دوره 11، شماره 41 - ( 9-1399 )
جلد 11 شماره 41 صفحات 46-29 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Saleknezhad M. Increasing the stability of keratin protein solubility in aqueous solutions using the chemical structure modification by alkylation and sulfitolysis methods. NCMBJ 2020; 11 (41) :29-46
URL: http://ncmbjpiau.ir/article-1-1333-fa.html
URL: http://ncmbjpiau.ir/article-1-1333-fa.html
سالک‌نژاد مریم، رباط‌جزی سید مرتضی، زین الدینی مهدی. افزایش پایداری کراتین استخراج شده از پر در محلولهای آبی با استفاده از روش‌های اصلاح ساختار شیمیایی. مجله تازه هاي بيوتكنولوژي سلولي و مولكولي. 1399; 11 (41) :29-46
افزایش پایداری کراتین استخراج شده از پر در محلولهای آبی با استفاده از روش‌های اصلاح ساختار شیمیایی
گروه بیوتکنولوژی سلولی مولکولی، دانشکده شیمی و مهندسی شیمی، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، تهران.
واژههای کلیدی: کراتین پر مرغ، اصلاح شیمیایی، پایدارسازی، آلکیلاسیون پروتئین، سولفیدولیز پروتئین.، IAU science.
متن کامل [PDF 6438 kb]
(1467 دریافت)
| چکیده (HTML) (2895 مشاهده)
جدول3: سطحبندی و عوامل مؤثر در واکنش اصلاح شیمیایی کراتین هیدرولیز شده بهروش سولفیدولیز
نمودار 1: مقایسه پایداری انجام شده کراتین اصلاح شده بهروش الکیلاسیون و سولفیدولیز با کراتین هیدرولیز شده در pH های متفاوت
نمودار 2: بررسی مدت زمان پایداری کراتین اصلاح شده بهروش آلکیلاسیون و کراتین اصلاح شده بهروش سولفیدولیز در مقایسه با کراتین هیدولیز شده از طریق اندازهگیری مقدار کدورت ایجاد شده و خواندن جذب نمونه‌ها در 540 نانومتر در طی 30 روز و نگهداری در دمای 4 درجه سانتیگراد
نمودار3: نتایج DLS کراتین اصلاح شده بهروش الکیلاسیون، سولفیدولیز و کراتین هیدولیز شده
نمودار 4: نتایج آنالیز FTIR کراتین اصلاح شده بهروش آلکیلاسیون و سولفیدولیز در مقایسه با کراتین هیدولیز شده
شکل 1: ژل الکتروفورز 5/14 درصد انجام شده برای سه نمونه کراتین اصلاح شده بهروش آلکیلاسیون (ج)، کراتین اصلاح شده بهروش سولفیدولیز (الف) و کراتین هیدولیز شده (ب)
منابع
متن کامل: (1667 مشاهده)
افزایش پایداری حلالیت پروتئین کراتین در محلولهای
آبی با استفاده از اصلاح ساختار شیمیایی بهروش
آلکیلاسیون و سولفیدولیز
مریم سالک‌نژاد1، سید مرتضی رباط‌جزی*1، مهدی زینالدینی2
1. گروه مهندسی شیمی- بیوتکنولوژی دانشکده شیمی و مهندسی شیمی، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، تهران.
2. گروه بیوتکنولوژی سلولی مولکولی، دانشکده شیمی و مهندسی شیمی، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، تهران.
چکیده
سابقه و هدف: در دو دهه گذشته، پروتئینها و پپتیدها تبدیل به یک گروه مهم از داروها شده‌اند. با این حال، حساسیت به تخریب شیمیایی و فیزیکی از چالش‌های اصلی کاربردهای صنعتی و دارویی پروتئینها است. کمابیش90 درصد از وزن پرمرغ از ضایعات صنایع دام و طیور، کراتین است. این پروتئین نامحلول بوده و تمایل شدیدی به تجمع و رسوبدهی دارد.
مواد و روش‌ها: در این پژوهش کراتین از پر مرغ با محلول سدیم هیدروکسید 2/0 مولار استخراج شد و توسط آنزیم آلکالاز صنعتی (V/V) 8 درصد در دمای 55 درجه سانتیگراد بهمدت 5 ساعت در pH برابر 8 هیدرولیز شد. محلول کراتین بهدست آمده، توسط روش آلکیلاسیون و سولفیدولیز بهمنظور کاهش اگریگاسیون مورد اصلاح ساختار شیمیایی قرار گرفت. حلالیت کراتین، درجه اصلاح شیمیایی، درصد پایداری، مقدار مول تیول آزاد و همچنین DLS و FTIR نمونه‌ها بررسی شد.
یافته‌ها: نتایج نشان داد درجه اصلاح شیمیایی کراتین در روش آلکیلاسیون 72 درصد و در روش سولفیدولیز با 66 درصد بوده است. اصلاح شیمیایی کراتین هیدرولیز شده باعث کاهش اگریکاسیون در 3pH بهمیزان 65/288 درصد و 3/335 درصدی بهترتیب برای روش آلکیلاسیون و روش سولفیدولیز بهدست آمده‌است. بررسی پایداری و حفظ محتوی پروتئینی نشان داد، کراتین اصلاح شده بهروش آلکیلاسیون 9/81 درصد و کراتین اصلاح شده بهروش سولفیدولیز 3/86 درصد در طی 30 روز پایدار بوده‌است در صورتیکه کراتین هیدولیز شده بهعنوان شاهد تنها 8/9 درصد از محتوای پروتئینی خود را حفظ کرده و پایداری داشته‌است. نتیجه تست DLS نمونه محلول کراتین اصلاح شده با روش آلکیلاسیون در آب، دارای 476/0= PI و اندازه متوسط ذرات 3/157 نانومتر است، در نمونه کراتین اصلاح شده با روش سولفیدولیز در آب، مقدار 475/0=PI و اندازه متوسط ذرات 2/136 نانومتر تعیین گردید، که نسبتبه نمونه کراتین هیدرولیز شده با 552/0=PI و اندازه متوسط 3/990 نانومتر، یکنواخت‌تر و پراکنده‌تر بوده است.
نتیجه‌گیری: اصلاح شیمیایی انجام شده بر روی کراتین هیدولیز شده تغییری دائمی بوده و اتصال گروه‌های عاملی مورد انتظار باعث افزایش حلالیت کراتین در محیط‌های آبی و کاهش تجمع در pH اسیدی شده است. همچنین نتایج آنالیز FTIR اصلاح شیمیایی کراتین را تأیید کرد.
واژههای کلیدی: کراتین پر مرغ، اصلاح شیمیایی، پایدارسازی، آلکیلاسیون پروتئین، سولفیدولیز پروتئین.
آبی با استفاده از اصلاح ساختار شیمیایی بهروش
آلکیلاسیون و سولفیدولیز
مریم سالک‌نژاد1، سید مرتضی رباط‌جزی*1، مهدی زینالدینی2
1. گروه مهندسی شیمی- بیوتکنولوژی دانشکده شیمی و مهندسی شیمی، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، تهران.
2. گروه بیوتکنولوژی سلولی مولکولی، دانشکده شیمی و مهندسی شیمی، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، تهران.
سابقه و هدف: در دو دهه گذشته، پروتئینها و پپتیدها تبدیل به یک گروه مهم از داروها شده‌اند. با این حال، حساسیت به تخریب شیمیایی و فیزیکی از چالش‌های اصلی کاربردهای صنعتی و دارویی پروتئینها است. کمابیش90 درصد از وزن پرمرغ از ضایعات صنایع دام و طیور، کراتین است. این پروتئین نامحلول بوده و تمایل شدیدی به تجمع و رسوبدهی دارد.
مواد و روش‌ها: در این پژوهش کراتین از پر مرغ با محلول سدیم هیدروکسید 2/0 مولار استخراج شد و توسط آنزیم آلکالاز صنعتی (V/V) 8 درصد در دمای 55 درجه سانتیگراد بهمدت 5 ساعت در pH برابر 8 هیدرولیز شد. محلول کراتین بهدست آمده، توسط روش آلکیلاسیون و سولفیدولیز بهمنظور کاهش اگریگاسیون مورد اصلاح ساختار شیمیایی قرار گرفت. حلالیت کراتین، درجه اصلاح شیمیایی، درصد پایداری، مقدار مول تیول آزاد و همچنین DLS و FTIR نمونه‌ها بررسی شد.
یافته‌ها: نتایج نشان داد درجه اصلاح شیمیایی کراتین در روش آلکیلاسیون 72 درصد و در روش سولفیدولیز با 66 درصد بوده است. اصلاح شیمیایی کراتین هیدرولیز شده باعث کاهش اگریکاسیون در 3pH بهمیزان 65/288 درصد و 3/335 درصدی بهترتیب برای روش آلکیلاسیون و روش سولفیدولیز بهدست آمده‌است. بررسی پایداری و حفظ محتوی پروتئینی نشان داد، کراتین اصلاح شده بهروش آلکیلاسیون 9/81 درصد و کراتین اصلاح شده بهروش سولفیدولیز 3/86 درصد در طی 30 روز پایدار بوده‌است در صورتیکه کراتین هیدولیز شده بهعنوان شاهد تنها 8/9 درصد از محتوای پروتئینی خود را حفظ کرده و پایداری داشته‌است. نتیجه تست DLS نمونه محلول کراتین اصلاح شده با روش آلکیلاسیون در آب، دارای 476/0= PI و اندازه متوسط ذرات 3/157 نانومتر است، در نمونه کراتین اصلاح شده با روش سولفیدولیز در آب، مقدار 475/0=PI و اندازه متوسط ذرات 2/136 نانومتر تعیین گردید، که نسبتبه نمونه کراتین هیدرولیز شده با 552/0=PI و اندازه متوسط 3/990 نانومتر، یکنواخت‌تر و پراکنده‌تر بوده است.
نتیجه‌گیری: اصلاح شیمیایی انجام شده بر روی کراتین هیدولیز شده تغییری دائمی بوده و اتصال گروه‌های عاملی مورد انتظار باعث افزایش حلالیت کراتین در محیط‌های آبی و کاهش تجمع در pH اسیدی شده است. همچنین نتایج آنالیز FTIR اصلاح شیمیایی کراتین را تأیید کرد.
واژههای کلیدی: کراتین پر مرغ، اصلاح شیمیایی، پایدارسازی، آلکیلاسیون پروتئین، سولفیدولیز پروتئین.
مقدمه
جایگاه بیوتکنولوژی بهعنوان یک مبنای تحقیق و توسعه دارویی تعیین شده است و دارو‌های جدید مبتنی بر پروتئین در طول دهه‌های آینده بهسرعت در حال افزایش است (1). علاوهبر صنعت دارو و مباحث درمانی، پروتئینها در صنایع غذایی (2) آرایشی و بهداشتی (3) کاربرد گستردهای دارند،که پایداری و ثبات این پروتئینها جهت استفاده و نگهداری حائز اهمیت است (4) با این حال، حساسیت آنها به تخریب شیمیایی و فیزیکی چالش‌هایی برای دانشمندان برای شکل‌گیری داروها بهصورت پایدار به وجود آورده است (1). در حال حاضر علاقهبه تولید پروتئینها از ضایعات در حال رشد است، که علاوهبر ارزش افزوده بالا، باعث کاهش منافع محیط زیستی را نیز بهدنبال دارد (5). تحقیقات در خصوص تولید پروتئینها افزایش یافته است اما در این بین به کراتین موجود در پر مرغ توجه بسیار کمی شده است (6). سالانه 5/8 میلیون تن پر مرغ بهعنوان ضایعات کشتارگاهی در سراسر جهان تولید می‌شود (7)، پر کمابیش از 90 درصد پروتئین کراتین تشکیل شده است که می‌تواند در تهیه کرم‌های آرایشی، شامپو و مو استفاده شود (8). کراتین هیدرولیز شده، جزئی از پروتئین کراتین است که وزن مولکولی پایین‌تری دارد و دارای خواص فیزیکی مناسب‌تری جهت استفاده در فراورده‌های صنعتی است (9) در طی هیدرولیز شیمیایی، هر دو نوع پیوندهای کراتین (دیسولفید و پپتید) شکسته می‌شود (10) و ساختار کراتین هیدرولیز شده و ساختار پروتئین کراتین متفاوت است (11). یک خصوصیت مهم کراتین تعداد زیاد پیوندهای دی سولفیدی در مقایسه با سایر پروتئین‌های ساختاری است (12) در نتیجه بهعلت پهنای پیوند دیسولفیدی و مقدار زیاد اسید آمینه‌های هیدروفوبیک کراتین در حلال‌های قطبی مثل آب حل نمی‌شود (13)، لذا برای استفاده از کراتین در کاربردهای صنعتی نیاز به تهیه محلول پایدار کراتین است (14). بی‌ثباتی شیمیایی به تشکیل یا تخریب پیوندهای کووالانسی در مولکول پلی‌پپتید یا پروتئین مربوط می‌شود (15). این تغییرهای ساختار اولیه پروتئین را دگرگون ساخته و سطح بالایی از ساختار آن را تحت تأثیر قرار میدهد (16). ناپایداری‌های فیزیکی شامل تجمع، ته‌نشینی، چسبیدن به سطح و بازشدگی پروتئین است (17). ناپایداری‌های شیمیایی نظیر شکستگی پیوند دیسولفید، ممکن است منجر به ناپایداری‌های فیزیکی شود (18). کراتین استخراجی از پر، جرم مولکولی در حدود 10 کیلو دالتون دارد که بهعلت وجود مقدار زیاد سیستئین پلیمره می‌شود و جرم مولکولی در حدود 34 الی 40 کیلو دالتون را به‌وجود می‌آورد (6،19). پر مرغ کمابیش حاوی 7-6 درصد آمینو اسید‌های سیستین و متیونین است (20). برای افزایش حلالیت کراتین استخراج شده در حلال‌های آبی، رویکردهای مختلفی مطرح شده‌است که بیشتر آنها شامل ایجاد تغییرهای شیمیایی درکراتین هستند (21) از این تکنیک در صنایع داروسازی، غذا و خوراک و یا دیگر موارد صنعتی در سطوح پیچیده استفاده می‌شود (22). از جمله تکنیک‌های ویژه‌ای که در سال‌های اخیر برای کمک به تحقیق و بهره‌برداری از ساختار پروتئین توسعه داده شده‌است، ایجاد تغییرهای شیمیایی در ساختار پروتئین است (23). اصلاح شیمیایی پروتئین یک تکنیک حل مسئله در تحقیقات و فن‌آوری است (24). اصلاح شیمیایی می‌تواند بهطور طبیعی بدون دخالت نیز به مرور زمان انجام شود (25) بهطور کلی، این واکنش‌های اصلاحاتی بهطور عمده روی زنجیره‌های جانبی انجام می‌شود مانند اکسیداسیون، احیا، جایگزینی نوکلئوفیلی[1] و الکتروفیل[2]. پروتئینها بهطور عمده برای مطالعههای روابط ساختاری یا بهبود عملکرد و یا تولید محصول جدید، اصلاح می‌شوند (26). گروه‌های سولفیدریل، واکنشپذیرترین گروه جانبی هستند که بهطور معمول در پروتئینها یافت می‌شوند، بههمین علت در ابتدا، اصلاح شیمیایی بر روی این گروه اتفاق می‌افتد (27). آلکیلاسیون سیستئین از قدیمی‌ترین و مرسوم‌ترین روش‌های اصلاح شیمیایی است (28). در اصلاح شیمیایی سیستئین پس از کاهش بهطور کلی همه گروه‌های تیول بسته می‌شود (29) که در نتیجه باعث افزایش پایداری میگردد (30). لذا اکسیداسیون سیستئین موجود در کراتین می‌تواند منجر به تولید یک مشتق از کراتین پایدارتر و محلول در آب شود (31). سولفیدولیز یک روش خفیف برای باز کردن پیوندهای دیسولفیدی پروتئین است (32). که برش دیسولفیدها توسط یون‌های سولفیت منجر به تشکیل سولفونات می‌شود (33) بهطور کلی اصلاح شیمیایی پروتئینها اغلببه منظور بهبود خواص عملکردی مورد استفاده قرار گرفته است (34).
با توجهبه اینکه پر مرغ سر شار از کراتین است و حجم بالایی از ضایعات را به خود اختصاص داده است تولید محصول با ارزش افزوده بالا می‌تواند مهم واقع شود. پروتئین کراتین در آب نامحلول بوده و استفاده از آن را برای مصارف صنعتی و دارویی غیرممکن می‌سازد، لذا پایدارسازی کراتین در محیط‌های آبی بهعلت تجمع و از دست دادن محتوای پروتئینی بسیار پر اهمیت است، روش‌های متعددی جهت پایدارسازی وجود دارد که در این تحقیق اصلاح شیمیایی بهروش آلکیلاسیون و سولفیدولیز بر روی کراتین هیدولیز شده همراه با بهینهسازی انجام شد، تأیید گروه‌های عاملی موردنظر، افزایش حلالیت، افزایش مقاومت در برابر عوامل ناپایدار کننده و کاهش تجمع پروتئینی از مهم‌ترین ارزیابی‌های بررسی شده این پژوهش است.
مواد و روش‌ها
در این تحقیق پرسفید جوجه گوشتی ضایعات کشتارگاهی طیور از شرکت اتکا، 2- مرکاپتواتانول از سیگما، معرف المن از مرک، آنزیم آلکالاز از شرکت نووآنزیم دانمارک، یدواستیک اسید از شرکت مرک، سدیم سولفیت از مرک تهیه گردید. تمام مواد شیمیایی دیگری استفاده شده، با خلوص بالا از شرکت‌های مرک، سیگما-الدریچ خریداری شده است.
تهیه محلول کراتین هیدولیز شده
استخراج کراتین از پر مرغ توسط 25 میلیلیتر سود 2/0 مولار به ازای هر گرم پر در دمای 70 درجه سانتیگراد بهمدت 12 ساعت انجام شد. سپس کراتین استخراج شده توسط (V/V) 8 درصد آنزیم آلکالاز صنعتی به حجم محلول کراتین استخراجی در دمایی 55 درجه سانتیگراد بهمدت 5 ساعت در pH برابر 8 هیدرولیز شد، افت pH با سود 3/0 مولار جبران شد. سپس محلول کراتین هیدولیز شده در مقابل آب مقطر 24 ساعت دیالیز شد. درجه هیدرولیز توسط روش pH-stat (35) و سایز کراتین هیدورلیز شده توسط روش SDS-Page تعیین شد (36).
اصلاح شیمیایی محلول کراتین هیدولیز شده
در این پژوهش اصلاح شیمیایی بر روی کراتین هیدرولیز شده پر مرغ به دو روش شیمیایی به شرح زیر انجام و نتایج با یکدیگر مقایسه شد.
الف: اصلاح شیمیایی کراتین هیدولیز شده بهروش آلکیلاسیون
اصلاح شیمیایی بهروش آلکیلاسیون بر اساس روش crestfield انجام شد (37). عوامل تأثیرگذار شامل دما، نسبت غلظت یدواستیک اسید بهمقدار سیستئین موجود در کراتین، pH و زمان واکنش توسط نرمافزار تاگوچی(Qualitek 4) در 4 عامل و 3 سطح توسط 9 آزمایش بهینه سازی شد ( طبق جدول 1و2). بدینمنظور در هر آزمایش از 15 میلیلیتر محلول کراتین هیدولیز شده با غلظت معین در تمام آزمایشهایاستفاده شد. بهعلت حساسیت مواد استفاده شده، واکنش در تاریکی و زیر هود شیمیایی تا رسیدن به محلول کربوکسی متیل کراتین ادامه یافت. در مدت زمان انجام واکنش pH کنترل شد و افت آن توسط محلول سود 3 مولار جبران شد و محلول توسط همزن مغناطیسی یکنواخت گردید.
جایگاه بیوتکنولوژی بهعنوان یک مبنای تحقیق و توسعه دارویی تعیین شده است و دارو‌های جدید مبتنی بر پروتئین در طول دهه‌های آینده بهسرعت در حال افزایش است (1). علاوهبر صنعت دارو و مباحث درمانی، پروتئینها در صنایع غذایی (2) آرایشی و بهداشتی (3) کاربرد گستردهای دارند،که پایداری و ثبات این پروتئینها جهت استفاده و نگهداری حائز اهمیت است (4) با این حال، حساسیت آنها به تخریب شیمیایی و فیزیکی چالش‌هایی برای دانشمندان برای شکل‌گیری داروها بهصورت پایدار به وجود آورده است (1). در حال حاضر علاقهبه تولید پروتئینها از ضایعات در حال رشد است، که علاوهبر ارزش افزوده بالا، باعث کاهش منافع محیط زیستی را نیز بهدنبال دارد (5). تحقیقات در خصوص تولید پروتئینها افزایش یافته است اما در این بین به کراتین موجود در پر مرغ توجه بسیار کمی شده است (6). سالانه 5/8 میلیون تن پر مرغ بهعنوان ضایعات کشتارگاهی در سراسر جهان تولید می‌شود (7)، پر کمابیش از 90 درصد پروتئین کراتین تشکیل شده است که می‌تواند در تهیه کرم‌های آرایشی، شامپو و مو استفاده شود (8). کراتین هیدرولیز شده، جزئی از پروتئین کراتین است که وزن مولکولی پایین‌تری دارد و دارای خواص فیزیکی مناسب‌تری جهت استفاده در فراورده‌های صنعتی است (9) در طی هیدرولیز شیمیایی، هر دو نوع پیوندهای کراتین (دیسولفید و پپتید) شکسته می‌شود (10) و ساختار کراتین هیدرولیز شده و ساختار پروتئین کراتین متفاوت است (11). یک خصوصیت مهم کراتین تعداد زیاد پیوندهای دی سولفیدی در مقایسه با سایر پروتئین‌های ساختاری است (12) در نتیجه بهعلت پهنای پیوند دیسولفیدی و مقدار زیاد اسید آمینه‌های هیدروفوبیک کراتین در حلال‌های قطبی مثل آب حل نمی‌شود (13)، لذا برای استفاده از کراتین در کاربردهای صنعتی نیاز به تهیه محلول پایدار کراتین است (14). بی‌ثباتی شیمیایی به تشکیل یا تخریب پیوندهای کووالانسی در مولکول پلی‌پپتید یا پروتئین مربوط می‌شود (15). این تغییرهای ساختار اولیه پروتئین را دگرگون ساخته و سطح بالایی از ساختار آن را تحت تأثیر قرار میدهد (16). ناپایداری‌های فیزیکی شامل تجمع، ته‌نشینی، چسبیدن به سطح و بازشدگی پروتئین است (17). ناپایداری‌های شیمیایی نظیر شکستگی پیوند دیسولفید، ممکن است منجر به ناپایداری‌های فیزیکی شود (18). کراتین استخراجی از پر، جرم مولکولی در حدود 10 کیلو دالتون دارد که بهعلت وجود مقدار زیاد سیستئین پلیمره می‌شود و جرم مولکولی در حدود 34 الی 40 کیلو دالتون را به‌وجود می‌آورد (6،19). پر مرغ کمابیش حاوی 7-6 درصد آمینو اسید‌های سیستین و متیونین است (20). برای افزایش حلالیت کراتین استخراج شده در حلال‌های آبی، رویکردهای مختلفی مطرح شده‌است که بیشتر آنها شامل ایجاد تغییرهای شیمیایی درکراتین هستند (21) از این تکنیک در صنایع داروسازی، غذا و خوراک و یا دیگر موارد صنعتی در سطوح پیچیده استفاده می‌شود (22). از جمله تکنیک‌های ویژه‌ای که در سال‌های اخیر برای کمک به تحقیق و بهره‌برداری از ساختار پروتئین توسعه داده شده‌است، ایجاد تغییرهای شیمیایی در ساختار پروتئین است (23). اصلاح شیمیایی پروتئین یک تکنیک حل مسئله در تحقیقات و فن‌آوری است (24). اصلاح شیمیایی می‌تواند بهطور طبیعی بدون دخالت نیز به مرور زمان انجام شود (25) بهطور کلی، این واکنش‌های اصلاحاتی بهطور عمده روی زنجیره‌های جانبی انجام می‌شود مانند اکسیداسیون، احیا، جایگزینی نوکلئوفیلی[1] و الکتروفیل[2]. پروتئینها بهطور عمده برای مطالعههای روابط ساختاری یا بهبود عملکرد و یا تولید محصول جدید، اصلاح می‌شوند (26). گروه‌های سولفیدریل، واکنشپذیرترین گروه جانبی هستند که بهطور معمول در پروتئینها یافت می‌شوند، بههمین علت در ابتدا، اصلاح شیمیایی بر روی این گروه اتفاق می‌افتد (27). آلکیلاسیون سیستئین از قدیمی‌ترین و مرسوم‌ترین روش‌های اصلاح شیمیایی است (28). در اصلاح شیمیایی سیستئین پس از کاهش بهطور کلی همه گروه‌های تیول بسته می‌شود (29) که در نتیجه باعث افزایش پایداری میگردد (30). لذا اکسیداسیون سیستئین موجود در کراتین می‌تواند منجر به تولید یک مشتق از کراتین پایدارتر و محلول در آب شود (31). سولفیدولیز یک روش خفیف برای باز کردن پیوندهای دیسولفیدی پروتئین است (32). که برش دیسولفیدها توسط یون‌های سولفیت منجر به تشکیل سولفونات می‌شود (33) بهطور کلی اصلاح شیمیایی پروتئینها اغلببه منظور بهبود خواص عملکردی مورد استفاده قرار گرفته است (34).
با توجهبه اینکه پر مرغ سر شار از کراتین است و حجم بالایی از ضایعات را به خود اختصاص داده است تولید محصول با ارزش افزوده بالا می‌تواند مهم واقع شود. پروتئین کراتین در آب نامحلول بوده و استفاده از آن را برای مصارف صنعتی و دارویی غیرممکن می‌سازد، لذا پایدارسازی کراتین در محیط‌های آبی بهعلت تجمع و از دست دادن محتوای پروتئینی بسیار پر اهمیت است، روش‌های متعددی جهت پایدارسازی وجود دارد که در این تحقیق اصلاح شیمیایی بهروش آلکیلاسیون و سولفیدولیز بر روی کراتین هیدولیز شده همراه با بهینهسازی انجام شد، تأیید گروه‌های عاملی موردنظر، افزایش حلالیت، افزایش مقاومت در برابر عوامل ناپایدار کننده و کاهش تجمع پروتئینی از مهم‌ترین ارزیابی‌های بررسی شده این پژوهش است.
مواد و روش‌ها
در این تحقیق پرسفید جوجه گوشتی ضایعات کشتارگاهی طیور از شرکت اتکا، 2- مرکاپتواتانول از سیگما، معرف المن از مرک، آنزیم آلکالاز از شرکت نووآنزیم دانمارک، یدواستیک اسید از شرکت مرک، سدیم سولفیت از مرک تهیه گردید. تمام مواد شیمیایی دیگری استفاده شده، با خلوص بالا از شرکت‌های مرک، سیگما-الدریچ خریداری شده است.
تهیه محلول کراتین هیدولیز شده
استخراج کراتین از پر مرغ توسط 25 میلیلیتر سود 2/0 مولار به ازای هر گرم پر در دمای 70 درجه سانتیگراد بهمدت 12 ساعت انجام شد. سپس کراتین استخراج شده توسط (V/V) 8 درصد آنزیم آلکالاز صنعتی به حجم محلول کراتین استخراجی در دمایی 55 درجه سانتیگراد بهمدت 5 ساعت در pH برابر 8 هیدرولیز شد، افت pH با سود 3/0 مولار جبران شد. سپس محلول کراتین هیدولیز شده در مقابل آب مقطر 24 ساعت دیالیز شد. درجه هیدرولیز توسط روش pH-stat (35) و سایز کراتین هیدورلیز شده توسط روش SDS-Page تعیین شد (36).
اصلاح شیمیایی محلول کراتین هیدولیز شده
در این پژوهش اصلاح شیمیایی بر روی کراتین هیدرولیز شده پر مرغ به دو روش شیمیایی به شرح زیر انجام و نتایج با یکدیگر مقایسه شد.
الف: اصلاح شیمیایی کراتین هیدولیز شده بهروش آلکیلاسیون
اصلاح شیمیایی بهروش آلکیلاسیون بر اساس روش crestfield انجام شد (37). عوامل تأثیرگذار شامل دما، نسبت غلظت یدواستیک اسید بهمقدار سیستئین موجود در کراتین، pH و زمان واکنش توسط نرمافزار تاگوچی(Qualitek 4) در 4 عامل و 3 سطح توسط 9 آزمایش بهینه سازی شد ( طبق جدول 1و2). بدینمنظور در هر آزمایش از 15 میلیلیتر محلول کراتین هیدولیز شده با غلظت معین در تمام آزمایشهایاستفاده شد. بهعلت حساسیت مواد استفاده شده، واکنش در تاریکی و زیر هود شیمیایی تا رسیدن به محلول کربوکسی متیل کراتین ادامه یافت. در مدت زمان انجام واکنش pH کنترل شد و افت آن توسط محلول سود 3 مولار جبران شد و محلول توسط همزن مغناطیسی یکنواخت گردید.
جدول 1: سطحبندی و عوامل مؤثر در واکنش اصلاح شیمیایی کراتین هیدرولیز شده بهروش آلکیلاسیون
جدول 2: آزمایش‌های طراحی شده توسط نرمافزار تاگوچی جهت بهینهسازی روش آلکیلاسیون
| عامل | سطح 1 | سطح 2 | سطح 3 |
| یدواستیک اسید/ سیستئین | 1 | 2 | 4 |
| pH | 8 | 9 | 10 |
| دما( درجه سانتیگراد) | 4 | 25 | 45 |
| زمان( دقیقه) | 15 | 45 | 90 |
جدول 2: آزمایش‌های طراحی شده توسط نرمافزار تاگوچی جهت بهینهسازی روش آلکیلاسیون
| شماره آزمایش | عامل | |||
| زمان | دما | pH | یدواستیک اسید/ سیستئین | |
| 1 | 1 | 2 | 1 | 1 |
| 2 | 2 | 1 | 2 | 1 |
| 3 | 3 | 2 | 3 | 1 |
| 4 | 3 | 1 | 1 | 2 |
| 5 | 1 | 3 | 2 | 2 |
| 6 | 2 | 2 | 3 | 2 |
| 7 | 2 | 3 | 1 | 3 |
| 8 | 3 | 2 | 2 | 3 |
| 9 | 1 | 1 | 3 | 3 |
ب: اصلاح شیمیایی کراتین هیدولیز شده بهروش سولفیدولیز
اصلاح شیمیایی ملایم باندهای دیسولفیدی بهروش سولفیدولیز انجام شد (38). عوامل تأثیرگذار در این روش شامل دما و نسبت حجم بافر سولفیت به سیستئین موجود در پروتئین توسط نرمافزار تاگوچی در 2 عامل و 3 سطح توسط 9 آزمایش بهینهسازی شد (طبق جدول4 و3). بدینمنظور در هر آزمایش از 15 میلیلیتر محلول کراتین هیدولیز شده با غلظت ثابت در تمام آزمایشها استفاده شد. بافر سدیم سولفیت اضافه شد و 1 ساعت در شیکر قرار داده شد. دمای شیکر و حجم بافر سولفیت طبق جدول 3 و 4 تعیین شد. سپس بافر اوره- تریس با 5/7pH و 2- مرکاپتواتانول 7/0 مولار اضافه شد و بهمدت 2 ساعت در دمای30 درجه سانتیگراد در شیکر قرار داده شد.
اصلاح شیمیایی ملایم باندهای دیسولفیدی بهروش سولفیدولیز انجام شد (38). عوامل تأثیرگذار در این روش شامل دما و نسبت حجم بافر سولفیت به سیستئین موجود در پروتئین توسط نرمافزار تاگوچی در 2 عامل و 3 سطح توسط 9 آزمایش بهینهسازی شد (طبق جدول4 و3). بدینمنظور در هر آزمایش از 15 میلیلیتر محلول کراتین هیدولیز شده با غلظت ثابت در تمام آزمایشها استفاده شد. بافر سدیم سولفیت اضافه شد و 1 ساعت در شیکر قرار داده شد. دمای شیکر و حجم بافر سولفیت طبق جدول 3 و 4 تعیین شد. سپس بافر اوره- تریس با 5/7pH و 2- مرکاپتواتانول 7/0 مولار اضافه شد و بهمدت 2 ساعت در دمای30 درجه سانتیگراد در شیکر قرار داده شد.
جدول3: سطحبندی و عوامل مؤثر در واکنش اصلاح شیمیایی کراتین هیدرولیز شده بهروش سولفیدولیز
| عامل | سطح1 | سطح2 | سطح 3 |
| دما(درجه سانتیگراد) | 4 | 25 | 35 |
| حجم بافرسولفیت/ سیستئین | 5/0 | 1 | 2 |
تستهای تأییدی فقط بر روی نمونه‌های لیوفلیز شده نقاط بهینه بهدست آمده نرمافزار تاگوچی برای کراتین اصلاح شده بهروش آلکیلاسیون و سولفیدولیز و همچنین محلول کراتین هیدولیز شده بهعنوان شاهد انجام شد.
جدول 4: آزمایش‌های طراحی شده توسط نرمافزار تاگوچی جهت بهینهسازی روش سولفیدولیز
| عامل | شماره آزمایش | |
| حجم بافرسولفیت/ سیستئین | دما | |
| 1 | 1 | 1 |
| 2 | 1 | 2 |
| 3 | 1 | 3 |
| 1 | 2 | 4 |
| 2 | 2 | 5 |
| 3 | 2 | 6 |
| 1 | 3 | 7 |
| 2 | 3 | 8 |
| 3 | 3 | 9 |
اندازهگیری مقدار گروه تیول آزاد
اندازهگیری گروه تیول آزاد توسط معرف المن انجام شد (39). سپس جذب نمونه در nm 412 خوانده شد. میزان و غلظت سولفیدولیز در هر نمونه از ضریب جذب مولی TNB با مقدارM-1 cm-1 14150 با استفاده از فرمول شماره 1 محاسبه شد (40). A برابر است با مقدار جذب در طول موج nm 412، b طول مسیر که برابر با 1 سانتی‌متر است، E برابر است با M-1 cm-1 14150 و c برابر است با غلظت تیول آزاد در نمونه.
فرمول 1
کدورت سنجی
مقدار کدورت محلول کراتین اصلاح شده در هر مرحله بعد از اصلاح شیمیایی به روش آلکیلاسیون و سولفیدولیز توسط دستگاه اسپکتوفتومتر (JENWAY-model 6310-UK) در طول موج 540 نانومتر خوانده شد(41).
FTIR
تست FTIR برای نمونه کراتین اصلاح شده به روش آلکیلاسیون و سولفیدولیز و کراتین هیدولیز شده بهعنوان نمونه اصلاح نشده بهمنظور تأیید گروه‌های عاملی (42) توسط دستگاه (THERMO- model AVATAR-USA) FTIR در دامنه طول موج 450 تا 4000 انجام گردید.
تعیین اندازه کراتین هیدرولیز شده
در این پژوهش برای تأیید اندازه سایز پروتئین آنالیز SDS-PAGE با ژل بالای 5 درصد و ژل پایین 5/14 درصد استفاده شد.
DLS
روش پراکنـدگی دینامیـکی نور یکی از روش‌های مناسب برای تعیین توزیع ابعاد ذرات و تعیین تجمع در محلولهای پروتئینی است (43) در این پژوهش هدف از انجام تست DLS تعیین ابعاد ذرات و مقدار پراکندگی نمونه‌ها در محلول آبی است. این آنالیز در پژوهشگاه رنگ تهران توسط دستگاه DLS (HORIBA-model SZ-10- Japan) انجام شد.
اندازهگیری حلالیت در آب
جهت بررسی مقدار حلالیت کراتین اصلاح شده در آب مقادیر 0001/0 الی 1/0 از گرم کراتین اصلاح شده به روش آلکیلاسیون و سولفیدولیز توزین شد در یک میلیلیتر آب مقطر حل شد. محلول ورتکس شد و مقدار کدورت آن در 540 نانومتر اندازهگیری شد.
بررسی پایداری حلالیت کراتین اصلاح شده
کراتین اصلاح شده توسط روش الکیلاسیون و سولفیدولیز طی سه دسته آزمایش (مقاومت در برابر pH، مقاومت در برابر نیروی گریز از مرکز و مدت زمان پایداری) جهت بررسی مقاومت در برابر تشکیل توده‌های پروتئینی و ایجاد رسوب، عوامل ناپایدار کننده در محیط مانند تغییرها و نوسانها pH و همچنین مدت زمان یکنواختی محلول کراتینی و حفظ محتوای پروتئینی انجام شد.
تغییر pH باعث ایجاد شرایط تنش‌زا برای پروتئین می‌شود که بررسی رفتار و مقاومت پروتئین اصلاح شده در برابر این شرایط بررسی شد. نمونه کراتین هیدرولیز شده بهعنوان شاهد نمونه‌های اصلاح شده (به روش آلکیلاسیون و سولفیدولیز) قرار داده شد. در ابتدا کدورت نمونه‌ها در540 نانومتر و غلظت نمونه‌ها اندازهگیری شد. سپس یک بازه pH انتخاب شد. در این قسمت از پژوهش بازه pH از 3 الی 10 انتخاب شد و بهصورت مرحله‌ای pH نمونه‌ها کاهش داده شد، و در هر مرحله بهخوبی همزده شده وکدورت نمونه‌ها دوباره در 540 نانومتر در دمای 25 درجه سانتیگراد خوانده شد. جهت بررسی پایداری، مقدار کدورت نمونه کراتین اصلاح شده به روش آلکیلاسیون و سولفیدولیز بهصورت روزانه تا 30روز در 540 نانومتر اندازهگیری شد.
درصد اصلاح شیمیایی
مقدارگروه تیول آزاد در سیستئین باقی مانده از اصلاح کراتین پر بهوسیله معرف المن تعیین می‌شود از این رو مقدار اصلاح شده و مقدار اصلاح نشده کراتین را به درصدی بهعنوان درجه اصلاح جهت مشخص کردن مقدار باندهای دیسولفیدی می‌توان گزارش کرد. طبق فرمول 2 درجه اصلاح محاسبه می‌شود (44). طبق فرمول 2درجه اصلاح محاسبه گردید.
فرمول 2
مقدار sun mod نشاندهنده مقدار اصلاح نشده برای کراتین که کمابیش 350 میکرومول بهازای واحد گرم است. مقدار s mod نشاندهنده مقدار محاسبه شده باندهای دیسولفیدی با استفاده از معرف المن است.
یافته‌ها
کراتین موجود در پر مرغ کشتارگاهی در محلول سود 2/0 مولار با راندمان 8/69 درصد استخراج شد. درجه هیدرولیز با استفاده از آنزیم آلکالاز 21 درصد توسط روش pH-stat تعیین گردید. مقدار متوسط نتایج آزمایش‌های بهینه سازی اصلاح شیمیایی کراتین به روش آلکیلاسیون در جدول 5 آمده است. جدول تحلیل نتایج آنوا بهدست آمده بر اساس روش تاگوچی برای بهینه سازی اصلاح شیمیایی کراتین به روش آلکیلاسیون در جدول 6 آمده است.
اندازهگیری گروه تیول آزاد توسط معرف المن انجام شد (39). سپس جذب نمونه در nm 412 خوانده شد. میزان و غلظت سولفیدولیز در هر نمونه از ضریب جذب مولی TNB با مقدارM-1 cm-1 14150 با استفاده از فرمول شماره 1 محاسبه شد (40). A برابر است با مقدار جذب در طول موج nm 412، b طول مسیر که برابر با 1 سانتی‌متر است، E برابر است با M-1 cm-1 14150 و c برابر است با غلظت تیول آزاد در نمونه.
فرمول 1
کدورت سنجی
مقدار کدورت محلول کراتین اصلاح شده در هر مرحله بعد از اصلاح شیمیایی به روش آلکیلاسیون و سولفیدولیز توسط دستگاه اسپکتوفتومتر (JENWAY-model 6310-UK) در طول موج 540 نانومتر خوانده شد(41).
FTIR
تست FTIR برای نمونه کراتین اصلاح شده به روش آلکیلاسیون و سولفیدولیز و کراتین هیدولیز شده بهعنوان نمونه اصلاح نشده بهمنظور تأیید گروه‌های عاملی (42) توسط دستگاه (THERMO- model AVATAR-USA) FTIR در دامنه طول موج 450 تا 4000 انجام گردید.
تعیین اندازه کراتین هیدرولیز شده
در این پژوهش برای تأیید اندازه سایز پروتئین آنالیز SDS-PAGE با ژل بالای 5 درصد و ژل پایین 5/14 درصد استفاده شد.
DLS
روش پراکنـدگی دینامیـکی نور یکی از روش‌های مناسب برای تعیین توزیع ابعاد ذرات و تعیین تجمع در محلولهای پروتئینی است (43) در این پژوهش هدف از انجام تست DLS تعیین ابعاد ذرات و مقدار پراکندگی نمونه‌ها در محلول آبی است. این آنالیز در پژوهشگاه رنگ تهران توسط دستگاه DLS (HORIBA-model SZ-10- Japan) انجام شد.
اندازهگیری حلالیت در آب
جهت بررسی مقدار حلالیت کراتین اصلاح شده در آب مقادیر 0001/0 الی 1/0 از گرم کراتین اصلاح شده به روش آلکیلاسیون و سولفیدولیز توزین شد در یک میلیلیتر آب مقطر حل شد. محلول ورتکس شد و مقدار کدورت آن در 540 نانومتر اندازهگیری شد.
بررسی پایداری حلالیت کراتین اصلاح شده
کراتین اصلاح شده توسط روش الکیلاسیون و سولفیدولیز طی سه دسته آزمایش (مقاومت در برابر pH، مقاومت در برابر نیروی گریز از مرکز و مدت زمان پایداری) جهت بررسی مقاومت در برابر تشکیل توده‌های پروتئینی و ایجاد رسوب، عوامل ناپایدار کننده در محیط مانند تغییرها و نوسانها pH و همچنین مدت زمان یکنواختی محلول کراتینی و حفظ محتوای پروتئینی انجام شد.
تغییر pH باعث ایجاد شرایط تنش‌زا برای پروتئین می‌شود که بررسی رفتار و مقاومت پروتئین اصلاح شده در برابر این شرایط بررسی شد. نمونه کراتین هیدرولیز شده بهعنوان شاهد نمونه‌های اصلاح شده (به روش آلکیلاسیون و سولفیدولیز) قرار داده شد. در ابتدا کدورت نمونه‌ها در540 نانومتر و غلظت نمونه‌ها اندازهگیری شد. سپس یک بازه pH انتخاب شد. در این قسمت از پژوهش بازه pH از 3 الی 10 انتخاب شد و بهصورت مرحله‌ای pH نمونه‌ها کاهش داده شد، و در هر مرحله بهخوبی همزده شده وکدورت نمونه‌ها دوباره در 540 نانومتر در دمای 25 درجه سانتیگراد خوانده شد. جهت بررسی پایداری، مقدار کدورت نمونه کراتین اصلاح شده به روش آلکیلاسیون و سولفیدولیز بهصورت روزانه تا 30روز در 540 نانومتر اندازهگیری شد.
درصد اصلاح شیمیایی
مقدارگروه تیول آزاد در سیستئین باقی مانده از اصلاح کراتین پر بهوسیله معرف المن تعیین می‌شود از این رو مقدار اصلاح شده و مقدار اصلاح نشده کراتین را به درصدی بهعنوان درجه اصلاح جهت مشخص کردن مقدار باندهای دیسولفیدی می‌توان گزارش کرد. طبق فرمول 2 درجه اصلاح محاسبه می‌شود (44). طبق فرمول 2درجه اصلاح محاسبه گردید.
فرمول 2 مقدار sun mod نشاندهنده مقدار اصلاح نشده برای کراتین که کمابیش 350 میکرومول بهازای واحد گرم است. مقدار s mod نشاندهنده مقدار محاسبه شده باندهای دیسولفیدی با استفاده از معرف المن است.
یافته‌ها
کراتین موجود در پر مرغ کشتارگاهی در محلول سود 2/0 مولار با راندمان 8/69 درصد استخراج شد. درجه هیدرولیز با استفاده از آنزیم آلکالاز 21 درصد توسط روش pH-stat تعیین گردید. مقدار متوسط نتایج آزمایش‌های بهینه سازی اصلاح شیمیایی کراتین به روش آلکیلاسیون در جدول 5 آمده است. جدول تحلیل نتایج آنوا بهدست آمده بر اساس روش تاگوچی برای بهینه سازی اصلاح شیمیایی کراتین به روش آلکیلاسیون در جدول 6 آمده است.
جدول 5: نتایج بهدست آمده از آزمایش‌های طراحی شده توسط نرمافزار تاگوچی برای بهینهسازی اصلاح شیمیایی کراتین بهروش آلکیلاسیون
جدول 6: تحلیل نتایج آنوا آزمایش‌های طراحی شده توسط نرمافزار تاگوچی برای بهینهسازی اصلاح شیمیایی کراتین به روش آلکیلاسیون
جدول 7: نقاط بهینه و نتیجه قابل انتظار از آزمایش‌های طراحی شده توسط نرمافزار تاگوچی برای بهینهسازی اصلاح شیمیایی کراتین به روش آلکیلاسیون
| شماره آزمایش | مقدار متوسط جذب[3] |
| 1 | 302/0 |
| 2 | 325/0 |
| 3 | 191/0 |
| 4 | 247/0 |
| 5 | 202/0 |
| 6 | 131/0 |
| 7 | 271/0 |
| 8 | 130/0 |
| 9 | 209/0 |
جدول 6: تحلیل نتایج آنوا آزمایش‌های طراحی شده توسط نرمافزار تاگوچی برای بهینهسازی اصلاح شیمیایی کراتین به روش آلکیلاسیون
| ردیف | عوامل | DOF (f) |
مجموع مربعات (s) |
واریانس (v) |
نسبتF (F) |
جمع خالص (s’) |
درصد % |
| 1 | نسبت یداستیک اسید/ سیستئین | 2 | 01/0 | 005/0 | - | 01/0 | 896/26 |
| 2 | pH | 2 | 013/0 | 006/0 | - | 013/0 | 702/36 |
| 3 | دما | 2 | 007/0 | 003/0 | - | 007/0 | 942/20 |
| 4 | زمان | 2 | 005/0 | 002/0 | - | 005/0 | 194/15 |
| 5 | کل | 8 | 037/0 | - | - | 100٪ |
جدول 7: نقاط بهینه و نتیجه قابل انتظار از آزمایش‌های طراحی شده توسط نرمافزار تاگوچی برای بهینهسازی اصلاح شیمیایی کراتین به روش آلکیلاسیون
| ردیف | عوامل | توضیحات سطح | سطح |
| 1 | نسبت یداستیک اسید/ سیستئین | 2 | 2 |
| 2 | pH | 10 | 3 |
| 3 | دما | 4 | 1 |
| 4 | زمان | 90 | 3 |
| میانگین عالی عملکرد فعلی | 225/0 | ||
| نتیجه قابل انتطار از نقطه بهینه | 086/0 | ||
طبق جدول 7 در شرایط بهینه دمای 4 درجه سانتیگراد، نسبت 2 برابر یدواستیکاسید به سیستئین موجود در پر، pH برابر با 10 و زمان 90 دقیقه به s-کراتین کربوکسی متیل تبدیل می‌شود. تأثیر عوامل تأثیرگذار در بهینهسازی اصلاح شیمیایی کراتین به روش آلکیلاسیون pH با 702/36 درصد بیشترین تأثیر و بهترتیب نسبت یدواستیکاسید/ سیستئین با 896/26 درصد سپس دما با 942/20 درصد و در انتها زمان واکنش 194/15 درصد در جدول 6 عنوان شد. مقدار تیول‌های آزاد توسط معرف المن با روش رنگ سنجی10-5×1/9 مول اندازهگیری شد و طبق فرمول شماره 2 درجه اصلاح کراتین هیدولیز شده با روش آلکیلاسیون 72درصد را نشان داد. مقدار متوسط نتایج در آزمایش‌های بهینهسازی به روش سولفیدولیز در جدول 8 آمده است. نتایج آنالیز داده و آنوا بهدست آمده بر اساس روش تاگوچی در جدول 9 آمده است.
جدول 8: نتایج بهدست آمده از آزمایش‌های طراحی شده توسط نرمافزار تاگوچی برای بهینهسازی اصلاح شیمیایی کراتین به روش سولفیدولیز
جدول 9: تحلیل نتایج آنوا آزمایش‌های طراحی شده توسط نرمافزار تاگوچی برای بهینهسازی اصلاح شیمیایی کراتین بهروش سولفیدولیز
جدول 10: نقاط بهینه و نتیجه قابل انتظار از آزمایش‌های طراحی شده توسط نرمافزار تاگوچی برای بهینهسازی اصلاح شیمیایی کراتین بهروش سولفیدولیز
| شماره آزمایش | مقدار متوسط جذب |
| 1 | 864/0 |
| 2 | 794/0 |
| 3 | 615/0 |
| 4 | 387/0 |
| 5 | 402/0 |
| 6 | 261/0 |
| 7 | 333/0 |
| 8 | .279/0 |
| 9 | 3/0 |
جدول 9: تحلیل نتایج آنوا آزمایش‌های طراحی شده توسط نرمافزار تاگوچی برای بهینهسازی اصلاح شیمیایی کراتین بهروش سولفیدولیز
| ردیف | عوامل | DOF (f) |
مجموع مربعات (S) |
واریانس (V) |
نسبت F (F) |
جمع خالص (S’) |
درصد ٪ |
| 1 | دما | 2 | 374/0 | 187/0 | 876/0 | 365/0 | 967/87 |
| 2 | نسبت بافر سولفیت به کراتین | 2 | 029/0 | 014/0 | 561/3 | 021/0 | 087/5 |
| خطا | 4 | 016/0 | 004/0 | 946/7 | |||
| کل | 8 | 42/0 | 100 | ||||
جدول 10: نقاط بهینه و نتیجه قابل انتظار از آزمایش‌های طراحی شده توسط نرمافزار تاگوچی برای بهینهسازی اصلاح شیمیایی کراتین بهروش سولفیدولیز
| ردیف | عوامل | توضیحات سطح | سطح |
| 1 | دما | 35 | 3 |
| 2 | نسبت بافر به سیستئین | 2 | 3 |
طبق جدول 9 آنالیز نتایج توسط نرمافزار تاگوچی نشان داد که دما بیشترین تأثیر در اصلاح شیمیایی بهروش سولفیدولیز را با 87 درصد و نسبت بافر سدیم سولفیت به سیستئین کمترین تأثیر را با 087/5 درصد دارد که نشاندهنده تأثیر بسزای دما در افزایش فعالیت برش توسط بافر است. همانطور که در جدول 10 مشاهده می‌شود در اصلاح شیمیایی بر روی کراتین هیدولیز شده پر مرغ کشتارگاهی با روش سولفیدولیز نقاط بهینه داده شده توسط نرمافزار تاگوچی دمای 35 درجه سانتیگراد و نسبت دو برابر بافر سولفیت واکنش دهنده بهمقدار سیستئین موجود بوده است. در این روش طبق محاسبات مقدار تیول آزاد محاسبه شده توسط معرف المن 10-5×02/12 مول بوده و درجه اصلاح محاسبه شده طبق فرمول 2 در این روش 66 درصد بوده است. بررسی پایداری انجام شده بر روی کراتین اصلاح شده بهروش آلکیلاسیون و سولفیدولیز در مقایسه با کراتین هیدولیز شده همانطور که در نمودار 1 نشان داد که s- سولفوسیستئین کراتین تولید شده بهروش سولفیدولیز در pH برابر با 3، 3/335 درصد نسبتبه نمونه کراتین هیدرولیز شده بهعنوان شاهد پایدارتر است. همچنین پایداری بررسی شده s-کراتین کربوکسیمتیل تولید شده در روش آلکیلاسیون در نمودار 1 نشان داد که مقاومت در برابر رسوبدهی و پایداری حلالیت پروتئین بهطوری است که در pH برابر با 3، 65/288 درصد نسبتبه نمونه شاهد خود پایدارتر است.
نمودار 1: مقایسه پایداری انجام شده کراتین اصلاح شده بهروش الکیلاسیون و سولفیدولیز با کراتین هیدرولیز شده در pH های متفاوت
بررسی زمان پایداری با هدف بهدست آوردن مدت زمانی که کراتینهای اصلاح شده توانایی حفظ محتوای پروتئینی را دارند،
میانگین عالی عملکرد فعلی 475/0
نتیجه قابل انتطار از نقطه‌ی بهینه 241/0
با بررسی مقدار کدورت با روش اندازهگیری جذب توسط دستگاه اسپکتوفتومتر در 540 نانومتر انجام شد. کراتین هیدولیز شده بهعنوان معیار مقایسه قرار گرفت. نتایج در نمودار 2 آمده است. تحلیل نمودار 2 نشان داد که s-کراتین کربوکسی متیل تولید شده در روش آلکیلاسیون در طی مدت زمان 30 روز نگهداری در دمای 4 درجه سانتیگراد دارای 19/81 درصد و s- سولفوسیستئین کراتین، (کراتین اصلاح شده بهروش سولفیدولیز) دارای 3/86 درصد پایداری داشته‌است، در صورتیکه کراتین هیدولیز شده بهعنوان شاهد تنها 8/9 درصد در طی 30 روز محتوای پروتئینی خود را حفظ کرده‌است. همچنین این بررسی با اندازهگیری مقدار پروتئین موجود در محلول توسط معرف بیورت نیز تأیید شد.
در میان ویژگی‌های عملکردی پروتئینها، حلالیت یکی از مهم‌ترین و اساسی‌ترین آنها است که بر روی کاربرد آن در فرمولاسیون تأثیر دارد. حلالیت نمونه s- سولفوسیستئین کراتین و s-کراتین کربوکسی متیل در آب مقطر در دمای اتاق با اندازهگیری مقدار کدورت در 540 نانومتر انجام شد که هر دو نمونه با شاهد آب مقطر سنجیده شد و نتایج طبق نمودار ستونی 3 نشان داد که هر دو نمونه تا غلظت g/l 100 حلالیت داشته و دارای مقدار حدودی جذب 1/0 بوده‌اند، که نشاندهنده حلالیت این دو ماده در آب است و محلول یکنواخت ایجاد شده است. آزمایش DLS یک روش ایده‌آل برای اندازهگیری اندازه ذرات معلق از 1 نانومتر به حدود 10 میکرومتر (بستهبه چگالی ذرات) است.
پراکندگی نور از ذرات و حرکت ذرات باعث نوسانات تعداد فوتون در آشکارساز می شود.
میانگین عالی عملکرد فعلی 475/0
نتیجه قابل انتطار از نقطه‌ی بهینه 241/0
با بررسی مقدار کدورت با روش اندازهگیری جذب توسط دستگاه اسپکتوفتومتر در 540 نانومتر انجام شد. کراتین هیدولیز شده بهعنوان معیار مقایسه قرار گرفت. نتایج در نمودار 2 آمده است. تحلیل نمودار 2 نشان داد که s-کراتین کربوکسی متیل تولید شده در روش آلکیلاسیون در طی مدت زمان 30 روز نگهداری در دمای 4 درجه سانتیگراد دارای 19/81 درصد و s- سولفوسیستئین کراتین، (کراتین اصلاح شده بهروش سولفیدولیز) دارای 3/86 درصد پایداری داشته‌است، در صورتیکه کراتین هیدولیز شده بهعنوان شاهد تنها 8/9 درصد در طی 30 روز محتوای پروتئینی خود را حفظ کرده‌است. همچنین این بررسی با اندازهگیری مقدار پروتئین موجود در محلول توسط معرف بیورت نیز تأیید شد.
در میان ویژگی‌های عملکردی پروتئینها، حلالیت یکی از مهم‌ترین و اساسی‌ترین آنها است که بر روی کاربرد آن در فرمولاسیون تأثیر دارد. حلالیت نمونه s- سولفوسیستئین کراتین و s-کراتین کربوکسی متیل در آب مقطر در دمای اتاق با اندازهگیری مقدار کدورت در 540 نانومتر انجام شد که هر دو نمونه با شاهد آب مقطر سنجیده شد و نتایج طبق نمودار ستونی 3 نشان داد که هر دو نمونه تا غلظت g/l 100 حلالیت داشته و دارای مقدار حدودی جذب 1/0 بوده‌اند، که نشاندهنده حلالیت این دو ماده در آب است و محلول یکنواخت ایجاد شده است. آزمایش DLS یک روش ایده‌آل برای اندازهگیری اندازه ذرات معلق از 1 نانومتر به حدود 10 میکرومتر (بستهبه چگالی ذرات) است.
پراکندگی نور از ذرات و حرکت ذرات باعث نوسانات تعداد فوتون در آشکارساز می شود.
نمودار 2: بررسی مدت زمان پایداری کراتین اصلاح شده بهروش آلکیلاسیون و کراتین اصلاح شده بهروش سولفیدولیز در مقایسه با کراتین هیدولیز شده از طریق اندازهگیری مقدار کدورت ایجاد شده و خواندن جذب نمونه‌ها در 540 نانومتر در طی 30 روز و نگهداری در دمای 4 درجه سانتیگراد
با توجهبه جواب نتیجه تست DLS نمایش داده شده در نمودار شماره 3، نمونه کراتین هیدرولیز شده محلول در سود رقیق دارای PI برابر با 552/0 و میانگین وزنی قطر 5/2090 نانومتر و اندازه متوسط ذرات 3/990 نانومتر است، s-کراتین کربوکسیمتیل محلول در آب مقطر دارای PI برابر با 476/0 و میانگین وزنی قطر 3/326 نانومتر و دارای اندازه متوسط ذرات 3/157 نانومتر است. در نمونه s- سولفوسیستئین کراتین محلول در آب مقطر دارای مقدار PI برابر با 475/0 و میانگین وزنی قطر 4/327 نانومتر و اندازه متوسط ذرات 2/136 نانومتر است. نتایج تست DLS نشان داد که کراتینهای اصلاح شده دارای اندازه متوسط ذرات کوچکتری نسبتبه نمونه کراتین هیدرولیز شده هستند. مقایسه PI نشان داد که هر دو محلول اصلاح شده دارای پراکندگی یکنواخت‌تری نسبتبه نمونه کراتین هیدرولیز شده است. همچنین میانگین وزنی قطر S-کراتین کربوکسی متیل و S-سولفوسیتئین کراتین تقریبا یکسان بوده و بسیار کوچکتر از نمونه کراتین هیدرولیز شده است که پراکندگی مناسب ذرات برخودار هستند.
هدف از انجام تست FTIR در این پژوهش تأیید گروه‌های عاملی است که انتظار می‌رود در طی انجام واکنش‌ها بر روی پروتئینها منتقل شده باشد، نتایج در نمودار 4 نشان میدهد که پیک‌های شاخص در طیف FTIR پروتئینها مربوط به پیوندهای پپتیدی می‌باشد. پیوندهای پپتیدی اصلیترین واحد ساختاری در زنجیر پلی‌پپتیدی است. در نمونه‌های FTIR گرفته شده در هر سه جواب شاهد پیک cm-1 3720 الی 3764 هستیم که نشاندهنده O-H آزاد و مربوط به آب موجود در نمونه‌ها است. از cm-1 3100 الی 3500 نشاندهنده پیوند N-N است که در هر سه نمونه کراتین موجود است و نشاندهنده پیوند پپیتیدی است. در نمونه هیدرولیز شده طیف وسیعتری از گروه‌های آمینی مشخص است بهصورت جزئی‌تر پیک cm-1 3220 مربوط به پیوند N-H درون مولکولی و cm-1 3351 مربوط به آمین نوع دوم، است. پیک تقریبی cm-1 2900 در هر سه نمونه نشاندهنده پیوند C-H در آلکان‌ها است که در تست هیدرولیز شده این پیک تیزتر است (45) ارتعاشات در پیوندهای C = C و C = Nدر منطقه عمومی بین cm-1 1300-1600 رخ میدهد. جذب شامل کشش و انقباض تمام پیوندهای و تعامل بین این حالت‌های کششی است. این محدوده در هر سه نمونه بهخوبی قابل مشاهده است. اما بهصورت اختصاصی در نمونه کراتین هیدولیز شده عدد cm-1 1643 مربوط به وجود پیوند C-N در آمید‌ها است. پیک cm-1 1690 در نمونه کراتین اصلاح شده بهروش آلکیلاسیون و همچنین نمونه کراتین اصلاح شده سولفیدولیز مشاهده می‌شود که مربوط به پیوندهای C=O موجود در آمید‌ها است که در نمونه کراتین اصلاح شده بهروش سولفیدولیز تیزتر است. پیک cm-1 1550-1610 و cm-1 1300-1420 مربوط به گروه کربوکلسیک اسید و پیک cm-1 1405 بهخوبی و قله‌ای بزرگ در FTIR مربوط به نمونه کراتین اصلاح شده دیده می‌شود (توسط فلش توپر نشان داده شده است)، همچنین در پیک cm-1 1690
هدف از انجام تست FTIR در این پژوهش تأیید گروه‌های عاملی است که انتظار می‌رود در طی انجام واکنش‌ها بر روی پروتئینها منتقل شده باشد، نتایج در نمودار 4 نشان میدهد که پیک‌های شاخص در طیف FTIR پروتئینها مربوط به پیوندهای پپتیدی می‌باشد. پیوندهای پپتیدی اصلیترین واحد ساختاری در زنجیر پلی‌پپتیدی است. در نمونه‌های FTIR گرفته شده در هر سه جواب شاهد پیک cm-1 3720 الی 3764 هستیم که نشاندهنده O-H آزاد و مربوط به آب موجود در نمونه‌ها است. از cm-1 3100 الی 3500 نشاندهنده پیوند N-N است که در هر سه نمونه کراتین موجود است و نشاندهنده پیوند پپیتیدی است. در نمونه هیدرولیز شده طیف وسیعتری از گروه‌های آمینی مشخص است بهصورت جزئی‌تر پیک cm-1 3220 مربوط به پیوند N-H درون مولکولی و cm-1 3351 مربوط به آمین نوع دوم، است. پیک تقریبی cm-1 2900 در هر سه نمونه نشاندهنده پیوند C-H در آلکان‌ها است که در تست هیدرولیز شده این پیک تیزتر است (45) ارتعاشات در پیوندهای C = C و C = Nدر منطقه عمومی بین cm-1 1300-1600 رخ میدهد. جذب شامل کشش و انقباض تمام پیوندهای و تعامل بین این حالت‌های کششی است. این محدوده در هر سه نمونه بهخوبی قابل مشاهده است. اما بهصورت اختصاصی در نمونه کراتین هیدولیز شده عدد cm-1 1643 مربوط به وجود پیوند C-N در آمید‌ها است. پیک cm-1 1690 در نمونه کراتین اصلاح شده بهروش آلکیلاسیون و همچنین نمونه کراتین اصلاح شده سولفیدولیز مشاهده می‌شود که مربوط به پیوندهای C=O موجود در آمید‌ها است که در نمونه کراتین اصلاح شده بهروش سولفیدولیز تیزتر است. پیک cm-1 1550-1610 و cm-1 1300-1420 مربوط به گروه کربوکلسیک اسید و پیک cm-1 1405 بهخوبی و قله‌ای بزرگ در FTIR مربوط به نمونه کراتین اصلاح شده دیده می‌شود (توسط فلش توپر نشان داده شده است)، همچنین در پیک cm-1 1690
نمودار3: نتایج DLS کراتین اصلاح شده بهروش الکیلاسیون، سولفیدولیز و کراتین هیدولیز شده
نمودار 4: نتایج آنالیز FTIR کراتین اصلاح شده بهروش آلکیلاسیون و سولفیدولیز در مقایسه با کراتین هیدولیز شده
پیوند C=O نیز گواه این ادعا است که در اصلاح شیمیایی کراتین هیدرولیز شده بهروش آلکیلاسیون گروه کربوکلسیک اسید بهدرستی جایگزین شده و باعث بهبود شرایط کراتین شده است. در کراتین هیدرولیز شده و کراتین اصلاح شده بهروش سولفیدولیز نیز پیک‌های گروه کربوکسی نیز موجود است اما با قله‌های کوتاه که بهعلت وجود اسید‌های آمینه موجود در توالی پروتئین است. پیک 570-705 حاکی از وجودC-S و در cm-1 1030-1060 وجود S=O و cm-1 1050-1200 C=Sهمگی در کراتین هیدرولیز شده موجود است، همچنین وجود cm-1 450-550 وجود پیوندهای دیسولفیدی است. که در نمونه هیدرولیز شده بهخوبی قابل مشاهده است. در پیک cm-1 531 وجود پیوند C-I و cm-1 540-500 و پیوند S-S دچار همپوشانی شده و پیک تیزتر از نمونه کراتین هیدرولیز شده و کراتین اصلاح شده با روش سولفیدولیز است. در پیک‌های cm-1 1067 گروه S=O و در cm-1 158 گروه سولفات در نمونه اصلاح شده بهروش سولفیدولیز بهطورکامل مشهود است و در 676 نیز وجون یون سولفات مشخص است در cm-1 451 آریل سولفیدها همچنین در cm-1 751 S-O و C=C دارای همپوشانی است (نقاط مشخص شده توسط فلش با نقطه‌چین‌های ریز) از اینرو اصلاح گروه‌های دی سولفیدی در کراتین با روش سولفیدولیز نیز انجام شده و گروه‌های عاملی در پیک FTIR بهطور کامل مشخص است (47،46).
شکل 1: ژل الکتروفورز 5/14 درصد انجام شده برای سه نمونه کراتین اصلاح شده بهروش آلکیلاسیون (ج)، کراتین اصلاح شده بهروش سولفیدولیز (الف) و کراتین هیدولیز شده (ب)
همانطور که در شکل 1 مشاهده می‌شود ژل الکتروفورز 5/14 درصد انجام شده نشان داد که نمونه کراتین استخراجی دارای وزنی مولکولی در حدود 10 کیلو دالتون داشته و نمونه کراتین هیدورلیز شده یک اسمیر با بازه زیر 5000 دالتون را نشان میدهد که نشاندهنده هیدولیزاسیون صورت گرفته است. همچنین نمونه‌های کراتین اصلاح شده بهروش آلکیلاسیون و سولفیدولیز نیز دارای چنین اسمیر با بازه 5000 دالتون هستند، که پروتئین کراتین و سایز آن را تأیید می‌کند.
بحث
اصلاح شیمیایی با استفاده از کربوکسیهالید‌ها از دیرباز مورد توجه بوده‌است. ید بهترین گروه ترک کننده در واکنش‌های جانشینی است و روش آلکیلاسیون با یدواستیکاسید باعث انتقال بار منفی، و تولید s-کراتینکربوکسی متیل می‌شود که در محیط‌های اسید دارای پایداری بهتری نسبتبه نمونه کراتین هیدورلیز شده بهعنوان شاهد است. نتایج تاگوچی نشان داد که هرچه واکنش آلکیلاسیون در pH محیط بازی بهسمت باز قوی انجام شود احتمال راندمان کیفیت بالاتر محصول تولید شده وجود دارد، اما با توجهبه اینکه محیط‌های بازی قوی احتمال تخریب اسید آمینه‌ها و هیدولیز شیمیایی را افزایش میدهد بنابراین در حداکثر pH ممکن واکنش آلکیلاسیون انجام شد.Schrooye و همکاران در سال 2000 کراتین را توسط اوره و 2- مرکاپتواتانول استخراج و اصلاح شیمیایی را با روش آلکیلاسیون توسط سه ماده یدواستامید، یدواستیک اسید و برموسوکسینیک اسید بررسی و مقایسه کردند و توانستند برای تهیه فیلم با محلول اوره 8 مولار،EDTA ، تریس و 2-مرکاپتواتانول به اصلاح 80 درصد برای اصلاح با یدواستیکاسید و یداستامید و 40 درصد اصلاح با برموسوکسینیکاسید بهدست آوردند (31). همچنین Schrooyen و همکاران در سال 2001 کراتین استخراج شده توسط اوره و 2- مرکاپتواتانول را که توسط یدواستیک اسید اصلاح شیمیایی کرده بودند به علت عدم پایداری از سدیم دودسیلسولفات جهت برقراری پایداری استفاده کردند (6). همچنین Crestfield و همکاران در سال 1963 اصلاح شیمیایی و تولید پروتئین کربوکسی متیلاسیون شده را بررسی کردند (37). در این تحقیق با توجهبه روش کم هزینه‌تر استخراج و همچنین هیدرولیز پروتئین روش اصلاح شیمیایی ملایم‌تر و کاملتر انجام شد و اصلاح شیمیایی پروتئین جهت تولید کربوکسی متیل کراتین در محیطی با قدرت یونی پایین‌تری صورت گرفت. کراتین دارای پیوندهای دیسولفیدی است که در اصلاح شیمیایی با روش سولفیدولیز باعث کاهش پیوندهای دیسولفیدی و سیستئین‌های موجود در کراتین به s- سولفوسیستئین تبدیل می‌شود که در محیط‌های خنثی و متمایل به محیط اسیدی ضعیف بیشترین پایداری را دارد. Rajabinejad و همکاران در سال 2018 سولفیدولیز را تنها برای استخراج کراتین از پشم توسط اوره و سدیم متابی سولفیت همراه با روش اکسایشی و کاهشی بررسی کردند و توانستند به 32 درصد راندمان استخراج برسند اما پایداری را بررسی نشده است (44). روش سولفیدولیز برای اصلاح باندهای دی سولفیتی و افزایش پایداری تاکنون مورد بررسی قرار نگرفته بود در این تحقیق در مقایسه با روش آلکیلاسیون شرایط کمابیش برابری را از خود نشان داد. Ikkai و همکاران در سال 2001 کراتین کربوکسی متیل شده را در تیوگلیکولیکاسید حل کرده و همراه با محلول اوره و پتاس به صورت محلول درآورده و جهت بررسی توالی ساختمان دوم CD و DLS/SLS آنها بررسی شد (48) اما در این تحقیق بررسی تست فقط جهت بررسی پراکندگی ذرات و بهعنوان معیاری برای میزان تجمع و حلالیت استفاده شد.
نتیجه‌گیری
داروها و محصولات جدید مبتنی بر پروتئین در طول دهه آینده هزاره جدید به سرعت در حال افزایش است. علاوهبر صنعت دارو و مباحث درمانی پروتئینها در صنایع غذایی و آرایشی بهداشتی کاربرد گستردهای دارند. پایداری و ثبات این پروتئینها جهت استفاده و نگهداری حائز اهمیت است. کراتین نوعی پروتئین ساختاری است که استفاده بالایی در صنایع غذایی و آرایشی بهداشتی دارد که در آب نامحلول بوده و ناپایدار است. وزن کراتین در استخراج قلیایی توسط سدیمهیدوکسید حدود 5/10 کیلودالتون است که جهت دست‌یابی به سایز پایین‌تر از هیدرولیز آنزیمی توسط آنزیم صنعتی الکالاز انجام شد. کراتین هیدرولیز شده وزنی کمتر از 5000 دالتون دارد اما تمایل بالا به تجمع و تشکیل رسوب از مشکلات کراتین هیدرولیز شده است. از اینرو اصلاح شیمیایی بهعنوان روشی برای بهبود عملکرد کراتین هیدولیز شده استفاده شد که توسط دو روش آلکیلاسیون و سولفیدولیز مورد بررسی قرار گرفت، که روش آلکیلاسیون در دمای 4 درجه سانتیگراد، مقدار 2 برابر یدواسیتکاسید به مقدار سیستسئین موجود، در pH برابر 10 و زمان 90 دقیقه انجام شد و اصلاح شیمیایی با روش سولفیدولیز در دمای 35 درجه سانتیگراد و مقدار دو برابر بافر سولفیت بهمقدار سیستئین محلول انجام شد. اصلاح شیمیایی یک تغییر دائمی است اما اصلاح شیمیایی انجام شده بر روی وزن مولکولی تأثیر نداشته و SDS-Page نشان داد وزن مولکولی کراتین هیدرولیز شده، s-کراتین کربوکسی متیل و s- سولفوسیستئین کراتین با هم برابرند. نمونه کراتین اصلاح شده با روش آلکیلاسیون دارای در درجه اصلاح 72 درصد و در روش سولفیدولیز با درجه اصلاح 66 درصد انجام شد. همچنین بررسی پایداری نشان داد که s-کراتین کربوکسی متیل در pH برابر با 3، 65/ 288 درصد نسبتبه نمونه کراتین هیدولیز شده وs - سولفوسیستئین کراتین در pH برابر با 3، 3/335 درصد نسبتبه نمونه کراتین هیدولیز شده پایدارتر است. همچنینs -کراتین کربوکسیمتیل 19/81 درصد و s- سولفوسیستئین کراتین 3/86 درصد در طی 30 روز محتوای پروتئینی خود را حفظ کرده و دارای حلالیت بیشتر بوده‌اند. با توجهبه نتایج DLS پراکندگی ذرات در دو روش سولفیدولیز و آلکیلاسیون بهترتیب 475/0 و 476/0 ، دارای اندازه متوسط ذرات بهترتیب 2/136 و 3/157 نانومتر است در مقابل کراتین هیدولیز شده با پراکندگی ذرات552/0 و اندازه متوسط 3/990 نانومتر. کمتر بودن پراکندگی ذرات نشاندهنده مهار فرآیند اگریگاسیون و تجمع ذرات پروتئین در نمونه‌های اصلاح شده است. نتایج FTIR نشاندهنده وجود گروه‌های عاملی قابل انتظار در هر دو روش اصلاح شیمیایی است. همچنین بررسی حلالیت حاکی از حلالت s-کراتین کربوکسی متیل و s- سولفوسیستئین کراتین در آب تا غلظت g/l100 در دمای محیط است. پیشنهاد می‌شود که بر روی کراتین پایدار شده تستهای حساسیت انسانی بهمنظور استفاده در مواد آرایشی بهداشتی انجام شود.
سپاسگزاری
نویسندگان از کلیه همکاران و مسئول آزمایشگاه بیوتکنولوژی که در انجام این تحقیق همکاری کردند و همچنین از پژوهشگاه رنگ تهران، جهت انجام تستهای تکمیلی این پژوهش کمال تشکر را دارند.
بحث
اصلاح شیمیایی با استفاده از کربوکسیهالید‌ها از دیرباز مورد توجه بوده‌است. ید بهترین گروه ترک کننده در واکنش‌های جانشینی است و روش آلکیلاسیون با یدواستیکاسید باعث انتقال بار منفی، و تولید s-کراتینکربوکسی متیل می‌شود که در محیط‌های اسید دارای پایداری بهتری نسبتبه نمونه کراتین هیدورلیز شده بهعنوان شاهد است. نتایج تاگوچی نشان داد که هرچه واکنش آلکیلاسیون در pH محیط بازی بهسمت باز قوی انجام شود احتمال راندمان کیفیت بالاتر محصول تولید شده وجود دارد، اما با توجهبه اینکه محیط‌های بازی قوی احتمال تخریب اسید آمینه‌ها و هیدولیز شیمیایی را افزایش میدهد بنابراین در حداکثر pH ممکن واکنش آلکیلاسیون انجام شد.Schrooye و همکاران در سال 2000 کراتین را توسط اوره و 2- مرکاپتواتانول استخراج و اصلاح شیمیایی را با روش آلکیلاسیون توسط سه ماده یدواستامید، یدواستیک اسید و برموسوکسینیک اسید بررسی و مقایسه کردند و توانستند برای تهیه فیلم با محلول اوره 8 مولار،EDTA ، تریس و 2-مرکاپتواتانول به اصلاح 80 درصد برای اصلاح با یدواستیکاسید و یداستامید و 40 درصد اصلاح با برموسوکسینیکاسید بهدست آوردند (31). همچنین Schrooyen و همکاران در سال 2001 کراتین استخراج شده توسط اوره و 2- مرکاپتواتانول را که توسط یدواستیک اسید اصلاح شیمیایی کرده بودند به علت عدم پایداری از سدیم دودسیلسولفات جهت برقراری پایداری استفاده کردند (6). همچنین Crestfield و همکاران در سال 1963 اصلاح شیمیایی و تولید پروتئین کربوکسی متیلاسیون شده را بررسی کردند (37). در این تحقیق با توجهبه روش کم هزینه‌تر استخراج و همچنین هیدرولیز پروتئین روش اصلاح شیمیایی ملایم‌تر و کاملتر انجام شد و اصلاح شیمیایی پروتئین جهت تولید کربوکسی متیل کراتین در محیطی با قدرت یونی پایین‌تری صورت گرفت. کراتین دارای پیوندهای دیسولفیدی است که در اصلاح شیمیایی با روش سولفیدولیز باعث کاهش پیوندهای دیسولفیدی و سیستئین‌های موجود در کراتین به s- سولفوسیستئین تبدیل می‌شود که در محیط‌های خنثی و متمایل به محیط اسیدی ضعیف بیشترین پایداری را دارد. Rajabinejad و همکاران در سال 2018 سولفیدولیز را تنها برای استخراج کراتین از پشم توسط اوره و سدیم متابی سولفیت همراه با روش اکسایشی و کاهشی بررسی کردند و توانستند به 32 درصد راندمان استخراج برسند اما پایداری را بررسی نشده است (44). روش سولفیدولیز برای اصلاح باندهای دی سولفیتی و افزایش پایداری تاکنون مورد بررسی قرار نگرفته بود در این تحقیق در مقایسه با روش آلکیلاسیون شرایط کمابیش برابری را از خود نشان داد. Ikkai و همکاران در سال 2001 کراتین کربوکسی متیل شده را در تیوگلیکولیکاسید حل کرده و همراه با محلول اوره و پتاس به صورت محلول درآورده و جهت بررسی توالی ساختمان دوم CD و DLS/SLS آنها بررسی شد (48) اما در این تحقیق بررسی تست فقط جهت بررسی پراکندگی ذرات و بهعنوان معیاری برای میزان تجمع و حلالیت استفاده شد.
نتیجه‌گیری
داروها و محصولات جدید مبتنی بر پروتئین در طول دهه آینده هزاره جدید به سرعت در حال افزایش است. علاوهبر صنعت دارو و مباحث درمانی پروتئینها در صنایع غذایی و آرایشی بهداشتی کاربرد گستردهای دارند. پایداری و ثبات این پروتئینها جهت استفاده و نگهداری حائز اهمیت است. کراتین نوعی پروتئین ساختاری است که استفاده بالایی در صنایع غذایی و آرایشی بهداشتی دارد که در آب نامحلول بوده و ناپایدار است. وزن کراتین در استخراج قلیایی توسط سدیمهیدوکسید حدود 5/10 کیلودالتون است که جهت دست‌یابی به سایز پایین‌تر از هیدرولیز آنزیمی توسط آنزیم صنعتی الکالاز انجام شد. کراتین هیدرولیز شده وزنی کمتر از 5000 دالتون دارد اما تمایل بالا به تجمع و تشکیل رسوب از مشکلات کراتین هیدرولیز شده است. از اینرو اصلاح شیمیایی بهعنوان روشی برای بهبود عملکرد کراتین هیدولیز شده استفاده شد که توسط دو روش آلکیلاسیون و سولفیدولیز مورد بررسی قرار گرفت، که روش آلکیلاسیون در دمای 4 درجه سانتیگراد، مقدار 2 برابر یدواسیتکاسید به مقدار سیستسئین موجود، در pH برابر 10 و زمان 90 دقیقه انجام شد و اصلاح شیمیایی با روش سولفیدولیز در دمای 35 درجه سانتیگراد و مقدار دو برابر بافر سولفیت بهمقدار سیستئین محلول انجام شد. اصلاح شیمیایی یک تغییر دائمی است اما اصلاح شیمیایی انجام شده بر روی وزن مولکولی تأثیر نداشته و SDS-Page نشان داد وزن مولکولی کراتین هیدرولیز شده، s-کراتین کربوکسی متیل و s- سولفوسیستئین کراتین با هم برابرند. نمونه کراتین اصلاح شده با روش آلکیلاسیون دارای در درجه اصلاح 72 درصد و در روش سولفیدولیز با درجه اصلاح 66 درصد انجام شد. همچنین بررسی پایداری نشان داد که s-کراتین کربوکسی متیل در pH برابر با 3، 65/ 288 درصد نسبتبه نمونه کراتین هیدولیز شده وs - سولفوسیستئین کراتین در pH برابر با 3، 3/335 درصد نسبتبه نمونه کراتین هیدولیز شده پایدارتر است. همچنینs -کراتین کربوکسیمتیل 19/81 درصد و s- سولفوسیستئین کراتین 3/86 درصد در طی 30 روز محتوای پروتئینی خود را حفظ کرده و دارای حلالیت بیشتر بوده‌اند. با توجهبه نتایج DLS پراکندگی ذرات در دو روش سولفیدولیز و آلکیلاسیون بهترتیب 475/0 و 476/0 ، دارای اندازه متوسط ذرات بهترتیب 2/136 و 3/157 نانومتر است در مقابل کراتین هیدولیز شده با پراکندگی ذرات552/0 و اندازه متوسط 3/990 نانومتر. کمتر بودن پراکندگی ذرات نشاندهنده مهار فرآیند اگریگاسیون و تجمع ذرات پروتئین در نمونه‌های اصلاح شده است. نتایج FTIR نشاندهنده وجود گروه‌های عاملی قابل انتظار در هر دو روش اصلاح شیمیایی است. همچنین بررسی حلالیت حاکی از حلالت s-کراتین کربوکسی متیل و s- سولفوسیستئین کراتین در آب تا غلظت g/l100 در دمای محیط است. پیشنهاد می‌شود که بر روی کراتین پایدار شده تستهای حساسیت انسانی بهمنظور استفاده در مواد آرایشی بهداشتی انجام شود.
سپاسگزاری
نویسندگان از کلیه همکاران و مسئول آزمایشگاه بیوتکنولوژی که در انجام این تحقیق همکاری کردند و همچنین از پژوهشگاه رنگ تهران، جهت انجام تستهای تکمیلی این پژوهش کمال تشکر را دارند.
منابع
1. Jacob S, Shirwaikar A, Srinivasan K, Alex J, Prabu S, Mahalaxmi R, et al. Stability of proteins in aqueous solution and solid state. Indian J. Pharm. Sci. 2006 68(2).
2. e Silva ACS, Silveira JN. Correlation between the degree of hydrolysis and the peptide profile of whey protein concentrate hydrolysates: effect of the enzyme type and reaction time. Am J Food Technol. 2013 8(1):1-16.
3. Mokrejš P, Huťťa M, Pavlačková J, Egner P. Preparation of keratin hydrolysate from chicken feathers and its application in cosmetics. JoVE. 2017 (129):e56254.
4. Gromiha MM. Protein bioinformatics: from sequence to function.1nd ed. academic press; 2010.
5. Dhillon GS. Protein byproducts: transformation from environmental burden into value-added products.2nd ed. Academic Press; 2017.
6. Schrooyen PM, Dijkstra PJ, Oberthür RC, Bantjes A, Feijen J. Stabilization of solutions of feather keratins by sodium dodecyl sulfate. J Colloid and Interface Sci. 2001 240(1):30-9.
7. Laba W, Zarowska B, Chorazyk D, Pudlo A, Piegza M, Kancelista A, Kopec W. New keratinolytic bacteria in valorization of chicken feather waste. AMB Exprees. 2018 8(1):9.
8. Kamarudin NB, Sharma S, Gupta A, Kee CG, Chik SMSBT, Gupta R. Statistical investigation of extraction parameters of keratin from chicken feather using Design-Expert. 3 Biotech. 2017 7(2):127.
9. Staroń P, Banach M, Kowalski Z, Staroń A. Hydrolysis of keratin materials derived from poultry industry. PECO. 2014 8(2).
10. Krejci O, Mokrejs P, Sukop S, editors. Preparation and characterization of keratin hydrolysates. Mathematical Methods and Techniques in Engineering and Environmentyal Science: Proceedings of the 13th WSEAS International Conference on Mathematical and Computational Methods in Science and Engineering. 2011.
11. Navone L, Speight R. Understanding the dynamics of keratin weakening and hydrolysis by proteases. PLOS ONE. 2018 13(8):e0202608.
12. Bragulla HH, Homberger DG. Structure and functions of keratin proteins in simple, stratified, keratinized and cornified epithelia. J.Anat. 2009 214(4):516-59.
13. Sinkiewicz I, Śliwińska A, Staroszczyk H, Kołodziejska I. Alternative methods of preparation of soluble keratin from chicken feathers. Waste and biomass valorization. 2017 8(4):1043-8.
14. Karthikeyan R, Balaji S, Sehgal P. Industrial applications of keratins–A review. J SCI IND RES INDIA. 2007 6(9):710-715.
15. Shortle D. Denatured states of proteins and their roles in folding and stability. COSB. 1993 3(1):66-74.
16. Tanford C. Protein denaturation. Adv protein chem. 1968.24(1). p. 121-282.
17. Zapadka KL, Becher FJ, Gomes Dos Santos A, Jackson SE. Factors affecting the physical stability (aggregation) of peptide therapeutics. Interface Focus. 2017 7(6):20170030.
18. Hovgaard L, Frokjaer S, van de Weert M. Pharmaceutical formulation development of peptides and proteins: CRC Press; 2012.
19. Fraser R, MacRae T, Parry D, Suzuki E. The structure of feather keratin. Polymer. 197 12(1):35-56.
20. Arai Km, Takahashi R, Yokote Y, Akahane K. Amino‐acid sequence of feather keratin from fowl. Eur J Biochem. 1983 32(3):501-7.(ARAI, 1983 #44)
21. Lee B, Vasmatzis G. Stabilization of protein structures. COSB. 1997 8(4):423-8.
22. Umeda K, Nadachi Y, Sakai K, Nogami Y, Sudo M. Water-soluble keratin derivative and use thereof. Google Patents. 2005.
23. Franks F. Protein biotechnology: isolation, characterization, and stabilization. The Humana Press Inc. 1993.
24. Spicer CD, Davis BG. Selective chemical protein modification. Nat commun. 2014 5(1):1-14.
25. Schrooyen PM, Dijkstra PJ, Oberthür RC, Bantjes A, Feijen J. Partially carboxymethylated feather keratins. 2. Thermal and mechanical properties of films. J. Agric. food chem. 2001 49(1):221-30.
26. Boutureira O, Bernardes GJ. Advances in chemical protein modification. J. Chem. Rev. 2015 115(5):2174-95.
27. Trivedi MV, Laurence JS, Siahaan TJ. The role of thiols and disulfides on protein stability. COSB. 2009 10(6):614-25.
28. Hirs CH. (20) Reduction and S-carboxymethylation of proteins. In Methods in enzymology. 3nd ed. Academic Press 1967. p. 199-203.
29. Aćimović JM, Stanimirović BD, Mandić LM. The role of the thiol group in protein modification with methylglyoxal. JSCS. 2009 74(8-9):867-83.
30. Chalker JM, Bernardes GJ, Lin YA, Davis BG. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. ACES. 2009 4(5):630-40.
31. Schrooyen PM, Dijkstra PJ, Oberthür RC, Bantjes A, Feijen J. Partially carboxymethylated feather keratins. 1. Properties in aqueous systems. J. Agric. food chem. 2000 8;48(9):4326-34.
32. Wynn R, Richards FM. (33) Chemical modification of protein thiols: Formation of mixed disulfides. Methods in Enzymology.1nd ed. Academic Press. 1995 1;25(1):351-6.
33. Cole RD. (22) Sulfitolysis. InMethods in Enzymology. Academic Press. 1967 (11), p. 206-208).
34. Work E, Work TS. Chemical modification of proteins. Elsevier; 1976.
35. Rothenbuhler E, Kinsella J. The pH-Stat method for assessing protein digestibility: an evaluation. J. Agric. Food chem. 1985 33(3),433-438.
37. Crestfield AM, Moore S, Stein WH. The preparation and enzymatic hydrolysis of reduced and S-carboxymethylated proteins. JBC.1963 238(2):622-7.
38. Walker JM, editor. The protein protocols handbook. Springer Science & Business Media; 1996.
39. Riddles PW, Blakeley RL, Zerner B. Ellman's reagent: 5, 5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)—a reexamination. Anal. biochem. 1979 94(1):75-81.
40. Habeeb AF. (37) Reaction of protein sulfhydryl groups with Ellman's reagent. In Methods in enzymology. Academic Press.1972. 25, p. 457-464.
41. Buchner J, Kiefhaber T, editors. Protein folding handbook. Weinheim: Wiley-VCH; 2005.
42. Barth A. Infrared spectroscopy of proteins. BBA. 2007 1;1767(9):1073-101.
43. Lorber B, Fischer F, Bailly M, Roy H, Kern D. Protein analysis by dynamic light scattering: Methods and techniques for students. BAMBEd. 2012 40(6):372-82.
44. Rajabinejad H, Zoccola M, Patrucco A, Montarsolo A, Rovero G, Tonin C. Physicochemical properties of keratin extracted from wool by various methods. SAGE Journal. 2018 8(21):2415-24.
45. Prayitno P, Rahmawati D, Griyanitasari G. Sheep wool-derived hydrolyzed keratin from tannery waste of the tanning industry using perhydrol. MKKP. 2017 33(2):73-8.
46. Sharma S, Gupta A, Chik SM, Kee CY, Podder PK, Subramaniam M, Thuraisingam J. Study of different treatment methods on chicken feather biomass. IIUM Engineering Journal. 2017 18(2):47-55.
47. Khosa MA, Wu J, Ullah A. Chemical modification, characterization, and application of chicken feathers as novel biosorbents. Rsc Advances. 2013 3(43):20800-10.
48. Ikkai F, Naito S. Dynamic light scattering and circular dichroism studies on heat-induced gelation of hard-keratin protein aqueous solutions. Biomacromolecules. 2002 3(3):482-7.
2. e Silva ACS, Silveira JN. Correlation between the degree of hydrolysis and the peptide profile of whey protein concentrate hydrolysates: effect of the enzyme type and reaction time. Am J Food Technol. 2013 8(1):1-16.
3. Mokrejš P, Huťťa M, Pavlačková J, Egner P. Preparation of keratin hydrolysate from chicken feathers and its application in cosmetics. JoVE. 2017 (129):e56254.
4. Gromiha MM. Protein bioinformatics: from sequence to function.1nd ed. academic press; 2010.
5. Dhillon GS. Protein byproducts: transformation from environmental burden into value-added products.2nd ed. Academic Press; 2017.
6. Schrooyen PM, Dijkstra PJ, Oberthür RC, Bantjes A, Feijen J. Stabilization of solutions of feather keratins by sodium dodecyl sulfate. J Colloid and Interface Sci. 2001 240(1):30-9.
7. Laba W, Zarowska B, Chorazyk D, Pudlo A, Piegza M, Kancelista A, Kopec W. New keratinolytic bacteria in valorization of chicken feather waste. AMB Exprees. 2018 8(1):9.
8. Kamarudin NB, Sharma S, Gupta A, Kee CG, Chik SMSBT, Gupta R. Statistical investigation of extraction parameters of keratin from chicken feather using Design-Expert. 3 Biotech. 2017 7(2):127.
9. Staroń P, Banach M, Kowalski Z, Staroń A. Hydrolysis of keratin materials derived from poultry industry. PECO. 2014 8(2).
10. Krejci O, Mokrejs P, Sukop S, editors. Preparation and characterization of keratin hydrolysates. Mathematical Methods and Techniques in Engineering and Environmentyal Science: Proceedings of the 13th WSEAS International Conference on Mathematical and Computational Methods in Science and Engineering. 2011.
11. Navone L, Speight R. Understanding the dynamics of keratin weakening and hydrolysis by proteases. PLOS ONE. 2018 13(8):e0202608.
12. Bragulla HH, Homberger DG. Structure and functions of keratin proteins in simple, stratified, keratinized and cornified epithelia. J.Anat. 2009 214(4):516-59.
13. Sinkiewicz I, Śliwińska A, Staroszczyk H, Kołodziejska I. Alternative methods of preparation of soluble keratin from chicken feathers. Waste and biomass valorization. 2017 8(4):1043-8.
14. Karthikeyan R, Balaji S, Sehgal P. Industrial applications of keratins–A review. J SCI IND RES INDIA. 2007 6(9):710-715.
15. Shortle D. Denatured states of proteins and their roles in folding and stability. COSB. 1993 3(1):66-74.
16. Tanford C. Protein denaturation. Adv protein chem. 1968.24(1). p. 121-282.
17. Zapadka KL, Becher FJ, Gomes Dos Santos A, Jackson SE. Factors affecting the physical stability (aggregation) of peptide therapeutics. Interface Focus. 2017 7(6):20170030.
18. Hovgaard L, Frokjaer S, van de Weert M. Pharmaceutical formulation development of peptides and proteins: CRC Press; 2012.
19. Fraser R, MacRae T, Parry D, Suzuki E. The structure of feather keratin. Polymer. 197 12(1):35-56.
20. Arai Km, Takahashi R, Yokote Y, Akahane K. Amino‐acid sequence of feather keratin from fowl. Eur J Biochem. 1983 32(3):501-7.(ARAI, 1983 #44)
21. Lee B, Vasmatzis G. Stabilization of protein structures. COSB. 1997 8(4):423-8.
22. Umeda K, Nadachi Y, Sakai K, Nogami Y, Sudo M. Water-soluble keratin derivative and use thereof. Google Patents. 2005.
23. Franks F. Protein biotechnology: isolation, characterization, and stabilization. The Humana Press Inc. 1993.
24. Spicer CD, Davis BG. Selective chemical protein modification. Nat commun. 2014 5(1):1-14.
25. Schrooyen PM, Dijkstra PJ, Oberthür RC, Bantjes A, Feijen J. Partially carboxymethylated feather keratins. 2. Thermal and mechanical properties of films. J. Agric. food chem. 2001 49(1):221-30.
26. Boutureira O, Bernardes GJ. Advances in chemical protein modification. J. Chem. Rev. 2015 115(5):2174-95.
27. Trivedi MV, Laurence JS, Siahaan TJ. The role of thiols and disulfides on protein stability. COSB. 2009 10(6):614-25.
28. Hirs CH. (20) Reduction and S-carboxymethylation of proteins. In Methods in enzymology. 3nd ed. Academic Press 1967. p. 199-203.
29. Aćimović JM, Stanimirović BD, Mandić LM. The role of the thiol group in protein modification with methylglyoxal. JSCS. 2009 74(8-9):867-83.
30. Chalker JM, Bernardes GJ, Lin YA, Davis BG. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. ACES. 2009 4(5):630-40.
31. Schrooyen PM, Dijkstra PJ, Oberthür RC, Bantjes A, Feijen J. Partially carboxymethylated feather keratins. 1. Properties in aqueous systems. J. Agric. food chem. 2000 8;48(9):4326-34.
32. Wynn R, Richards FM. (33) Chemical modification of protein thiols: Formation of mixed disulfides. Methods in Enzymology.1nd ed. Academic Press. 1995 1;25(1):351-6.
33. Cole RD. (22) Sulfitolysis. InMethods in Enzymology. Academic Press. 1967 (11), p. 206-208).
34. Work E, Work TS. Chemical modification of proteins. Elsevier; 1976.
35. Rothenbuhler E, Kinsella J. The pH-Stat method for assessing protein digestibility: an evaluation. J. Agric. Food chem. 1985 33(3),433-438.
37. Crestfield AM, Moore S, Stein WH. The preparation and enzymatic hydrolysis of reduced and S-carboxymethylated proteins. JBC.1963 238(2):622-7.
38. Walker JM, editor. The protein protocols handbook. Springer Science & Business Media; 1996.
39. Riddles PW, Blakeley RL, Zerner B. Ellman's reagent: 5, 5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)—a reexamination. Anal. biochem. 1979 94(1):75-81.
40. Habeeb AF. (37) Reaction of protein sulfhydryl groups with Ellman's reagent. In Methods in enzymology. Academic Press.1972. 25, p. 457-464.
41. Buchner J, Kiefhaber T, editors. Protein folding handbook. Weinheim: Wiley-VCH; 2005.
42. Barth A. Infrared spectroscopy of proteins. BBA. 2007 1;1767(9):1073-101.
43. Lorber B, Fischer F, Bailly M, Roy H, Kern D. Protein analysis by dynamic light scattering: Methods and techniques for students. BAMBEd. 2012 40(6):372-82.
44. Rajabinejad H, Zoccola M, Patrucco A, Montarsolo A, Rovero G, Tonin C. Physicochemical properties of keratin extracted from wool by various methods. SAGE Journal. 2018 8(21):2415-24.
45. Prayitno P, Rahmawati D, Griyanitasari G. Sheep wool-derived hydrolyzed keratin from tannery waste of the tanning industry using perhydrol. MKKP. 2017 33(2):73-8.
46. Sharma S, Gupta A, Chik SM, Kee CY, Podder PK, Subramaniam M, Thuraisingam J. Study of different treatment methods on chicken feather biomass. IIUM Engineering Journal. 2017 18(2):47-55.
47. Khosa MA, Wu J, Ullah A. Chemical modification, characterization, and application of chicken feathers as novel biosorbents. Rsc Advances. 2013 3(43):20800-10.
48. Ikkai F, Naito S. Dynamic light scattering and circular dichroism studies on heat-induced gelation of hard-keratin protein aqueous solutions. Biomacromolecules. 2002 3(3):482-7.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشی |
موضوع مقاله:
سلولی و مولکولی
دریافت: 1399/9/30 | پذیرش: 1399/9/10 | انتشار: 1399/9/10
دریافت: 1399/9/30 | پذیرش: 1399/9/10 | انتشار: 1399/9/10
فهرست منابع
1. Jacob S, Shirwaikar A, Srinivasan K, Alex J, Prabu S, Mahalaxmi R, et al. Stability of proteins in aqueous solution and solid state. Indian J. Pharm. Sci. 2006 68(2).
2. e Silva ACS, Silveira JN. Correlation between the degree of hydrolysis and the peptide profile of whey protein concentrate hydrolysates: effect of the enzyme type and reaction time. Am J Food Technol. 2013 8(1):1-16.
3. Mokrejš P, Huťťa M, Pavlačková J, Egner P. Preparation of keratin hydrolysate from chicken feathers and its application in cosmetics. JoVE. 2017 (129):e56254.
4. Gromiha MM. Protein bioinformatics: from sequence to function.1nd ed. academic press; 2010.
5. Dhillon GS. Protein byproducts: transformation from environmental burden into value-added products.2nd ed. Academic Press; 2017.
6. Schrooyen PM, Dijkstra PJ, Oberthür RC, Bantjes A, Feijen J. Stabilization of solutions of feather keratins by sodium dodecyl sulfate. J Colloid and Interface Sci. 2001 240(1):30-9.
7. Laba W, Zarowska B, Chorazyk D, Pudlo A, Piegza M, Kancelista A, Kopec W. New keratinolytic bacteria in valorization of chicken feather waste. AMB Exprees. 2018 8(1):9.
8. Kamarudin NB, Sharma S, Gupta A, Kee CG, Chik SMSBT, Gupta R. Statistical investigation of extraction parameters of keratin from chicken feather using Design-Expert. 3 Biotech. 2017 7(2):127.
9. Staroń P, Banach M, Kowalski Z, Staroń A. Hydrolysis of keratin materials derived from poultry industry. PECO. 2014 8(2).
10. Krejci O, Mokrejs P, Sukop S, editors. Preparation and characterization of keratin hydrolysates. Mathematical Methods and Techniques in Engineering and Environmentyal Science: Proceedings of the 13th WSEAS International Conference on Mathematical and Computational Methods in Science and Engineering. 2011.
11. Navone L, Speight R. Understanding the dynamics of keratin weakening and hydrolysis by proteases. PLOS ONE. 2018 13(8):e0202608.
12. Bragulla HH, Homberger DG. Structure and functions of keratin proteins in simple, stratified, keratinized and cornified epithelia. J.Anat. 2009 214(4):516-59.
13. Sinkiewicz I, Śliwińska A, Staroszczyk H, Kołodziejska I. Alternative methods of preparation of soluble keratin from chicken feathers. Waste and biomass valorization. 2017 8(4):1043-8.
14. Karthikeyan R, Balaji S, Sehgal P. Industrial applications of keratins–A review. J SCI IND RES INDIA. 2007 6(9):710-715.
15. Shortle D. Denatured states of proteins and their roles in folding and stability. COSB. 1993 3(1):66-74.
16. Tanford C. Protein denaturation. Adv protein chem. 1968.24(1). p. 121-282.
17. Zapadka KL, Becher FJ, Gomes Dos Santos A, Jackson SE. Factors affecting the physical stability (aggregation) of peptide therapeutics. Interface Focus. 2017 7(6):20170030.
18. Hovgaard L, Frokjaer S, van de Weert M. Pharmaceutical formulation development of peptides and proteins: CRC Press; 2012.
19. Fraser R, MacRae T, Parry D, Suzuki E. The structure of feather keratin. Polymer. 197 12(1):35-56.
20. Arai Km, Takahashi R, Yokote Y, Akahane K. Amino‐acid sequence of feather keratin from fowl. Eur J Biochem. 1983 32(3):501-7.
21. Lee B, Vasmatzis G. Stabilization of protein structures. COSB. 1997 8(4):423-8.
22. Umeda K, Nadachi Y, Sakai K, Nogami Y, Sudo M. Water-soluble keratin derivative and use thereof. Google Patents. 2005.
23. Franks F. Protein biotechnology: isolation, characterization, and stabilization. The Humana Press Inc. 1993.
24. Spicer CD, Davis BG. Selective chemical protein modification. Nat commun. 2014 5(1):1-14.
25. Schrooyen PM, Dijkstra PJ, Oberthür RC, Bantjes A, Feijen J. Partially carboxymethylated feather keratins. 2. Thermal and mechanical properties of films. J. Agric. food chem. 2001 49(1):221-30.
26. Boutureira O, Bernardes GJ. Advances in chemical protein modification. J. Chem. Rev. 2015 115(5):2174-95.
27. Trivedi MV, Laurence JS, Siahaan TJ. The role of thiols and disulfides on protein stability. COSB. 2009 10(6):614-25.
28. Hirs CH. (20) Reduction and S-carboxymethylation of proteins. In Methods in enzymology. 3nd ed. Academic Press 1967. p. 199-203.
29. Aćimović JM, Stanimirović BD, Mandić LM. The role of the thiol group in protein modification with methylglyoxal. JSCS. 2009 74(8-9):867-83.
30. Chalker JM, Bernardes GJ, Lin YA, Davis BG. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. ACES. 2009 4(5):630-40.
31. Schrooyen PM, Dijkstra PJ, Oberthür RC, Bantjes A, Feijen J. Partially carboxymethylated feather keratins. 1. Properties in aqueous systems. J. Agric. food chem. 2000 8;48(9):4326-34.
32. Wynn R, Richards FM. (33) Chemical modification of protein thiols: Formation of mixed disulfides. Methods in Enzymology.1nd ed. Academic Press. 1995 1;25(1):351-6.
33. Cole RD. (22) Sulfitolysis. InMethods in Enzymology. Academic Press. 1967 (11), p. 206-208).
34. Work E, Work TS. Chemical modification of proteins. Elsevier; 1976.
35. Rothenbuhler E, Kinsella J. The pH-Stat method for assessing protein digestibility: an evaluation. J. Agric. Food chem. 1985 33(3),433-438.
36. Crestfield AM, Moore S, Stein WH. The preparation and enzymatic hydrolysis of reduced and S-carboxymethylated proteins. JBC.1963 238(2):622-7.
37. Walker JM, editor. The protein protocols handbook. Springer Science & Business Media; 1996.
38. Riddles PW, Blakeley RL, Zerner B. Ellman's reagent: 5, 5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)—a reexamination. Anal. biochem. 1979 94(1):75-81.
39. Habeeb AF. (37) Reaction of protein sulfhydryl groups with Ellman's reagent. In Methods in enzymology. Academic Press.1972. 25, p. 457-464.
40. Buchner J, Kiefhaber T, editors. Protein folding handbook. Weinheim: Wiley-VCH; 2005.
41. Barth A. Infrared spectroscopy of proteins. BBA. 2007 1;1767(9):1073-101.
42. Lorber B, Fischer F, Bailly M, Roy H, Kern D. Protein analysis by dynamic light scattering: Methods and techniques for students. BAMBEd. 2012 40(6):372-82.
43. Rajabinejad H, Zoccola M, Patrucco A, Montarsolo A, Rovero G, Tonin C. Physicochemical properties of keratin extracted from wool by various methods. SAGE Journal. 2018 8(21):2415-24.
44. Prayitno P, Rahmawati D, Griyanitasari G. Sheep wool-derived hydrolyzed keratin from tannery waste of the tanning industry using perhydrol. MKKP. 2017 33(2):73-8.
45. Sharma S, Gupta A, Chik SM, Kee CY, Podder PK, Subramaniam M, Thuraisingam J. Study of different treatment methods on chicken feather biomass. IIUM Engineering Journal. 2017 18(2):47-55.
46. Khosa MA, Wu J, Ullah A. Chemical modification, characterization, and application of chicken feathers as novel biosorbents. Rsc Advances. 2013 3(43):20800-10.
47. Ikkai F, Naito S. Dynamic light scattering and circular dichroism studies on heat-induced gelation of hard-keratin protein aqueous solutions. Biomacromolecules. 2002 3(3):482-7.
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
