دوره 10، شماره 39 - ( 4-1399 )                   جلد 10 شماره 39 صفحات 102-91 | برگشت به فهرست نسخه ها

XML English Abstract Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Mirzaei M, Rastegar Shariat Panahi M, Ghahremani E, Rezae E, Seid Moradi R, Farnoosh G et al . Improving the activity and stability of OPH enzyme using DNA Shuffling method. NCMBJ. 2020; 10 (39) :91-102
URL: http://ncmbjpiau.ir/article-1-1294-fa.html
میرزایی مرتضی، رستگار شریعت پناهی مونا، قهرمانی عنایت، رضایی احسان، صید مرادی رضوان، فرنوش غلامرضا و همکاران.. بهبود فعالیت و پایداری آنزیم OPH با استفاده از روش DNA شافلینگ. مجله تازه هاي بيوتكنولوژي سلولي و مولكولي. 1399; 10 (39) :102-91

URL: http://ncmbjpiau.ir/article-1-1294-fa.html


مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی کاربردی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله، تهران، ایران
متن کامل [PDF 3729 kb]   (540 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (2164 مشاهده)
متن کامل:   (342 مشاهده)
بهبود فعالیت و پایداری آنزیم OPH با استفاده از روش DNA شافلینگ
مرتضی میرزایی1، مونا رستگار شریعت پناهی2، عنایت قهرمانی1، احسان رضایی3، رضوان صید مرادی1، غلامرضا فرنوش1، علی محمد لطیفی*1
1-مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی کاربردی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله، تهران، ایران
2-گروه بیوشیمی، دانشگاه پیام نور، تهران، ایران
3-مرکز تحقیقات زیست­شناسی مولکولی، انستیتوی زیست­شناسی و مسمومیت­ها، دانشگاه علوم پزشکی بقیه­الله، تهران، ایران
4- مرکز تحقیقات پیشگیری از بیماری­های دهان و دندان، دانشگاه علوم پزشکی بقیه­الله، تهران، ایران

چکیده
سابقه و هدف: از جمله روش­های مؤثر برای مهندسی پروتئین، به­ویژه برای بهبود قابلیت­های سویه­های صنعتی، روش ژنوم شافلینگ است. این مطالعه منطبق بر تکنیک­های مهندسی بیوکاتالیستی و بر اساس روش های DNA شافلینگ انجام شده است.
مواد و روش­ها: سویۀ وحشی سودوموناس آئروژینوزا به­شماره دسترسی JQ917006.1 تهیه گردید. سویه­های جهش یافته به­روش DES و سازگاری با غلظت دیازینون بررسی شدند. پس از آماده سازی پروتوپلاست، برزدن ژنوم انجام شد که از کتابخانۀ جهش یافته حاصل شده بود. پروتوپلاست­های الحاقی از نظر فعالیت بررسی شدند.
یافته­ها: فعالیت مربوط به سویه­های IR1.G1، IR1.D8، IR1.D4 و IR1.D5 به­ترتیب عبارتند از ۲۳۴/۰ U/ml، ۱/۰  U/ml، ۰۹۸/۰ U/ml و ۰۶۶/۰ U/ml و سویه­های IRL1.F2 و IRL1.F3 و IRL1.F1 به­ترتیب دارای فعالیت mg/L ۵۴۱/۰، mg/L ۵۲۳/۰ و mg/L ۵۰۹/۰ هستند.
نتیجه­ گیری: نتایج حاصل از ارزیابی نسل اول ژنوم شافلینگ (دور اول فیوژن پروتوپلاست) نشان داد که سویه­های برخورده (شافل شده) که قادر به رشد در مجاورت توکسین (۳۰۰۰ میلی­لیتر در لیتر غلظت دیازینون) بودند، فعالیت بهتری نسبت­به سویه­های جهش یافته با استفاده از هر دو روش (گرادیان غلظت سم و روش DES) را از خود نشان دادند.
واژه­ های کلیدی: ژنوم شافلینگ، سویه­های بهبود یافته، مهندسی پروتئین، دیازینون

 
مقدمه
تاریخچۀ استفاده از آفت­کش­های ارگانو فسفاته برای مصارف کشاورزی به دهه­های قبل باز می­گردد. تعدادی از ترکیب­های ارگانوفسفره شامل مالاتیون، دیکلرووس و، پاراتیون کلروپیریفوس هستند. این ترکیب­ها، استیل کولین استراز را که یک آنزیم حیاتی در هیدرولیز استیل کولین عصبی است را مورد هدف قرار داده و منجر به غیرفعال شدن استیل کولین استراز و در نتیجه باعث سمیت می­شوند (1). بر این اساس استفاده از این ترکیب­ها نگرانی­های سلامتی بسیاری را نسبت­به انسان و سایر موجودات زنده ایجاد کرده است. به­منظور غلبه­بر این مشکل، تلاش­های زیادی صورت گرفته و روش­های متفاوتی برای از بین بردن آلودگی ناشی از استفاده از این ترکیب­ها بکار گرفته شده­اند. روش­هایی مانند روش­های فیزیکی، شیمیایی و بیولوژیکی می­توانند به­عنوان استراتژی­های آلودگی­زدایی در نظر گرفته شوند (2). تجزیه زیستی به­عنوان یک روش برجسته به­علت برخی از ویژگی­های مهم مانند اثر سریع، سازگار با محیط­زیست، امن و تولید محصولات با سمیت کم­تر شناخته می­شود (3).
مطالعه­ های قبلی ثابت کرده­اند که برخی از میکروارگانیسم-ها قادر به تخریب ترکیب­های سمی خاصی هستند (4). چندین باکتری جدا شده از جمله گونه­های فلاووباکتریوم (Flavobacterium) و سودوموناس­دیمینوتا ام­جی (Pseudomonas diminuta MG) نشان داده­اند که قابلیت­های قابل توجهی برای هیدرولیز کردن ترکیب­های ارگانو فسفره دارند (5،6). گونه­های سودوموناس به­عنوان یک نامزد برجسته برای تجزیه زیست محیطی ترکیب­های ارگانوفسفره محسوب می­شود و برای سم­زدایی پساب­های آلوده و خاک­های کشاورزی استفاده می­شود (7).
علیرغم مزایای متعدد استفاده از سویه­های باکتریایی در فرآیند تجزیه زیستی، برخی از جنبه­های کاربردی این سویه­ها باعث می­شود تا از استفادۀ مکرر آن­ها جلوگیری شود. یکی از عوامل محدود کننده در دسترس بودن سوبسترا است. آنزیم­های سیتوپلاسمی این باکتری­ها مسئول فعالیت­های زیستی آن­ها هستند که دسترسی سوبسترا به آن­ها را محدود است. از سوی دیگر، نیاز به زمان بیش­تری دارند تا روی سوبسترا عمل کنند، بنابراین کیفیت کارایی آن­ها کاهش می­یابد (3).
ژنوم شافلینگ به­طور گسترده­ای برای افزایش تولید متابولیت­ها توسط سویه­های باکتریایی، بهبود جذب سوبسترا و هم­چنین افزایش قدرت سویه استفاده می­شود. این تکنیک ترکیبی از مزایای کراسینگ اور والدینی است که با بر زدن DNA و بازسازی کامل ژنوم همراه است که به­طور معمول با ترکیب (فیوژن) پروتوپلاست انجام می­شود که پروسۀ نوترکیبی را افزایش می­دهد. روش برزدن ژنوم در ابتدا توسط Stemmer و همکارانش در سال ۲۰۰۲ ارائه شد که برای بهبود تولید تیلوزین (Tylosin) توسط استرپتومایسس فرادیه (Streptomyces fradiae) مورد استفاده قرار گرفت. امروزه در بسیاری از آزمایش ها برای افزایش تولید متابولیت ها توسط سویه های باکتریایی، بهبود جذب سوبسترا و افزایش تحمل سویه استفاده می­شود. برزدن ژنوم یک نقطه عطف در تکنولوژی بهبود سویه­ها و مهندسی متابولیک است (8).
در این مطالعه، با استفاده از روش بر زدن ژنوم، تلاش برای بهبود ویژگی های سودوموناس آئروژینوزا (Pseudomonas aeruginosa) به منظور تجزیۀ دیازینون انجام شد. مقاومت در مقابل سمیت سموم ارگانوفسفره و هم­چنین افزایش فعالیت سلول از اهداف این مطالعه هستند. هدف اصلی به­دست آوردن سویۀ جهش یافته ای است که می­تواند در غلظت­های بالای دیازینون رشد کند و از سوی دیگر نیز دیازینون را در مدت زمان کوتاهی تجزیه کند.
روش کار                    
سویه­های باکتریایی
سویۀ وحشی سودوموناس آئروژینوزا به شماره مجموعه JQ917006.1 از فاضلاب­های صنعتی (پساب­های کارخانه­های تولید آفت­کش­ها و خاک آلوده آن­ها) در ایران جدا شده است.
مواد شیمیایی و حلال­ها
دیازینون (خلوص ٪۵/۹۹) از Sigma-Aldrich خریداری شد. سایر مواد شیمیایی و حلال­ها نیز از Merck آلمان تهیه شد.
آزمون تحمل سویه­های بومی در برابر دیازینون
در ابتدا سویۀ IRLM.1 جدا شده از سودوموناس آئروژینوزا در محیط کشت MSM حاوی %2 گلوکز، mg/L50 CaCl2.H2O، g/L5/0 (NH4)2SO4، g/L2/0 KCL، g/L1/0 NaCl بدون حضور دیازینون و در دمای ۳۷ درجه سانتی­گراد انکوبه شد تا OD600 به ۵/۰ برسد. سوسپانسیون باکتری سانتریفیوژ شده (با سرعت ۷۰۰۰ دور در دقیقه در مدت ۵ دقیقه) و سپس چندین بار با محیط MSG بدون گلوکز شستشو داده شدند. در مرحلۀ بعد، رسوب باکتریایی به محیط MSM آگار حاوی g/L5/1 agar، mg/L50 CaCl2.H2O، g/L5/0 (NH4)2SO4، g/L2/0 KCL، g/L1/0 NaCl و محیط بدون گلوکز، با ۱۰۰۰ تا ۳۰۰۰ میلی گرم در لیتر دیازینون اضافه شد و سپس به­مدت ۷۲ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی­گراد انکوبه شد.
برزدن ژنوم از دو مسیر انجام می­شود: ۱. سازگاری شیمیایی (سویۀ IRLM1.G) ۲. مادۀ القاء کنندۀ جهش دی اتیل سولفات (DES) (سویۀ IRLM1.D).
ایجاد کتابخانه جهش یافته (IRLM1.G) از طریق سازگاری شیمیایی
جمعیت اول توسط سازگاری شیمیایی به­دست آمد که شامل افزایش تدریجی مقدار دیازینون در ۱۲۰۰ ساعت بود. این امر را می­توان به این شیوه توضیح داد که پس از تأیید مقاومت سویه­های مادری، در معرض غلظت­های بالاتر دیازینون (۲۵۰۰-۳۰۰۰ میلی­گرم در لیتر) در MSM آگار قرار گرفتند. سپس کشت­ها به­مدت ۷۲ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی­گراد انکوبه شدند و در محلی تاریک نگهداری شدند تا از تجزیۀ نوری دیازینون جلوگیری شود.
ایجاد سویه­های جهش یافته (IRLM1.D) توسط  DES
سویه­های بومی در محیط MSM کشت داده شد و در دمای ۳۷ درجه سانتی­گراد انکوبه گردیده تا OD600 به ۵/۰ برسد. محیط کشت با ٪۵/۰، ٪۱، ٪۵/۱، ٪۲ ،٪۵/۲ و در نهایت ٪۳ DES (Sigma Aldrich) تیمار شدند و سپس به­مدت ۷۲ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی­گراد به­مدت ۳۵ دقیقه انکوبه شدند. سوسپانسیون باکتریایی سانتریفیوژ شده (۷۰۰۰ دور در دقیقه به­مدت ۵ دقیقه) و سپس با PBS شسته شد و در نهایت در محیط LB agar کشت داده شد.
غربالگری بر اساس رشد در حضور monocrotophos  و تجزیه زیستی دیازینون در محیط مایع
کتابخانه جهش یافتۀ به­دست آمده بر روی LB agar کشت داده شده و در ۴۸ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی­گراد انکوبه شد. سپس لایه نازک %۷/۰ آگاروز حاوی ۵۰ میلی­مولار بافر فسفات سیترات و ۵/۵ میلی­مولار monocrotophos  به محیط اضافه شد و در دمای ۳۷ درجه سانتی­گراد به­مدت ۱ ساعت انکوبه گردید. کلنی ها بر اساس بزرگی میزان هاله انتخاب شدند.
کلنی­های انتخاب شده در محیط MSM حاوی دیازینون (۲۰۰۰، ۲۵۰۰ و ۳۰۰۰ میلی­گرم در لیتر) تلقیح شدند. 246OD در ۰، ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت با استفاده از نانودراپ، اندازه­گیری شد. همان­طور که پیش­تر ذکر شد، تمام آزمایش­های مربوط به دیازینون در شرایط تاریک به­علت اثرهای نور بر روی دیازینون انجام شد.
آماده­سازی پروتوپلاست و تیمار غیرفعال سازی
پروتوپلاست­ها براساس روش Cocconcelli و همکاران با اعمال تغییرهایی انجام شد. سلول­های باکتریایی به­صورت کشت شبانه در دمای ۳۷ درجه سانتی­گراد کشت داده شدند و سپس با استفاده از سانتریفیوژ با سرعت ۷۰۰۰ دور در دقیقه برای ۵ دقیقه سلول­ها رسوب داده شدند. سلول­های باکتریایی در ۱۰ میلی­لیتر بافر پروتوپلاست (PB) حاوی ۱۰ میلی­مولار Tris-Hcl، ۲۰ میلی­مولار CaCl2 و ۵/۰ مولار سوکروز و ۱ میلی­گرم در میلی­لیتر لیزوزیم و در دمای ۶۰ درجه سانتی­گراد برای ۲ ساعت انکوبه شده تا غیرفعال شوند. تشکیل پروتوپلاست با استفاده از میکروسکوپ نوری مشاهده شد.
برزدن ژنوم
اولین جمعیت مورد استفاده برای برزدن ژنوم، کتابخانۀ جهش یافته­ای بود که با افزایش سازگاری با غلظت دیازینون و عامل DES به­دست آمد. پروتوپلاست­های غیرفعال شده در نسبت ۱:۱ مخلوط و سپس سانتریفوژ شده و دوباره به­نسبت ۱:۹ درPEG ۶۰۰۰  (%۶۰) و PB حل شده و ۳۰ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتی­گراد انکوبه شدند. پروتوپلاست­های الحاقی در ۵ میلی­لیتر PB و به­مدت ۲۰ دقیقه در دمای ۲۵ درجه سانتی­گراد سانتریفوژ گردیدند. سپس در محیط احیاء کننده (۲۰ میلی­مولار کلرید منیزیم، ۵/۰ میلی­مولار ساکارز و %۵/۱۰ BSA) به­مدت ۱۸ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی­گراد قرار داده شدند
روش­های آنالیزی              
غربالگری براساس رشد در حضور monocrotophos انجام شد و پروتوپلاست­های الحاقی انتخاب شدند. هم­چنین، تجزیه زیستی دیازینون و مقاومت در برابر دیازینون براساس آنچه پیش­تر شرح داده شد، مورد بررسی قرار گرفتند.
نتایج
ایجاد جمعیت سویه­های اولیه برای برزدن ژنوم
اولین جمعیت کتابخانۀ جهش یافتۀ سازگار با افزایش غلظت دیازینون از ۱۰۰۰ تا ۳۳۰۰ میلی­گرم در میلی­لیتر در ۱۲۰۰ ساعت به­دست آمد. سویه­های جهش یافته (IRLM1.G) قادر به رشد در غلظت ۳۲۵۰ میلی­گرم در میلی­لیتر دیازینون بودند در حالی­که سویۀ وحشی به­سختی در ۲۹۰۰ میلی­گرم در میلی­لیتر رشد کرد. نتایج در شکل ۱ نشان داده شده است.
 
 
جدول ۱- رشد جمعیت اول سویه­های جهش یافته در غلظت­های مختلف دیازینون
زمان نمونه غلظت دیازینون
(mg/L)  
۷۲ ساعت ۴۸ ساعت ۲۴ ساعت
+ + + IRLM1.G ۲۶۰۰-۱۰۰۰
+ + + IRLM1
+ + + IRLM1.G ۲۷۰۰
+ + - IRLM1
+ + + IRLM1.G ۲۸۰۰
+ - - IRLM1
+ + + IRLM1.G ۲۹۰۰
+ + - IRLM1
+ + + IRLM1.G ۲۹۵۰
- - - IRLM1
+ + + IRLM1.G ۳۰۰۰
- - - IRLM1
+ + + IRLM1.G ۳۰۵۰
- - - IRLM1
+ + + IRLM1.G ۳۱۰۰
-- - - IRLM1
+ + + IRLM1.G ۳۱۵۰
- - - IRLM1
+ + + IRLM1.G ۳۲۰۰
- - - IRLM1
+ + - IRLM1.G ۳۲۵۰
- - - IRLM1
- - - IRLM1.G ۳۳۰۰
- - - IRLM1
 
 
جمعیت دوم سویه­های جهش یافته (IRLM1.D) با تیمار DES به­دست آمد. تعداد کلنی­های موجود در MSM آگار حاوی دیازینون از ۵/۰ تا ۳ درصد تیمار DES کاهش یافت. رنگدانه سبز که مشخصه سودوموناس است، در میزان %۲ و %۵/۲ از DES تولید نمی­شود. سویه­های جهش یافته با توجه­به مقدار هاله در LB آگار حاوی monocrotophos و سرعت تجزیۀ زیستی دیازینون انتخاب شدند. بنابراین، ۸ سویۀ جهش یافته برای برزدن ژنوم آماده شدند.
براساس نتایج جذب نوری به­دست آمده، سویه­های IRLM1.D4 و IRLM1.D8 نتایج رضایت­بخشی نسبت­به سویه­های دیگر را نشان می­دهد. بنابراین، سویۀ IRLM1.D8 به­عنوان یکی از سویه­های والد برای برزدن ژنوم در نظر گرفته شد.
 
 
 

شکل 1- جذب نوری و ارزیابی تجزیۀ زیستی دیازینون (۲۰۰۰ میلی­گرم/میلی­لیتر دیازینون) با استفاده از سویه­های بهبود یافته روند جهش­زایی DES

شکل ۲- جذب نوری و ارزیابی تجزیه زیستی دیازینون (۳۰۰۰ میلی­گرم/لیتر دیازینون) با استفاده از سویه­های بهبود یافته روند جهش­زایی DES
شکل ۳- مقایسه فعالیت کل سلول با سویه­های بهبود یافته با DES در ۲۰۰۰ و ۳۰۰۰ میلی­گرم در لیتر دیازینون.
 
 
برزدن ژنوم و غربالگری
پروتوپلاست­های ایجاد شده توسط میکروسکوپ، پس از شکستن دیواره سلولی با لیزوزیم مشاهده شدند. سویه­های بر خورده با توجه­به مقدار هاله روی LB آگار با monocrotophos انتخاب شدند. ۱۲ سویۀ بر خورده به روش تحلیلی انتخاب شدند.
رشد باکتری و تجزیه زیستی دیازینون در MSM
تجزیه زیستی دیازینون در MSM حاوی دیازینون با استفاده از چک کردن OD246 و توانایی رشد سویه­های بر خورده در محیط MSM آگار حاوی دیازینون مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که اختلاف معنی­داری (۰۵/۰<p) در میزان تجزیه بیولوژیکی سویه­های بر خورده نسبت­به سویه­های والد (IRLM1.G و IRLM1.D) و هم­چنین سویه­های کنترل در محیط MSM حاوی دیازینون (شکل ۳) وجود دارد.
نتایج حاصل از رشد در آگار MSM حاوی دیازینون (۳۰۰۰، ۴۰۰۰ و ۵۰۰۰ میلی­گرم در لیتر) نشان داد که تنها یک سویۀ بر خورده (IRLM1.F3) قادر به رشد در ۳۰۰۰ میلی­گرم/لیتر دیازینون بود، اما تنها یکی از آن­ها توانست در ۴۰۰۰ و ۵۰۰۰ میلی­گرم در لیتر دیازینون رشد کند. در مقابل، سویۀ بومی (IRLM1) تغییرهای جزئی در OD246 را نسبت­به نمونه غیر تلقیح شده نشان داد.
بحث
تیمار زیستی ترکیب­های ارگانوفسفره از خاک و آب سطحی یک وظیفه اساسی بشمار می­رود. فلاووباکتریوم با شماره دسترسی ATCC 27551، اولین باکتری تجزیه کنندۀ ترکیب­های ارگانوفسفره، شناسایی و از خاک فیلیپین جدا شده است. تاکنون باکتری­های دیگری نیز کشف شده­اند که می­توانند از ترکیب­های ارگانوفسفره به­عنوان تنها منبع کربن، نیتروژن و فسفر استفاده کنند.
در مطالعه­های مختلف، سویه­های تجزیه کنندۀ ترکیب­های ارگانوفسفره برای از بین بردن آلودگی­های محیط زیست معرفی شده­اند. به­منظور حذف این ترکیب­ها از فاضلاب صنعتی، باکتری­های تخریب کننده باید قادر به رشد در غلظت
بالای ترکیب­های ارگانوفسفره باشند تا قادر باشند این ترکیب­ها را تجزیه کنند. سویۀ وحشی در مطالعۀ حاضر از خاک و پساب کارخانجات جدا شده است. در حالی­که در مطالعه­ای دیگر، باکتری­های تجزیه کننده از خاک جدا شده بودند. این امر نقطه­ای قوی در این تحقیق است که سویۀ وحشی ما قادر است تا در غلظت­های بالای دیازینون (تا ۲۹۰۰ میلی­گرم در لیتر) رشد کند. علاوه­بر این، فعالیت این سویه وحشی با استفاده از روش برزدن ژنوم بهبود یافته است.
 
 
 
 
 
 
 
شکل ۴- ارزیابی تخریب زیستی دیازینون (۳۰۰۰ میلی­گرم/لیتر دیازینون) با استفاده از سویه­های بر خورده.
 
 
 
 
شکل ۵- ارزیابی فعالیت کل سلول با استفاده از سویۀ بر خورده در ۳۰۰۰ میلی­گرم در لیتر دیازینون.
 
 
.
 
جدول ۲- رشد سویه­های برخورده در MSM آگار حاوی دیازینون (در غلظت­های مختلف) به­عنوان تنها منبع کربن، فسفر و انرژی.
۵۰۰۰ mg/L ۴۰۰۰ mg/L ۳۰۰۰ mg/L بیش از  mg/L ۲۵۰۰ نمونه
- - + + IRLM1.G
- - - + IRLM1.D
- - - + IRLM1
- - + + IRLM1.F1
+ + + + IRLM1.F2
- - + + IRLM1.F3
- - + + IRLM1.F4
- - + + IRLM1.F5
- - + + IRLM1.F6
- - + + IRLM1.F7
- - + + IRLM1.F8
- - + + IRLM1.F9
- - + + IRLM1.F10
- - + + IRLM1.F11
- - + + IRLM1.F12
 
 
 
از آنجایی­که این مطالعه هدف، بهبود بخشیدن به عملکرد باکتری­ها و فراهم کردن توانایی رشد آن­ها در غلظت­های بالایی از ترکیب­های ارگانوفسفره است، سازگاری با این ترکیب­ها و جهش­زایی DES در این مطالعه به­کار برده شده است. در مقایسه با سایر مطالعه­های (2002) Patnaik  و همکاران به­منظور بهبود تحمل pH و تولید اسید در باکتری، تطبیق pH و جهش­زایی نیتروزوگوانیدین (NTG) استفاده شد (9).
برخی از تغییرهایی مانند افزایش تحمل به ترکیب­های ارگانوفسفره و توانایی رشد در غلظت­های بالای این ترکیب­ها، نیازمند تغییرهای زیادی در ژنوم هستند که قابل پیش­بینی نیستند. پس از سازگاری با ترکیب­های ارگانوفسفره، سویۀ IRLM1.G قادر به تحمل و رشد در mg/L ۳۲۵۰  دیازینون (جدول ۱) بود. از این امر می­توان نتیجه گرفت که افزایش تدریجی غلظت دیازینون ممکن است باعث جهش شود که منجر به انطباق با شرایط جدید می­شود.
از سوی دیگر، در بسیاری از مطالعه­ها، جهش­زایی DES برای آماده­سازی سویه­ها مورد استفاده قرار گرفته است. هم­چنین ما مشاهده کردیم که جهش­زایی DES برای به­دست آوردن سویۀ IRLM1.D8 به­عنوان یک سویۀ بهبود یافته کارآمد است. به­طوری­که فعالیت کل سلول توسط IRLM1.D8 تا ۵ و ۷/۱۶ برابر بیش­تر از سویۀ وحشی در غلظت­های ۲۰۰۰ و ۳۰۰۰ میلی­گرم در لیتر دیازینون بوده است. بسیاری از گونه­های جهش یافته با DES (IRLM1.F3,4,6,7) در غلظت­های ۲۰۰۰ و ۳۰۰۰ میلی­گرم در لیتر دیازینون نشان دادند که توانایی بیش­تری در تجزیه پیدا می­کنند (شکل ۳). بنابراین، جهش­های ناشی از ژن­هایی که در تجزیه ترکیب­های ارگانوفسفره دخالت دارند، حتی فعالیت تجزیه­کنندگی را حتی در غلظت­های بالای دیازینون مختل نمی­کنند.
پس از یک دور برزدن ژنوم و غربالگری، تمام سویه­ها، فعالیت کل سلول را در ۳۰۰۰ میلی­گرم/لیتر دیازینون نشان دادند، به­طوری­که فعالیت کل سلول­های IRLM1.F2 و IRLM.F3 به­ترتیب به میزان U/ml ۵4/۰ و U/ml ۵2/۰ بود. این فعالیت ۶۰ و ۷/۵۷ برابر بیش­تر از سویۀ وحشی و ۵/۳ و ۴/۳ برابر بیش­تر از سویۀ ابتدایی است. در مطالعه­ای توسط(2013)Wang Ch  و همکاران پس از ۶ دور برزدن ژنوم، ۲/۴ برابر بهبود برای پنی­سیلیوم سیترینوم و در مطالعۀ (2002) Patnaik R  و همکاران پس از ۵ دور برزدن ژنوم ۳ برابر بهبودی برای لاکتوباسیلوس گزارش شد (9). (2014) Zhang Y. F و همکاران هم­چنین بهبود ۴/۲ برابری لاکتوکوکوس لاکتیس را پس از ۴ دور به­دست آوردند (10). یکی از تفاوت­های عمیق بین مطالعۀ حاضر و سایر مطالعه­ها، تعداد دورهای برزدن ژنوم است که تنها در یک دور نسبت­به چندین مرحله از بر زدن ژنوم در مطالعه­های دیگر نتایج خوبی به­دست آمد.
با این وجود، انتخاب روش نقش مهمی در به­دست آوردن نتیجه نهایی ایفا می­کند. در برخی از روش­ها، نتایج نشان می­دهند که تفاوتی بین نوع سویۀ وحشی و سویۀ بر خورده وجود ندارد و بنابراین فعالیت آنزیم ثابت باقی می­ماند یا به میزان بسیار کمی افزایش می­یابد.
تاکنون روش­های دیگری مانند برزدن DNA و ایجاد جهش با PCR برای تولید سویه­های نوترکیب توسط چندین محقق استفاده شده است، اما استفاده از میکروارگانیسم­ها در بهبود تجزیۀ زیستی دارای مزایای خاصی از قبیل پایداری، سازگاری با محیط زیست، تولید مقرون­به صرفه و آسان نیز است.
چندین باکتری با توالی­های کمابیش یکسان opd در سراسر جهان شناسایی شده اند. ژن مسئول تجزیۀ دیازینون و دیگر ارگانوفسفره­ها، opd است. ژن opd در ژنوم چندین باکتری وجود دارد.
اگر چه تمام سویه های الحاقی فعالیت بیشتری را در مقایسه با نوع وحشی نشان دادند، اما تنها IRLM1.F2 قادر به رشد در محیط کشت حاوی بیش از ۳۰۰۰ میلی-گرم در لیتر غلظت دیازینون بود. سویه­های دیگر با وجود افزایش فعالیت، قادر نبودند در غلظت­های بالاتر دیازینون رشد کنند. با این وجود، وقوع هم­زمان فعالیت افزایش یافته و توانایی رشد در غلظت­های بالا دیازینون کم­تر احتمال دارد. بنابراین، سویۀ IRLM1.F2 را با افزایش فعالیت (۷/۵۷ برابر بیش­تر از سویه­های نوع وحشی) و توانایی رشد در غلظت­های بالای دیازینون (تا ۵۰۰۰ میلی­گرم در لیتر) پس از یک دور برزدن ژنوم، با موفقیت به­دست آوردیم.
نتیجه­گیری
انتخاب روش باید مطابق با هدف مطالعه باشد. برزدن ژنوم به­راحتی و به­سرعت می تواند ویژگی­های میکروارگانیسم­ها را به­منظور استفاده در کاربردهای تجاری مورد استفاده قرار دهد. براساس نتایج ما، سویۀ IRLM1.F2 می­تواند به­عنوان سویۀ نامزد برای تولید صنعتی برای اهداف بهبود زیستی به­ویژه در تصفیه فاضلاب درنظر گرفته می­شود. هم­چنین این سویه می­تواند برای شناسایی جهش­های مسئول بهبود فعالیت و تحمل به غلظت­های بالای سم، مورد استفاده قرار گیرد.
سپاسگزاری
این تحقیق زیر نظر و با حمایت مالی در دانشگاه علوم پزشکی بقیه اللهُ بخش بیوتکنولوژی به انجام رسیده است که بدین­وسیله از کلیه مسئولین مرکز مربوطه تشکر و قدردانی می­شود.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
منابع
1- Narang U, Narang P, Gupta O. Organophosphorus poisoning: A social calamity. Journal of Mahatma Gandhi Institute of Medical Sciences. 2015;20(1):46.
2- Gianessi LP. The increasing importance of herbicides in worldwide crop production. Pest management science. 2013;69(10):1099-105.
3- Shimazu M, Nguyen A, Mulchandani A, Chen W. Cell Surface Display of Organophosphorus Hydrolase in Pseudomonasputida Using an IceNucleation Protein Anchor. Biotechnology progress. 2003;19(5):1612-4.
4- Diaz Casas AZ. Bioremediation of the organophosphate methyl parathion using genetically engineered and native organisms: Texas A&M University; 2005.
5- Serdar CM, Murdock DC, Rohde MF. Parathion hydrolase gene from Pseudomonas diminuta MG: subcloning, complete nucleotide sequence, and expression of the mature portion of the enzyme in Escherichia coli. Bio/technology. 1989;7(11):1151.
6- Mulbry WW, Karns JS. Parathion hydrolase specified by the Flavobacterium opd gene: relationship between the gene and protein. Journal of Bacteriology. 1989;171(12):6740-6.
7- Latifi AM, Karami A, Khodi S. Efficient surface display of diisopropylfluorophosphatase (DFPase) in E. coli for biodegradation of toxic organophosphorus compounds (DFP and Cp). Applied biochemistry and biotechnology. 36-624: (3) 177. 2015
8- Leja K, Myszka K, Czaczyk K. Genome shuffling: a method to improve biotechnological processes. BioTechnologia Journal of Biotechnology Computational Biology and Bionanotechnology. 2011;92(4).
9- Patnaik R, Louie S, Gavrilovic V, Perry K, Stemmer WP, Ryan CM, et al. Genome shuffling of Lactobacillus for improved acid tolerance. Nature biotechnology. 2002;20(7):707.
10- Zhang Y, Liu S, Du Y, Feng W, Liu J, Qiao J. Genome shuffling of Lactococcus lactis subspecies lactis YF11 for improving nisin Z production and comparative analysis. Journal of dairy science. 2014;97(5):2528-41.

 
نوع مطالعه: مقاله پژوهشی | موضوع مقاله: سلولی و مولکولی
دریافت: 1399/4/7 | پذیرش: 1399/4/7 | انتشار: 1399/4/7

ارسال نظر درباره این مقاله : نام کاربری یا پست الکترونیک شما:
CAPTCHA

بازنشر اطلاعات
Creative Commons License این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است.

کلیه حقوق این وب سایت متعلق به مجله تازه های بیوتکنولوژی سلولی - مولکولی می باشد.

طراحی و برنامه نویسی : یکتاوب افزار شرق

© 2022 CC BY-NC 4.0 | New Cellular and Molecular Biotechnology Journal

Designed & Developed by : Yektaweb