ، سویههای بهبود یافته، مهندسی پروتئین، دیازینون
مقدمه
تاریخچۀ استفاده از آفتکشهای ارگانو فسفاته برای مصارف کشاورزی به دهههای قبل باز میگردد. تعدادی از ترکیبهای ارگانوفسفره شامل مالاتیون، دیکلرووس و، پاراتیون کلروپیریفوس هستند. این ترکیبها، استیل کولین استراز را که یک آنزیم حیاتی در هیدرولیز استیل کولین عصبی است را مورد هدف قرار داده و منجر به غیرفعال شدن استیل کولین استراز و در نتیجه باعث سمیت میشوند (1). بر این اساس استفاده از این ترکیبها نگرانیهای سلامتی بسیاری را نسبتبه انسان و سایر موجودات زنده ایجاد کرده است. بهمنظور غلبهبر این مشکل، تلاشهای زیادی صورت گرفته و روشهای متفاوتی برای از بین بردن آلودگی ناشی از استفاده از این ترکیبها بکار گرفته شدهاند. روشهایی مانند روشهای فیزیکی، شیمیایی و بیولوژیکی میتوانند بهعنوان استراتژیهای آلودگیزدایی در نظر گرفته شوند (2). تجزیه زیستی بهعنوان یک روش برجسته بهعلت برخی از ویژگیهای مهم مانند اثر سریع، سازگار با محیطزیست، امن و تولید محصولات با سمیت کمتر شناخته میشود (3).
مطالعه های قبلی ثابت کردهاند که برخی از میکروارگانیسم-ها قادر به تخریب ترکیبهای سمی خاصی هستند (4). چندین باکتری جدا شده از جمله گونههای فلاووباکتریوم (Flavobacterium) و سودوموناسدیمینوتا امجی (Pseudomonas diminuta MG) نشان دادهاند که قابلیتهای قابل توجهی برای هیدرولیز کردن ترکیبهای ارگانو فسفره دارند (5،6). گونههای سودوموناس بهعنوان یک نامزد برجسته برای تجزیه زیست محیطی ترکیبهای ارگانوفسفره محسوب میشود و برای سمزدایی پسابهای آلوده و خاکهای کشاورزی استفاده میشود (7).
علیرغم مزایای متعدد استفاده از سویههای باکتریایی در فرآیند تجزیه زیستی، برخی از جنبههای کاربردی این سویهها باعث میشود تا از استفادۀ مکرر آنها جلوگیری شود. یکی از عوامل محدود کننده در دسترس بودن سوبسترا است. آنزیمهای سیتوپلاسمی این باکتریها مسئول فعالیتهای زیستی آنها هستند که دسترسی سوبسترا به آنها را محدود است. از سوی دیگر، نیاز به زمان بیشتری دارند تا روی سوبسترا عمل کنند، بنابراین کیفیت کارایی آنها کاهش مییابد (3).
ژنوم شافلینگ بهطور گستردهای برای افزایش تولید متابولیتها توسط سویههای باکتریایی، بهبود جذب سوبسترا و همچنین افزایش قدرت سویه استفاده میشود. این تکنیک ترکیبی از مزایای کراسینگ اور والدینی است که با بر زدن DNA و بازسازی کامل ژنوم همراه است که بهطور معمول با ترکیب (فیوژن) پروتوپلاست انجام میشود که پروسۀ نوترکیبی را افزایش میدهد. روش برزدن ژنوم در ابتدا توسط Stemmer و همکارانش در سال ۲۰۰۲ ارائه شد که برای بهبود تولید تیلوزین (Tylosin) توسط استرپتومایسس فرادیه (Streptomyces fradiae) مورد استفاده قرار گرفت. امروزه در بسیاری از آزمایش ها برای افزایش تولید متابولیت ها توسط سویه های باکتریایی، بهبود جذب سوبسترا و افزایش تحمل سویه استفاده میشود. برزدن ژنوم یک نقطه عطف در تکنولوژی بهبود سویهها و مهندسی متابولیک است (8).
در این مطالعه، با استفاده از روش بر زدن ژنوم، تلاش برای بهبود ویژگی های سودوموناس آئروژینوزا (Pseudomonas aeruginosa) به منظور تجزیۀ دیازینون انجام شد. مقاومت در مقابل سمیت سموم ارگانوفسفره و همچنین افزایش فعالیت سلول از اهداف این مطالعه هستند. هدف اصلی بهدست آوردن سویۀ جهش یافته ای است که میتواند در غلظتهای بالای دیازینون رشد کند و از سوی دیگر نیز دیازینون را در مدت زمان کوتاهی تجزیه کند.
روش کار
سویههای باکتریایی
سویۀ وحشی سودوموناس آئروژینوزا به شماره مجموعه JQ917006.1 از فاضلابهای صنعتی (پسابهای کارخانههای تولید آفتکشها و خاک آلوده آنها) در ایران جدا شده است.
مواد شیمیایی و حلالها
دیازینون (خلوص ٪۵/۹۹) از Sigma-Aldrich خریداری شد. سایر مواد شیمیایی و حلالها نیز از Merck آلمان تهیه شد.
آزمون تحمل سویههای بومی در برابر دیازینون
در ابتدا سویۀ IRLM.1 جدا شده از سودوموناس آئروژینوزا در محیط کشت MSM حاوی %2 گلوکز، mg/L50 CaCl2.H2O، g/L5/0 (NH4)2SO4، g/L2/0 KCL، g/L1/0 NaCl بدون حضور دیازینون و در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه شد تا OD600 به ۵/۰ برسد. سوسپانسیون باکتری سانتریفیوژ شده (با سرعت ۷۰۰۰ دور در دقیقه در مدت ۵ دقیقه) و سپس چندین بار با محیط MSG بدون گلوکز شستشو داده شدند. در مرحلۀ بعد، رسوب باکتریایی به محیط MSM آگار حاوی g/L5/1 agar، mg/L50 CaCl2.H2O، g/L5/0 (NH4)2SO4، g/L2/0 KCL، g/L1/0 NaCl و محیط بدون گلوکز، با ۱۰۰۰ تا ۳۰۰۰ میلی گرم در لیتر دیازینون اضافه شد و سپس بهمدت ۷۲ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه شد.
برزدن ژنوم از دو مسیر انجام میشود: ۱. سازگاری شیمیایی (سویۀ IRLM1.G) ۲. مادۀ القاء کنندۀ جهش دی اتیل سولفات (DES) (سویۀ IRLM1.D).
ایجاد کتابخانه جهش یافته (IRLM1.G) از طریق سازگاری شیمیایی
جمعیت اول توسط سازگاری شیمیایی بهدست آمد که شامل افزایش تدریجی مقدار دیازینون در ۱۲۰۰ ساعت بود. این امر را میتوان به این شیوه توضیح داد که پس از تأیید مقاومت سویههای مادری، در معرض غلظتهای بالاتر دیازینون (۲۵۰۰-۳۰۰۰ میلیگرم در لیتر) در MSM آگار قرار گرفتند. سپس کشتها بهمدت ۷۲ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه شدند و در محلی تاریک نگهداری شدند تا از تجزیۀ نوری دیازینون جلوگیری شود.
ایجاد سویههای جهش یافته (IRLM1.D) توسط DES
سویههای بومی در محیط MSM کشت داده شد و در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه گردیده تا OD600 به ۵/۰ برسد. محیط کشت با ٪۵/۰، ٪۱، ٪۵/۱، ٪۲ ،٪۵/۲ و در نهایت ٪۳ DES (Sigma Aldrich) تیمار شدند و سپس بهمدت ۷۲ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد بهمدت ۳۵ دقیقه انکوبه شدند. سوسپانسیون باکتریایی سانتریفیوژ شده (۷۰۰۰ دور در دقیقه بهمدت ۵ دقیقه) و سپس با PBS شسته شد و در نهایت در محیط LB agar کشت داده شد.
غربالگری بر اساس رشد در حضور monocrotophos و تجزیه زیستی دیازینون در محیط مایع
کتابخانه جهش یافتۀ بهدست آمده بر روی LB agar کشت داده شده و در ۴۸ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه شد. سپس لایه نازک %۷/۰ آگاروز حاوی ۵۰ میلیمولار بافر فسفات سیترات و ۵/۵ میلیمولار monocrotophos به محیط اضافه شد و در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد بهمدت ۱ ساعت انکوبه گردید. کلنی ها بر اساس بزرگی میزان هاله انتخاب شدند.
کلنیهای انتخاب شده در محیط MSM حاوی دیازینون (۲۰۰۰، ۲۵۰۰ و ۳۰۰۰ میلیگرم در لیتر) تلقیح شدند. 246OD در ۰، ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت با استفاده از نانودراپ، اندازهگیری شد. همانطور که پیشتر ذکر شد، تمام آزمایشهای مربوط به دیازینون در شرایط تاریک بهعلت اثرهای نور بر روی دیازینون انجام شد.
آمادهسازی پروتوپلاست و تیمار غیرفعال سازی
پروتوپلاستها براساس روش Cocconcelli و همکاران با اعمال تغییرهایی انجام شد. سلولهای باکتریایی بهصورت کشت شبانه در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد کشت داده شدند و سپس با استفاده از سانتریفیوژ با سرعت ۷۰۰۰ دور در دقیقه برای ۵ دقیقه سلولها رسوب داده شدند. سلولهای باکتریایی در ۱۰ میلیلیتر بافر پروتوپلاست (PB) حاوی ۱۰ میلیمولار Tris-Hcl، ۲۰ میلیمولار CaCl2 و ۵/۰ مولار سوکروز و ۱ میلیگرم در میلیلیتر لیزوزیم و در دمای ۶۰ درجه سانتیگراد برای ۲ ساعت انکوبه شده تا غیرفعال شوند. تشکیل پروتوپلاست با استفاده از میکروسکوپ نوری مشاهده شد.
برزدن ژنوم
اولین جمعیت مورد استفاده برای برزدن ژنوم، کتابخانۀ جهش یافتهای بود که با افزایش سازگاری با غلظت دیازینون و عامل DES بهدست آمد. پروتوپلاستهای غیرفعال شده در نسبت ۱:۱ مخلوط و سپس سانتریفوژ شده و دوباره بهنسبت ۱:۹ درPEG ۶۰۰۰ (%۶۰) و PB حل شده و ۳۰ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه شدند. پروتوپلاستهای الحاقی در ۵ میلیلیتر PB و بهمدت ۲۰ دقیقه در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد سانتریفوژ گردیدند. سپس در محیط احیاء کننده (۲۰ میلیمولار کلرید منیزیم، ۵/۰ میلیمولار ساکارز و %۵/۱۰ BSA) بهمدت ۱۸ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد قرار داده شدند
روشهای آنالیزی
غربالگری براساس رشد در حضور monocrotophos انجام شد و پروتوپلاستهای الحاقی انتخاب شدند. همچنین، تجزیه زیستی دیازینون و مقاومت در برابر دیازینون براساس آنچه پیشتر شرح داده شد، مورد بررسی قرار گرفتند.
نتایج
ایجاد جمعیت سویههای اولیه برای برزدن ژنوم
اولین جمعیت کتابخانۀ جهش یافتۀ سازگار با افزایش غلظت دیازینون از ۱۰۰۰ تا ۳۳۰۰ میلیگرم در میلیلیتر در ۱۲۰۰ ساعت بهدست آمد. سویههای جهش یافته (IRLM1.G) قادر به رشد در غلظت ۳۲۵۰ میلیگرم در میلیلیتر دیازینون بودند در حالیکه سویۀ وحشی بهسختی در ۲۹۰۰ میلیگرم در میلیلیتر رشد کرد. نتایج در شکل ۱ نشان داده شده است.
تاریخچۀ استفاده از آفتکشهای ارگانو فسفاته برای مصارف کشاورزی به دهههای قبل باز میگردد. تعدادی از ترکیبهای ارگانوفسفره شامل مالاتیون، دیکلرووس و، پاراتیون کلروپیریفوس هستند. این ترکیبها، استیل کولین استراز را که یک آنزیم حیاتی در هیدرولیز استیل کولین عصبی است را مورد هدف قرار داده و منجر به غیرفعال شدن استیل کولین استراز و در نتیجه باعث سمیت میشوند (1). بر این اساس استفاده از این ترکیبها نگرانیهای سلامتی بسیاری را نسبتبه انسان و سایر موجودات زنده ایجاد کرده است. بهمنظور غلبهبر این مشکل، تلاشهای زیادی صورت گرفته و روشهای متفاوتی برای از بین بردن آلودگی ناشی از استفاده از این ترکیبها بکار گرفته شدهاند. روشهایی مانند روشهای فیزیکی، شیمیایی و بیولوژیکی میتوانند بهعنوان استراتژیهای آلودگیزدایی در نظر گرفته شوند (2). تجزیه زیستی بهعنوان یک روش برجسته بهعلت برخی از ویژگیهای مهم مانند اثر سریع، سازگار با محیطزیست، امن و تولید محصولات با سمیت کمتر شناخته میشود (3).
مطالعه های قبلی ثابت کردهاند که برخی از میکروارگانیسم-ها قادر به تخریب ترکیبهای سمی خاصی هستند (4). چندین باکتری جدا شده از جمله گونههای فلاووباکتریوم (Flavobacterium) و سودوموناسدیمینوتا امجی (Pseudomonas diminuta MG) نشان دادهاند که قابلیتهای قابل توجهی برای هیدرولیز کردن ترکیبهای ارگانو فسفره دارند (5،6). گونههای سودوموناس بهعنوان یک نامزد برجسته برای تجزیه زیست محیطی ترکیبهای ارگانوفسفره محسوب میشود و برای سمزدایی پسابهای آلوده و خاکهای کشاورزی استفاده میشود (7).
علیرغم مزایای متعدد استفاده از سویههای باکتریایی در فرآیند تجزیه زیستی، برخی از جنبههای کاربردی این سویهها باعث میشود تا از استفادۀ مکرر آنها جلوگیری شود. یکی از عوامل محدود کننده در دسترس بودن سوبسترا است. آنزیمهای سیتوپلاسمی این باکتریها مسئول فعالیتهای زیستی آنها هستند که دسترسی سوبسترا به آنها را محدود است. از سوی دیگر، نیاز به زمان بیشتری دارند تا روی سوبسترا عمل کنند، بنابراین کیفیت کارایی آنها کاهش مییابد (3).
ژنوم شافلینگ بهطور گستردهای برای افزایش تولید متابولیتها توسط سویههای باکتریایی، بهبود جذب سوبسترا و همچنین افزایش قدرت سویه استفاده میشود. این تکنیک ترکیبی از مزایای کراسینگ اور والدینی است که با بر زدن DNA و بازسازی کامل ژنوم همراه است که بهطور معمول با ترکیب (فیوژن) پروتوپلاست انجام میشود که پروسۀ نوترکیبی را افزایش میدهد. روش برزدن ژنوم در ابتدا توسط Stemmer و همکارانش در سال ۲۰۰۲ ارائه شد که برای بهبود تولید تیلوزین (Tylosin) توسط استرپتومایسس فرادیه (Streptomyces fradiae) مورد استفاده قرار گرفت. امروزه در بسیاری از آزمایش ها برای افزایش تولید متابولیت ها توسط سویه های باکتریایی، بهبود جذب سوبسترا و افزایش تحمل سویه استفاده میشود. برزدن ژنوم یک نقطه عطف در تکنولوژی بهبود سویهها و مهندسی متابولیک است (8).
در این مطالعه، با استفاده از روش بر زدن ژنوم، تلاش برای بهبود ویژگی های سودوموناس آئروژینوزا (Pseudomonas aeruginosa) به منظور تجزیۀ دیازینون انجام شد. مقاومت در مقابل سمیت سموم ارگانوفسفره و همچنین افزایش فعالیت سلول از اهداف این مطالعه هستند. هدف اصلی بهدست آوردن سویۀ جهش یافته ای است که میتواند در غلظتهای بالای دیازینون رشد کند و از سوی دیگر نیز دیازینون را در مدت زمان کوتاهی تجزیه کند.
روش کار
سویههای باکتریایی
سویۀ وحشی سودوموناس آئروژینوزا به شماره مجموعه JQ917006.1 از فاضلابهای صنعتی (پسابهای کارخانههای تولید آفتکشها و خاک آلوده آنها) در ایران جدا شده است.
مواد شیمیایی و حلالها
دیازینون (خلوص ٪۵/۹۹) از Sigma-Aldrich خریداری شد. سایر مواد شیمیایی و حلالها نیز از Merck آلمان تهیه شد.
آزمون تحمل سویههای بومی در برابر دیازینون
در ابتدا سویۀ IRLM.1 جدا شده از سودوموناس آئروژینوزا در محیط کشت MSM حاوی %2 گلوکز، mg/L50 CaCl2.H2O، g/L5/0 (NH4)2SO4، g/L2/0 KCL، g/L1/0 NaCl بدون حضور دیازینون و در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه شد تا OD600 به ۵/۰ برسد. سوسپانسیون باکتری سانتریفیوژ شده (با سرعت ۷۰۰۰ دور در دقیقه در مدت ۵ دقیقه) و سپس چندین بار با محیط MSG بدون گلوکز شستشو داده شدند. در مرحلۀ بعد، رسوب باکتریایی به محیط MSM آگار حاوی g/L5/1 agar، mg/L50 CaCl2.H2O، g/L5/0 (NH4)2SO4، g/L2/0 KCL، g/L1/0 NaCl و محیط بدون گلوکز، با ۱۰۰۰ تا ۳۰۰۰ میلی گرم در لیتر دیازینون اضافه شد و سپس بهمدت ۷۲ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه شد.
برزدن ژنوم از دو مسیر انجام میشود: ۱. سازگاری شیمیایی (سویۀ IRLM1.G) ۲. مادۀ القاء کنندۀ جهش دی اتیل سولفات (DES) (سویۀ IRLM1.D).
ایجاد کتابخانه جهش یافته (IRLM1.G) از طریق سازگاری شیمیایی
جمعیت اول توسط سازگاری شیمیایی بهدست آمد که شامل افزایش تدریجی مقدار دیازینون در ۱۲۰۰ ساعت بود. این امر را میتوان به این شیوه توضیح داد که پس از تأیید مقاومت سویههای مادری، در معرض غلظتهای بالاتر دیازینون (۲۵۰۰-۳۰۰۰ میلیگرم در لیتر) در MSM آگار قرار گرفتند. سپس کشتها بهمدت ۷۲ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه شدند و در محلی تاریک نگهداری شدند تا از تجزیۀ نوری دیازینون جلوگیری شود.
ایجاد سویههای جهش یافته (IRLM1.D) توسط DES
سویههای بومی در محیط MSM کشت داده شد و در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه گردیده تا OD600 به ۵/۰ برسد. محیط کشت با ٪۵/۰، ٪۱، ٪۵/۱، ٪۲ ،٪۵/۲ و در نهایت ٪۳ DES (Sigma Aldrich) تیمار شدند و سپس بهمدت ۷۲ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد بهمدت ۳۵ دقیقه انکوبه شدند. سوسپانسیون باکتریایی سانتریفیوژ شده (۷۰۰۰ دور در دقیقه بهمدت ۵ دقیقه) و سپس با PBS شسته شد و در نهایت در محیط LB agar کشت داده شد.
غربالگری بر اساس رشد در حضور monocrotophos و تجزیه زیستی دیازینون در محیط مایع
کتابخانه جهش یافتۀ بهدست آمده بر روی LB agar کشت داده شده و در ۴۸ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه شد. سپس لایه نازک %۷/۰ آگاروز حاوی ۵۰ میلیمولار بافر فسفات سیترات و ۵/۵ میلیمولار monocrotophos به محیط اضافه شد و در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد بهمدت ۱ ساعت انکوبه گردید. کلنی ها بر اساس بزرگی میزان هاله انتخاب شدند.
کلنیهای انتخاب شده در محیط MSM حاوی دیازینون (۲۰۰۰، ۲۵۰۰ و ۳۰۰۰ میلیگرم در لیتر) تلقیح شدند. 246OD در ۰، ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت با استفاده از نانودراپ، اندازهگیری شد. همانطور که پیشتر ذکر شد، تمام آزمایشهای مربوط به دیازینون در شرایط تاریک بهعلت اثرهای نور بر روی دیازینون انجام شد.
آمادهسازی پروتوپلاست و تیمار غیرفعال سازی
پروتوپلاستها براساس روش Cocconcelli و همکاران با اعمال تغییرهایی انجام شد. سلولهای باکتریایی بهصورت کشت شبانه در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد کشت داده شدند و سپس با استفاده از سانتریفیوژ با سرعت ۷۰۰۰ دور در دقیقه برای ۵ دقیقه سلولها رسوب داده شدند. سلولهای باکتریایی در ۱۰ میلیلیتر بافر پروتوپلاست (PB) حاوی ۱۰ میلیمولار Tris-Hcl، ۲۰ میلیمولار CaCl2 و ۵/۰ مولار سوکروز و ۱ میلیگرم در میلیلیتر لیزوزیم و در دمای ۶۰ درجه سانتیگراد برای ۲ ساعت انکوبه شده تا غیرفعال شوند. تشکیل پروتوپلاست با استفاده از میکروسکوپ نوری مشاهده شد.
برزدن ژنوم
اولین جمعیت مورد استفاده برای برزدن ژنوم، کتابخانۀ جهش یافتهای بود که با افزایش سازگاری با غلظت دیازینون و عامل DES بهدست آمد. پروتوپلاستهای غیرفعال شده در نسبت ۱:۱ مخلوط و سپس سانتریفوژ شده و دوباره بهنسبت ۱:۹ درPEG ۶۰۰۰ (%۶۰) و PB حل شده و ۳۰ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه شدند. پروتوپلاستهای الحاقی در ۵ میلیلیتر PB و بهمدت ۲۰ دقیقه در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد سانتریفوژ گردیدند. سپس در محیط احیاء کننده (۲۰ میلیمولار کلرید منیزیم، ۵/۰ میلیمولار ساکارز و %۵/۱۰ BSA) بهمدت ۱۸ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد قرار داده شدند
روشهای آنالیزی
غربالگری براساس رشد در حضور monocrotophos انجام شد و پروتوپلاستهای الحاقی انتخاب شدند. همچنین، تجزیه زیستی دیازینون و مقاومت در برابر دیازینون براساس آنچه پیشتر شرح داده شد، مورد بررسی قرار گرفتند.
نتایج
ایجاد جمعیت سویههای اولیه برای برزدن ژنوم
اولین جمعیت کتابخانۀ جهش یافتۀ سازگار با افزایش غلظت دیازینون از ۱۰۰۰ تا ۳۳۰۰ میلیگرم در میلیلیتر در ۱۲۰۰ ساعت بهدست آمد. سویههای جهش یافته (IRLM1.G) قادر به رشد در غلظت ۳۲۵۰ میلیگرم در میلیلیتر دیازینون بودند در حالیکه سویۀ وحشی بهسختی در ۲۹۰۰ میلیگرم در میلیلیتر رشد کرد. نتایج در شکل ۱ نشان داده شده است.
جدول ۱- رشد جمعیت اول سویههای جهش یافته در غلظتهای مختلف دیازینون
| زمان | نمونه | غلظت دیازینون (mg/L) |
||
| ۷۲ ساعت | ۴۸ ساعت | ۲۴ ساعت | ||
| + | + | + | IRLM1.G | ۲۶۰۰-۱۰۰۰ |
| + | + | + | IRLM1 | |
| + | + | + | IRLM1.G | ۲۷۰۰ |
| + | + | - | IRLM1 | |
| + | + | + | IRLM1.G | ۲۸۰۰ |
| + | - | - | IRLM1 | |
| + | + | + | IRLM1.G | ۲۹۰۰ |
| + | + | - | IRLM1 | |
| + | + | + | IRLM1.G | ۲۹۵۰ |
| - | - | - | IRLM1 | |
| + | + | + | IRLM1.G | ۳۰۰۰ |
| - | - | - | IRLM1 | |
| + | + | + | IRLM1.G | ۳۰۵۰ |
| - | - | - | IRLM1 | |
| + | + | + | IRLM1.G | ۳۱۰۰ |
| -- | - | - | IRLM1 | |
| + | + | + | IRLM1.G | ۳۱۵۰ |
| - | - | - | IRLM1 | |
| + | + | + | IRLM1.G | ۳۲۰۰ |
| - | - | - | IRLM1 | |
| + | + | - | IRLM1.G | ۳۲۵۰ |
| - | - | - | IRLM1 | |
| - | - | - | IRLM1.G | ۳۳۰۰ |
| - | - | - | IRLM1 | |
جمعیت دوم سویههای جهش یافته (IRLM1.D) با تیمار DES بهدست آمد. تعداد کلنیهای موجود در MSM آگار حاوی دیازینون از ۵/۰ تا ۳ درصد تیمار DES کاهش یافت. رنگدانه سبز که مشخصه سودوموناس است، در میزان %۲ و %۵/۲ از DES تولید نمیشود. سویههای جهش یافته با توجهبه مقدار هاله در LB آگار حاوی monocrotophos و سرعت تجزیۀ زیستی دیازینون انتخاب شدند. بنابراین، ۸ سویۀ جهش یافته برای برزدن ژنوم آماده شدند.
براساس نتایج جذب نوری بهدست آمده، سویههای IRLM1.D4 و IRLM1.D8 نتایج رضایتبخشی نسبتبه سویههای دیگر را نشان میدهد. بنابراین، سویۀ IRLM1.D8 بهعنوان یکی از سویههای والد برای برزدن ژنوم در نظر گرفته شد.
براساس نتایج جذب نوری بهدست آمده، سویههای IRLM1.D4 و IRLM1.D8 نتایج رضایتبخشی نسبتبه سویههای دیگر را نشان میدهد. بنابراین، سویۀ IRLM1.D8 بهعنوان یکی از سویههای والد برای برزدن ژنوم در نظر گرفته شد.
شکل 1- جذب نوری و ارزیابی تجزیۀ زیستی دیازینون (۲۰۰۰ میلیگرم/میلیلیتر دیازینون) با استفاده از سویههای بهبود یافته روند جهشزایی DES
شکل ۲- جذب نوری و ارزیابی تجزیه زیستی دیازینون (۳۰۰۰ میلیگرم/لیتر دیازینون) با استفاده از سویههای بهبود یافته روند جهشزایی DES
شکل ۳- مقایسه فعالیت کل سلول با سویههای بهبود یافته با DES در ۲۰۰۰ و ۳۰۰۰ میلیگرم در لیتر دیازینون.برزدن ژنوم و غربالگری
پروتوپلاستهای ایجاد شده توسط میکروسکوپ، پس از شکستن دیواره سلولی با لیزوزیم مشاهده شدند. سویههای بر خورده با توجهبه مقدار هاله روی LB آگار با monocrotophos انتخاب شدند. ۱۲ سویۀ بر خورده به روش تحلیلی انتخاب شدند.
رشد باکتری و تجزیه زیستی دیازینون در MSM
تجزیه زیستی دیازینون در MSM حاوی دیازینون با استفاده از چک کردن OD246 و توانایی رشد سویههای بر خورده در محیط MSM آگار حاوی دیازینون مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که اختلاف معنیداری (۰۵/۰<p) در میزان تجزیه بیولوژیکی سویههای بر خورده نسبتبه سویههای والد (IRLM1.G و IRLM1.D) و همچنین سویههای کنترل در محیط MSM حاوی دیازینون (شکل ۳) وجود دارد.
نتایج حاصل از رشد در آگار MSM حاوی دیازینون (۳۰۰۰، ۴۰۰۰ و ۵۰۰۰ میلیگرم در لیتر) نشان داد که تنها یک سویۀ بر خورده (IRLM1.F3) قادر به رشد در ۳۰۰۰ میلیگرم/لیتر دیازینون بود، اما تنها یکی از آنها توانست در ۴۰۰۰ و ۵۰۰۰ میلیگرم در لیتر دیازینون رشد کند. در مقابل، سویۀ بومی (IRLM1) تغییرهای جزئی در OD246 را نسبتبه نمونه غیر تلقیح شده نشان داد.
بحث
تیمار زیستی ترکیبهای ارگانوفسفره از خاک و آب سطحی یک وظیفه اساسی بشمار میرود. فلاووباکتریوم با شماره دسترسی ATCC 27551، اولین باکتری تجزیه کنندۀ ترکیبهای ارگانوفسفره، شناسایی و از خاک فیلیپین جدا شده است. تاکنون باکتریهای دیگری نیز کشف شدهاند که میتوانند از ترکیبهای ارگانوفسفره بهعنوان تنها منبع کربن، نیتروژن و فسفر استفاده کنند.
در مطالعههای مختلف، سویههای تجزیه کنندۀ ترکیبهای ارگانوفسفره برای از بین بردن آلودگیهای محیط زیست معرفی شدهاند. بهمنظور حذف این ترکیبها از فاضلاب صنعتی، باکتریهای تخریب کننده باید قادر به رشد در غلظت
بالای ترکیبهای ارگانوفسفره باشند تا قادر باشند این ترکیبها را تجزیه کنند. سویۀ وحشی در مطالعۀ حاضر از خاک و پساب کارخانجات جدا شده است. در حالیکه در مطالعهای دیگر، باکتریهای تجزیه کننده از خاک جدا شده بودند. این امر نقطهای قوی در این تحقیق است که سویۀ وحشی ما قادر است تا در غلظتهای بالای دیازینون (تا ۲۹۰۰ میلیگرم در لیتر) رشد کند. علاوهبر این، فعالیت این سویه وحشی با استفاده از روش برزدن ژنوم بهبود یافته است.
پروتوپلاستهای ایجاد شده توسط میکروسکوپ، پس از شکستن دیواره سلولی با لیزوزیم مشاهده شدند. سویههای بر خورده با توجهبه مقدار هاله روی LB آگار با monocrotophos انتخاب شدند. ۱۲ سویۀ بر خورده به روش تحلیلی انتخاب شدند.
رشد باکتری و تجزیه زیستی دیازینون در MSM
تجزیه زیستی دیازینون در MSM حاوی دیازینون با استفاده از چک کردن OD246 و توانایی رشد سویههای بر خورده در محیط MSM آگار حاوی دیازینون مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که اختلاف معنیداری (۰۵/۰<p) در میزان تجزیه بیولوژیکی سویههای بر خورده نسبتبه سویههای والد (IRLM1.G و IRLM1.D) و همچنین سویههای کنترل در محیط MSM حاوی دیازینون (شکل ۳) وجود دارد.
نتایج حاصل از رشد در آگار MSM حاوی دیازینون (۳۰۰۰، ۴۰۰۰ و ۵۰۰۰ میلیگرم در لیتر) نشان داد که تنها یک سویۀ بر خورده (IRLM1.F3) قادر به رشد در ۳۰۰۰ میلیگرم/لیتر دیازینون بود، اما تنها یکی از آنها توانست در ۴۰۰۰ و ۵۰۰۰ میلیگرم در لیتر دیازینون رشد کند. در مقابل، سویۀ بومی (IRLM1) تغییرهای جزئی در OD246 را نسبتبه نمونه غیر تلقیح شده نشان داد.
بحث
تیمار زیستی ترکیبهای ارگانوفسفره از خاک و آب سطحی یک وظیفه اساسی بشمار میرود. فلاووباکتریوم با شماره دسترسی ATCC 27551، اولین باکتری تجزیه کنندۀ ترکیبهای ارگانوفسفره، شناسایی و از خاک فیلیپین جدا شده است. تاکنون باکتریهای دیگری نیز کشف شدهاند که میتوانند از ترکیبهای ارگانوفسفره بهعنوان تنها منبع کربن، نیتروژن و فسفر استفاده کنند.
در مطالعههای مختلف، سویههای تجزیه کنندۀ ترکیبهای ارگانوفسفره برای از بین بردن آلودگیهای محیط زیست معرفی شدهاند. بهمنظور حذف این ترکیبها از فاضلاب صنعتی، باکتریهای تخریب کننده باید قادر به رشد در غلظت
بالای ترکیبهای ارگانوفسفره باشند تا قادر باشند این ترکیبها را تجزیه کنند. سویۀ وحشی در مطالعۀ حاضر از خاک و پساب کارخانجات جدا شده است. در حالیکه در مطالعهای دیگر، باکتریهای تجزیه کننده از خاک جدا شده بودند. این امر نقطهای قوی در این تحقیق است که سویۀ وحشی ما قادر است تا در غلظتهای بالای دیازینون (تا ۲۹۰۰ میلیگرم در لیتر) رشد کند. علاوهبر این، فعالیت این سویه وحشی با استفاده از روش برزدن ژنوم بهبود یافته است.
شکل ۴- ارزیابی تخریب زیستی دیازینون (۳۰۰۰ میلیگرم/لیتر دیازینون) با استفاده از سویههای بر خورده.
شکل ۵- ارزیابی فعالیت کل سلول با استفاده از سویۀ بر خورده در ۳۰۰۰ میلیگرم در لیتر دیازینون.
.
جدول ۲- رشد سویههای برخورده در MSM آگار حاوی دیازینون (در غلظتهای مختلف) بهعنوان تنها منبع کربن، فسفر و انرژی.
شکل ۵- ارزیابی فعالیت کل سلول با استفاده از سویۀ بر خورده در ۳۰۰۰ میلیگرم در لیتر دیازینون..
جدول ۲- رشد سویههای برخورده در MSM آگار حاوی دیازینون (در غلظتهای مختلف) بهعنوان تنها منبع کربن، فسفر و انرژی.
| ۵۰۰۰ mg/L | ۴۰۰۰ mg/L | ۳۰۰۰ mg/L | بیش از mg/L ۲۵۰۰ | نمونه |
| - | - | + | + | IRLM1.G |
| - | - | - | + | IRLM1.D |
| - | - | - | + | IRLM1 |
| - | - | + | + | IRLM1.F1 |
| + | + | + | + | IRLM1.F2 |
| - | - | + | + | IRLM1.F3 |
| - | - | + | + | IRLM1.F4 |
| - | - | + | + | IRLM1.F5 |
| - | - | + | + | IRLM1.F6 |
| - | - | + | + | IRLM1.F7 |
| - | - | + | + | IRLM1.F8 |
| - | - | + | + | IRLM1.F9 |
| - | - | + | + | IRLM1.F10 |
| - | - | + | + | IRLM1.F11 |
| - | - | + | + | IRLM1.F12 |
از آنجاییکه این مطالعه هدف، بهبود بخشیدن به عملکرد باکتریها و فراهم کردن توانایی رشد آنها در غلظتهای بالایی از ترکیبهای ارگانوفسفره است، سازگاری با این ترکیبها و جهشزایی DES در این مطالعه بهکار برده شده است. در مقایسه با سایر مطالعههای (2002) Patnaik و همکاران بهمنظور بهبود تحمل pH و تولید اسید در باکتری، تطبیق pH و جهشزایی نیتروزوگوانیدین (NTG) استفاده شد (9).
برخی از تغییرهایی مانند افزایش تحمل به ترکیبهای ارگانوفسفره و توانایی رشد در غلظتهای بالای این ترکیبها، نیازمند تغییرهای زیادی در ژنوم هستند که قابل پیشبینی نیستند. پس از سازگاری با ترکیبهای ارگانوفسفره، سویۀ IRLM1.G قادر به تحمل و رشد در mg/L ۳۲۵۰ دیازینون (جدول ۱) بود. از این امر میتوان نتیجه گرفت که افزایش تدریجی غلظت دیازینون ممکن است باعث جهش شود که منجر به انطباق با شرایط جدید میشود.
از سوی دیگر، در بسیاری از مطالعهها، جهشزایی DES برای آمادهسازی سویهها مورد استفاده قرار گرفته است. همچنین ما مشاهده کردیم که جهشزایی DES برای بهدست آوردن سویۀ IRLM1.D8 بهعنوان یک سویۀ بهبود یافته کارآمد است. بهطوریکه فعالیت کل سلول توسط IRLM1.D8 تا ۵ و ۷/۱۶ برابر بیشتر از سویۀ وحشی در غلظتهای ۲۰۰۰ و ۳۰۰۰ میلیگرم در لیتر دیازینون بوده است. بسیاری از گونههای جهش یافته با DES (IRLM1.F3,4,6,7) در غلظتهای ۲۰۰۰ و ۳۰۰۰ میلیگرم در لیتر دیازینون نشان دادند که توانایی بیشتری در تجزیه پیدا میکنند (شکل ۳). بنابراین، جهشهای ناشی از ژنهایی که در تجزیه ترکیبهای ارگانوفسفره دخالت دارند، حتی فعالیت تجزیهکنندگی را حتی در غلظتهای بالای دیازینون مختل نمیکنند.
پس از یک دور برزدن ژنوم و غربالگری، تمام سویهها، فعالیت کل سلول را در ۳۰۰۰ میلیگرم/لیتر دیازینون نشان دادند، بهطوریکه فعالیت کل سلولهای IRLM1.F2 و IRLM.F3 بهترتیب به میزان U/ml ۵4/۰ و U/ml ۵2/۰ بود. این فعالیت ۶۰ و ۷/۵۷ برابر بیشتر از سویۀ وحشی و ۵/۳ و ۴/۳ برابر بیشتر از سویۀ ابتدایی است. در مطالعهای توسط(2013)Wang Ch و همکاران پس از ۶ دور برزدن ژنوم، ۲/۴ برابر بهبود برای پنیسیلیوم سیترینوم و در مطالعۀ (2002) Patnaik R و همکاران پس از ۵ دور برزدن ژنوم ۳ برابر بهبودی برای لاکتوباسیلوس گزارش شد (9). (2014) Zhang Y. F و همکاران همچنین بهبود ۴/۲ برابری لاکتوکوکوس لاکتیس را پس از ۴ دور بهدست آوردند (10). یکی از تفاوتهای عمیق بین مطالعۀ حاضر و سایر مطالعهها، تعداد دورهای برزدن ژنوم است که تنها در یک دور نسبتبه چندین مرحله از بر زدن ژنوم در مطالعههای دیگر نتایج خوبی بهدست آمد.
با این وجود، انتخاب روش نقش مهمی در بهدست آوردن نتیجه نهایی ایفا میکند. در برخی از روشها، نتایج نشان میدهند که تفاوتی بین نوع سویۀ وحشی و سویۀ بر خورده وجود ندارد و بنابراین فعالیت آنزیم ثابت باقی میماند یا به میزان بسیار کمی افزایش مییابد.
تاکنون روشهای دیگری مانند برزدن DNA و ایجاد جهش با PCR برای تولید سویههای نوترکیب توسط چندین محقق استفاده شده است، اما استفاده از میکروارگانیسمها در بهبود تجزیۀ زیستی دارای مزایای خاصی از قبیل پایداری، سازگاری با محیط زیست، تولید مقرونبه صرفه و آسان نیز است.
چندین باکتری با توالیهای کمابیش یکسان opd در سراسر جهان شناسایی شده اند. ژن مسئول تجزیۀ دیازینون و دیگر ارگانوفسفرهها، opd است. ژن opd در ژنوم چندین باکتری وجود دارد.
اگر چه تمام سویه های الحاقی فعالیت بیشتری را در مقایسه با نوع وحشی نشان دادند، اما تنها IRLM1.F2 قادر به رشد در محیط کشت حاوی بیش از ۳۰۰۰ میلی-گرم در لیتر غلظت دیازینون بود. سویههای دیگر با وجود افزایش فعالیت، قادر نبودند در غلظتهای بالاتر دیازینون رشد کنند. با این وجود، وقوع همزمان فعالیت افزایش یافته و توانایی رشد در غلظتهای بالا دیازینون کمتر احتمال دارد. بنابراین، سویۀ IRLM1.F2 را با افزایش فعالیت (۷/۵۷ برابر بیشتر از سویههای نوع وحشی) و توانایی رشد در غلظتهای بالای دیازینون (تا ۵۰۰۰ میلیگرم در لیتر) پس از یک دور برزدن ژنوم، با موفقیت بهدست آوردیم.
نتیجهگیری
انتخاب روش باید مطابق با هدف مطالعه باشد. برزدن ژنوم بهراحتی و بهسرعت می تواند ویژگیهای میکروارگانیسمها را بهمنظور استفاده در کاربردهای تجاری مورد استفاده قرار دهد. براساس نتایج ما، سویۀ IRLM1.F2 میتواند بهعنوان سویۀ نامزد برای تولید صنعتی برای اهداف بهبود زیستی بهویژه در تصفیه فاضلاب درنظر گرفته میشود. همچنین این سویه میتواند برای شناسایی جهشهای مسئول بهبود فعالیت و تحمل به غلظتهای بالای سم، مورد استفاده قرار گیرد.
سپاسگزاری
این تحقیق زیر نظر و با حمایت مالی در دانشگاه علوم پزشکی بقیه اللهُ بخش بیوتکنولوژی به انجام رسیده است که بدینوسیله از کلیه مسئولین مرکز مربوطه تشکر و قدردانی میشود.
برخی از تغییرهایی مانند افزایش تحمل به ترکیبهای ارگانوفسفره و توانایی رشد در غلظتهای بالای این ترکیبها، نیازمند تغییرهای زیادی در ژنوم هستند که قابل پیشبینی نیستند. پس از سازگاری با ترکیبهای ارگانوفسفره، سویۀ IRLM1.G قادر به تحمل و رشد در mg/L ۳۲۵۰ دیازینون (جدول ۱) بود. از این امر میتوان نتیجه گرفت که افزایش تدریجی غلظت دیازینون ممکن است باعث جهش شود که منجر به انطباق با شرایط جدید میشود.
از سوی دیگر، در بسیاری از مطالعهها، جهشزایی DES برای آمادهسازی سویهها مورد استفاده قرار گرفته است. همچنین ما مشاهده کردیم که جهشزایی DES برای بهدست آوردن سویۀ IRLM1.D8 بهعنوان یک سویۀ بهبود یافته کارآمد است. بهطوریکه فعالیت کل سلول توسط IRLM1.D8 تا ۵ و ۷/۱۶ برابر بیشتر از سویۀ وحشی در غلظتهای ۲۰۰۰ و ۳۰۰۰ میلیگرم در لیتر دیازینون بوده است. بسیاری از گونههای جهش یافته با DES (IRLM1.F3,4,6,7) در غلظتهای ۲۰۰۰ و ۳۰۰۰ میلیگرم در لیتر دیازینون نشان دادند که توانایی بیشتری در تجزیه پیدا میکنند (شکل ۳). بنابراین، جهشهای ناشی از ژنهایی که در تجزیه ترکیبهای ارگانوفسفره دخالت دارند، حتی فعالیت تجزیهکنندگی را حتی در غلظتهای بالای دیازینون مختل نمیکنند.
پس از یک دور برزدن ژنوم و غربالگری، تمام سویهها، فعالیت کل سلول را در ۳۰۰۰ میلیگرم/لیتر دیازینون نشان دادند، بهطوریکه فعالیت کل سلولهای IRLM1.F2 و IRLM.F3 بهترتیب به میزان U/ml ۵4/۰ و U/ml ۵2/۰ بود. این فعالیت ۶۰ و ۷/۵۷ برابر بیشتر از سویۀ وحشی و ۵/۳ و ۴/۳ برابر بیشتر از سویۀ ابتدایی است. در مطالعهای توسط(2013)Wang Ch و همکاران پس از ۶ دور برزدن ژنوم، ۲/۴ برابر بهبود برای پنیسیلیوم سیترینوم و در مطالعۀ (2002) Patnaik R و همکاران پس از ۵ دور برزدن ژنوم ۳ برابر بهبودی برای لاکتوباسیلوس گزارش شد (9). (2014) Zhang Y. F و همکاران همچنین بهبود ۴/۲ برابری لاکتوکوکوس لاکتیس را پس از ۴ دور بهدست آوردند (10). یکی از تفاوتهای عمیق بین مطالعۀ حاضر و سایر مطالعهها، تعداد دورهای برزدن ژنوم است که تنها در یک دور نسبتبه چندین مرحله از بر زدن ژنوم در مطالعههای دیگر نتایج خوبی بهدست آمد.
با این وجود، انتخاب روش نقش مهمی در بهدست آوردن نتیجه نهایی ایفا میکند. در برخی از روشها، نتایج نشان میدهند که تفاوتی بین نوع سویۀ وحشی و سویۀ بر خورده وجود ندارد و بنابراین فعالیت آنزیم ثابت باقی میماند یا به میزان بسیار کمی افزایش مییابد.
تاکنون روشهای دیگری مانند برزدن DNA و ایجاد جهش با PCR برای تولید سویههای نوترکیب توسط چندین محقق استفاده شده است، اما استفاده از میکروارگانیسمها در بهبود تجزیۀ زیستی دارای مزایای خاصی از قبیل پایداری، سازگاری با محیط زیست، تولید مقرونبه صرفه و آسان نیز است.
چندین باکتری با توالیهای کمابیش یکسان opd در سراسر جهان شناسایی شده اند. ژن مسئول تجزیۀ دیازینون و دیگر ارگانوفسفرهها، opd است. ژن opd در ژنوم چندین باکتری وجود دارد.
اگر چه تمام سویه های الحاقی فعالیت بیشتری را در مقایسه با نوع وحشی نشان دادند، اما تنها IRLM1.F2 قادر به رشد در محیط کشت حاوی بیش از ۳۰۰۰ میلی-گرم در لیتر غلظت دیازینون بود. سویههای دیگر با وجود افزایش فعالیت، قادر نبودند در غلظتهای بالاتر دیازینون رشد کنند. با این وجود، وقوع همزمان فعالیت افزایش یافته و توانایی رشد در غلظتهای بالا دیازینون کمتر احتمال دارد. بنابراین، سویۀ IRLM1.F2 را با افزایش فعالیت (۷/۵۷ برابر بیشتر از سویههای نوع وحشی) و توانایی رشد در غلظتهای بالای دیازینون (تا ۵۰۰۰ میلیگرم در لیتر) پس از یک دور برزدن ژنوم، با موفقیت بهدست آوردیم.
نتیجهگیری
انتخاب روش باید مطابق با هدف مطالعه باشد. برزدن ژنوم بهراحتی و بهسرعت می تواند ویژگیهای میکروارگانیسمها را بهمنظور استفاده در کاربردهای تجاری مورد استفاده قرار دهد. براساس نتایج ما، سویۀ IRLM1.F2 میتواند بهعنوان سویۀ نامزد برای تولید صنعتی برای اهداف بهبود زیستی بهویژه در تصفیه فاضلاب درنظر گرفته میشود. همچنین این سویه میتواند برای شناسایی جهشهای مسئول بهبود فعالیت و تحمل به غلظتهای بالای سم، مورد استفاده قرار گیرد.
سپاسگزاری
این تحقیق زیر نظر و با حمایت مالی در دانشگاه علوم پزشکی بقیه اللهُ بخش بیوتکنولوژی به انجام رسیده است که بدینوسیله از کلیه مسئولین مرکز مربوطه تشکر و قدردانی میشود.
منابع
1- Narang U, Narang P, Gupta O. Organophosphorus poisoning: A social calamity. Journal of Mahatma Gandhi Institute of Medical Sciences. 2015;20(1):46.
2- Gianessi LP. The increasing importance of herbicides in worldwide crop production. Pest management science. 2013;69(10):1099-105.
3- Shimazu M, Nguyen A, Mulchandani A, Chen W. Cell Surface Display of Organophosphorus Hydrolase in Pseudomonasputida Using an Ice‐Nucleation Protein Anchor. Biotechnology progress. 2003;19(5):1612-4.
4- Diaz Casas AZ. Bioremediation of the organophosphate methyl parathion using genetically engineered and native organisms: Texas A&M University; 2005.
5- Serdar CM, Murdock DC, Rohde MF. Parathion hydrolase gene from Pseudomonas diminuta MG: subcloning, complete nucleotide sequence, and expression of the mature portion of the enzyme in Escherichia coli. Bio/technology. 1989;7(11):1151.
6- Mulbry WW, Karns JS. Parathion hydrolase specified by the Flavobacterium opd gene: relationship between the gene and protein. Journal of Bacteriology. 1989;171(12):6740-6.
7- Latifi AM, Karami A, Khodi S. Efficient surface display of diisopropylfluorophosphatase (DFPase) in E. coli for biodegradation of toxic organophosphorus compounds (DFP and Cp). Applied biochemistry and biotechnology. 36-624: (3) 177. 2015
8- Leja K, Myszka K, Czaczyk K. Genome shuffling: a method to improve biotechnological processes. BioTechnologia Journal of Biotechnology Computational Biology and Bionanotechnology. 2011;92(4).
9- Patnaik R, Louie S, Gavrilovic V, Perry K, Stemmer WP, Ryan CM, et al. Genome shuffling of Lactobacillus for improved acid tolerance. Nature biotechnology. 2002;20(7):707.
10- Zhang Y, Liu S, Du Y, Feng W, Liu J, Qiao J. Genome shuffling of Lactococcus lactis subspecies lactis YF11 for improving nisin Z production and comparative analysis. Journal of dairy science. 2014;97(5):2528-41.
2- Gianessi LP. The increasing importance of herbicides in worldwide crop production. Pest management science. 2013;69(10):1099-105.
3- Shimazu M, Nguyen A, Mulchandani A, Chen W. Cell Surface Display of Organophosphorus Hydrolase in Pseudomonasputida Using an Ice‐Nucleation Protein Anchor. Biotechnology progress. 2003;19(5):1612-4.
4- Diaz Casas AZ. Bioremediation of the organophosphate methyl parathion using genetically engineered and native organisms: Texas A&M University; 2005.
5- Serdar CM, Murdock DC, Rohde MF. Parathion hydrolase gene from Pseudomonas diminuta MG: subcloning, complete nucleotide sequence, and expression of the mature portion of the enzyme in Escherichia coli. Bio/technology. 1989;7(11):1151.
6- Mulbry WW, Karns JS. Parathion hydrolase specified by the Flavobacterium opd gene: relationship between the gene and protein. Journal of Bacteriology. 1989;171(12):6740-6.
7- Latifi AM, Karami A, Khodi S. Efficient surface display of diisopropylfluorophosphatase (DFPase) in E. coli for biodegradation of toxic organophosphorus compounds (DFP and Cp). Applied biochemistry and biotechnology. 36-624: (3) 177. 2015
8- Leja K, Myszka K, Czaczyk K. Genome shuffling: a method to improve biotechnological processes. BioTechnologia Journal of Biotechnology Computational Biology and Bionanotechnology. 2011;92(4).
9- Patnaik R, Louie S, Gavrilovic V, Perry K, Stemmer WP, Ryan CM, et al. Genome shuffling of Lactobacillus for improved acid tolerance. Nature biotechnology. 2002;20(7):707.
10- Zhang Y, Liu S, Du Y, Feng W, Liu J, Qiao J. Genome shuffling of Lactococcus lactis subspecies lactis YF11 for improving nisin Z production and comparative analysis. Journal of dairy science. 2014;97(5):2528-41.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشی |
موضوع مقاله:
سلولی و مولکولی
دریافت: 1399/4/7 | پذیرش: 1399/4/7 | انتشار: 1399/4/7
دریافت: 1399/4/7 | پذیرش: 1399/4/7 | انتشار: 1399/4/7
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
