بررسی مکانیسم­های مولکولی در مهار عملکرد پروتئین­های

 Spike، Protease اصلی و Papain like protease

در کروناویروس با استفاده از شبیه­سازی و داکینگ

سیمین بهمن­پور ، دکتر نوشا ضیاء جهرمی^*

گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران

چکیده

سابقه و هدف: کروناویروس عامل بیماری پنومونی عفونی COVID-19 است که در سال 2020 سازمان بهداشت جهانی آن را به­عنوان یک همه­گیری جهانی معرفی کرد. با توجه به این­که تاکنون مکانیسم­های مهاری آن به­خوبی مشخص نشده است در این مقاله برآن شدیم تا به بررسی مکانیسم­های مولکولی در مهار عملکرد پروتئین­های Spike، Protease اصلی و Papain like protease در کروناویروس بپردازیم.

مواد و روش­ ها: در پژوهش حاضر کلیه محاسبات توسط نرم­ افزار (2013) AutoDock 4.2، (2013)  AutoDockTools 4.2 و Cluspro2.0 (2017) انجام شد. الگوریتم ژنتیک لامارک برای جستجوی سطح پروتئین مورد استفاده قرار گرفت و در هر یک از مدل­های داکینگ تعداد 200 اجرا گذاشته شد. در نهایت برهم­کنش اتصال پروتئین و ترکیب­های مهارکننده و اتصال­های هیدروژنی و هیدروفوبی توسط نرم­افزار Poseview و DIMPLOT محاسبه شد.

یافته ­ها: بررسی برهم­کنش­ها حاکی از آن بود که اسیدآمینه­ های His163، His164، Gln189، Glu166، Cys145 و Phe140 به­واسطه پیوندهای هیدروژنی نقش کلیدی در برهم­کنش مهارکننده GC-376 با پروتئین Mpro دارند. هم­چنین بررسی انرژی اتصال ترکیب مهارکننده به پروتئین نشان می­دهد که این ترکیب با انرژی اتصال 36/6- کیلوکالری بر مول به مهارکننده متصل شده است. نتایج داکینگ کمپلکس PLpro حاکی از آن بود که اسیدآمینه­های Tyr268، Gln269، و Asp164 به­واسطه پیوندهای هیدروژنی نقش کلیدی در برهم­کنش مهارکننده GRL0617 با پروتئین PLpro دارند و انرژی اتصال ترکیب مهارکننده به پروتئین PLpro برابر با 69/9- بود. در نهایت بررسی برهم­کنش­های پروتئین Spike و پپتیدLCB1  با استفاده از نرم­افزارهای Cluspro و DIMPLOT نشان داد که برهم­کنش­های متعدد هیدروفوبی و قطبی بین اسیدآمینه­های مختلف این دو ترکیب وجود دارد که از جمله مهم­ترین آن­ها می­توان به برهم­کنش اسیدآمینه Tyr489 در پروتئین Spike با اسیدآمینه­های Leu6 و Gln7 در پپتید مهار کننده اشاره کرد.

نتیجه-گیری: نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که ترکیب­های مهارکننده ارائه شده در این مقاله می­توانند به­خوبی به­واسطه برهم­کنش­های قطبی و هیدروفوبی موجب مهار پروتئین­های حیاتی مهم در کروناویروس گردند.

واژه­ های کلیدی: کرونا ویروس، پروتئاز اصلی، پروتئین Spike، پروتئین Papain like protease.

مقدمه

کروناویروس به­عنوان عامل ایجاد کننده مشکلات تنفسی در انسان و جانوران خانگی شناخته شده است. بر طبق اولین مطالعه­های انجام شده بر روی بیماران مبتلا به کروناویروس

کردند (2). این ویروس یک ویروس پوشش­دار با ژنومی از نوع ریبونوکلئیک­اسید است که طول آن حدود 8/29 کیلو باز است (3). این ویروس واجد زوائد پروتئینی روی غشاء بوده و متشکل از پلی­پروتئین­ها، نوکلئوپروتئین­ها و پروتئین­های غشایی از قبیل پلی­مرازها، پروتئازها، هلیکس­ها و پروتئین­های کمکی دیگر است (4). عفونت با کروناویروس جدید در مرحله اول با علائم غیراختصاصی و کلی نظیر احساس کسالت، خستگی و بدون درد، تب و سرفه خشک همراه است. بیماران کمی قبل از تب ممکن است در ابتدا علائمی مانند تهوع و اسهال داشته باشند. به­طور کلی شدت بیماری به 4 گروه خفیف، متوسط، شدید و وخیم تقسیم می­شود (5).

تشخیص کروناویروس متکی به یافته­های رادیولوژیکی و آزمایشگاهی است. بررسی­های رادیولوژیکی اهمیت فوق­العاده در اوایل تشخیص بیماری و مدیریت بیماری دارند. مشخصه برجسته تصاویر رادیولوژیکی در بیمارانی که به پنومونی شدید کروناویروسی مبتلا شده­اند شامل نمای شیشه مات و تراکم ریه است که می­تواند هر دو ریه را درگیر کند (8-6).

در انتهای بخش ˈ3  ژنوم کروناویروس چهار پروتئین ساختمانی وجود دارد که شامل پروتئین اسپایک (spike)، پروتئین پوششی، پروتئین غشایی، پروتئین نوکلئوکپسید است. هم­چنین در انتهای این بخش هشت پروتئین فرعی وجود دارد که شامل p6، 3a، 7a، 3b، 7b، 8b، 9b و orf14 است. پروتئین اسپایک یک گلیکوپروتئین ترانس ممبر نوع یک است که ویروس هنگام ورود به بدن انسان با اتصال به گیرنده­های آنزیم مبدل آنژیوتانسین 2 وارد سلول­های هدف در مجرای تنفسی فوقانی شده و می­تواند در 4 درصد موارد منجر به سندرم دیسترس حاد تنفسی شود. 20 تا 30 درصد بیماران نیاز به درمان بیمارستانی داشته و حدود 50 درصد از افراد پس از ابتلا علامتی نشان نمی­دهند. پیوستگی قابل توجه میان کروناویروس و این گیرنده نشان می­دهد جمعیت­هایی که بیان آنزیم مبدل آنژیوتانسین 2 در آن­ها بالاتر است در برابر این ویروس آسیب­پذیرتر هستند (9). پروتئین اسپایک از دو زیرواحد S1 و S2 تشکیل شده است. زیرواحد S1 گیرنده سلولی را از طریق دامنه اتصال دهنده گیرنده آن متصل می­کند و به­دنبال آن تغییرهای کنفورماسیونی در زیر واحد  S2 به پپتید فیوژن اجازه می­دهد تا درون غشای سلول هدف قرار داده شود (12-10).

آنزیم ضروری در چرخه زندگی ویروس­های RNA، PLpro  (Papain like protease)  است و کروناویروس را در بر می­گیرد. PLpro یک پروتئاز سیستئین چند منظوره است که با هیدرولیز پیوندهای پپتید و ایزوپپتید در بسترهای ویروسی و سلولی منجر به تکثیر ویروس می­شود. در ویروس­های مختلف کرونا ویروس از جملهSARS ، MERS  وHCV ،PLpro جود دارد (15-13). پروتئازها به ویژه Mpro (Main Protease)، نقشی حیاتی در چرخه زندگی ویروس­های کرونا دارند. Mpro سه دامنه شامل I، II و III است. Mpro یک همودایمر است که حاوی دو پروتومر است و در میان ویروس­های کرونا محافظت می­شود و چندین ویژگی مشترک بین لایه­های Mpro در ویروس­های مختلف کرونا وجود دارد. این پروتئاز هم­چنین نقش مهمی که در مسیر پروتئولیتیک ایفا می­کند و آن را به جذاب­ترین هدف دارویی برای طراحی داروهای ضد CoV تبدیل می­کند و از آنجا که Mpro فاقد همولوگ انسانی است یک هدف ضدویروسی ایده­آل است به­شمار می­آید (18-16).

با توجه­به این­که تاکنون مکانیسم­های مولکولی در مهار عملکرد پروتئین­های کروناویروس به­خوبی مشخص نشده است در این مقاله برآن شدیم تا به بررسی مکانیسم­های مهاری پروتئین­های Spike، Protease اصلی و Papain like protease در کروناویروس بپردازیم.

روش کار

روش داکینگ

کلیه محاسبات داکینگ در این پروژه توسط نرم­افزار AutoDock 4.2 و  AutoDockTools 4.2 انجام شد. الگوریتم ژنتیک لامارک برای جستجوی سطح پروتئین و انجام داکینگ مورد استفاده قرار گرفت. هم­چنین در هر یک از مدل­های داکینگ تعداد 200 اجرا گذاشته شد که در آن فاکتور جمعیت اولیه­ در جستجو بر پایه الگوریتم ژنتیک برابر 150 بود و در مجموع 27 هزار ساختار برای محاسبات ساخته شد (19). در نهایت برهم­کنش اتصال پروتئین و ترکیب­های مهارکننده و اتصال­های هیدروژنی و هیدروفوبی توسط نرم­افزار Poseview و DIMPLOT محاسبه شد.

آماده­سازی ساختار پروتئین­ها

برای آماده­سازی ساختار پروتئین Mpro، ساختار با کد دسترسی 6WTT (20) از پایگاه اطلاعاتی پروتئینPDB  (www.pdb.org) دریافت شد. هم-چنین ساختار پروتئین Spike با کد 7JZL (21) و ساختار پروتئین PLpro نیز با کد 7CMD (22) از پایگاه اطلاعاتی پروتئین گفته شد. ساختار مهارکننده برای این پروتئین­ها از مقالات (22-20) استفاده گردید.

محاسبه بارهای جزئی و حالت­های چرخش برای مهارکننده

در تحقیق حاضر برای محاسبه بارهای جزئی و حالت­های چرخش مهارکننده از نرم­افزار AutoDockTools 4.2 (2013) استفاده شد. در این راستا برای محاسبه بارهای جزئی پروتئین و مهارکننده روش بار Gasteiger مورد استفاده قرار گرفت.

محاسبه شبکه انرژی در اطراف پروتئین

در تحقیق حاضر برای محاسبه شبکه انرژی در اطراف پروتئین اندازه شبکه به­صورتی تعیین شد که جایگاه فعال پروتئین در داخل آن قرار بگیرد. در این راستا شبکه دارای ابعاد 60×60 ×60 با فاصله 375/0 آنگستروم برای هر دو نقطه در اطراف پروتئین طراحی شده و با استفاده از نرم­افزار (2013) Autogrid 4.2 انرژی پتانسیل سطحی درون این شبکه محاسبه شد.

تعیین الگوریتم جستجوی سطح پروتئین و انجام داکینگ نهایی

برای تعیین الگوریتم جستجوی سطح پروتئین و انجام داکینگ نهایی سایر پارامترهای مورد نیاز (بارجزئی برای مولکول مهارکننده محاسبه شد، هیدروژن­های غیر یونیزه ادغام گردید و بعد از مشخص کردن مرکز ثقل مولکول تمامی باندهای قابل چرخش تعیین گردید) برای انجام داکینگ تعریف شده و از الگوریتم ژنتیک برای جستجوی سطح پروتئین استفاده شد. در نهایت انرژی اتصال برای حالت­های مختلف اتصال مهارکننده به پروتئین محاسبه شد.

نرم­افزار Cluspro2.0 (2017)

در این تحقیق برای بررسی پروتئین spike و پپتید مهاری LCB1 به­دلیل محدودیت نرم­افزار AutoDock برای محاسبه برهم­کنش پروتئین­ها و پپتیدها از نرم­افزار Cluspro استفاده شد. Cluspro ابزاری است که به­طور گسترده برای برهم­کنش پروتئین –پروتئین مورد استفاده قرار می­گیرد که فایل ورودی مورد نیاز آن نیز با قالب PDB است. هم­چنین دارای تعدادی گزینه­های پیشرفته است که برای تسریع و اصلاح در روند داکینگ می­توان از آن­ها استفاده نمود. این نرم­افزار مرحله محاسباتی را به این صورت انجام می­دهد:

1) مجموعه داکینگ جسم سخت با نمونه­گیری میلیاردها ترکیب

2) خوشه­بندی مبتنی بر انحراف معیار ریشه (RMSD) از هزار ساختار با کم­ترین انرژی تولید شده برای یافتن بزرگ­ترین خوشه­ها که متحمل­ترین مدل­ها از ترکیب را نشان می­دهد

3) پاکسازی ساختارهای انتخاب شده با استفاده از حداقل انرژی در پایان نتایج به­صورت چند پارامتر انرژی به­طور پیش­فرض در 10 مدل برای هر داکینگ اارائه می­شود و دسته­ای که بیش­ترین تعداد جمعیتی و کم­ترین مقدار انرژی را به خود اختصاص داده و بالاترین امتیاز را دارد می­تواند محتمل­ترین ترکیب باشد (23).

نمای اتصال پروتئین و ترکیب­های مهارکننده

برهم­کنش اتصال پروتئین و ترکیب­های مهارکننده و اتصال­های هیدروژنی و هیدروفوبی توسط نرم­افزار Poseview (24) و DIMPLOT 3.1.5 (با استفاده از مدول DIMPLOT نرم­افزار LigPlot) (2014) انجام شد که تصویر دو بعدی از پیوندهای هیدروژن را به­صورت خطوط منقطع بین برهم­کنش­ها نشان می­دهد. هم­چنین  فعل و انفعال­های آبگریز به­عنوان خطوط ممتد بین اسیدهای آمینه مربوطه و مهارکننده نشان داده می­شود.

یافته­ها

نتایج داکینگ کمپلکس Mpro

بررسی برهم­کنش­ها حاکی از آن بود که اسیدآمینه­های His163، His164، Gln189، Glu166، Cys145 و Phe140 به­واسطه پیوندهای هیدروژنی نقش کلیدی در برهم­کنش مهارکننده GC-376 با پروتئین Mpro دارند (شکل 1). از سوی دیگر Ala191، Gln189، Met165 و Pro168 با برهم­کنش­های غیرقطبی با حلقه آروماتیک مهارکننده به اتصال محکم­تر آن به جایگاه فعال آنزیم کمک می­کنند (شکل 1). لازم­به ذکر است که ساختار سه بعدی کمپلکس Mpro و مهارکننده به­همراه جهت­گیری فضایی مهارکننده در درون جایگاه فعال پروتئین در شکل 2 نشان داده شده است.

شکل 1. نمای شماتیک برهم­کنش­ هیدروژونی و هیدروفوبی کمپلکس Mpro و مهارکننده GC-376 (24)

­­­­­­­­

شکل 2. ساختار سه بعدی کمپلکس Mpro و مهارکننده به­همراه جهت­گیری فضایی مهارکننده در درون جایگاه فعال پروتئین. (a) نمای نواری پروتئین و (b) نمای فضا پرکن (تصاویر به کمک نرم­افزار DIMPLOT و Poseview رسم شده است)

بررسی انرژی اتصال ترکیب مهارکننده به پروتئین نشان می­دهد که این ترکیب با انرژی اتصال 36/6- به مهارکننده متصل شده است که سهم­های مختلف انرژی اتصال ترکیب در جدول شماره 1 نشان داده شده است. نتایج حاصل از بررسی برهم­کنش­های اسیدآمینه­ای و انرژی­های اتصال نشان می­دهد که سهم اعظم برهم­کنش­های مهارکننده و پروتئین مربوط به برهم­کنش­های قطبی حاصل از پیوندهای هیدروژنی است. 

جدول 1. انرژی­های به­دست آمده از پروتئین و مهارکننده GC-376 بر حسب کیلوکالری بر مول

نتایج داکینگ کمپلکس PLpro

بررسی برهم­کنش­ها حاکی از آن بود که اسیدآمینه­های Tyr268، Gln269، و Asp164 به­واسطه پیوندهای هیدروژنی نقش کلیدی در برهم­کنش مهار کننده GRL0617 با پروتئین PLpro دارند (شکل 3). از سوی دیگر Gly163، Gln269، Pro247، Tyr264، Pro248، Tyr268 و Asp164 با ایجاد برهم­کنش­های غیرقطبی با حلقه آروماتیک مهارکننده به اتصال محکم­تر آن به جایگاه فعال آنزیم کمک می­کنند (شکل 3). لازم­به ذکر است که ساختار سه بعدی کمپلکس PLpro و مهارکننده به­همراه جهت­گیری فضایی مهارکننده در درون جایگاه فعال پروتئین در شکل 4 نشان داده شده است.

شکل 3. نمای شماتیک برهم­کنش­ هیدروژونی و هیدروفوبی کمپلکس PLpro و مهارکننده GRL0617 با استفاده از نرم­افزار Poseview.

شکل 4. ساختار سه بعدی کمپلکس PLpro و مهارکننده GRL0617 به­همراه جهت­گیری فضایی مهارکننده در درون جایگاه فعال پروتئین. (a) نمای نواری پروتئین و (b) نمای فضا پرکن (تصاویر به کمک نرم­افزار DIMPLOT و Poseview رسم شده است)

بررسی انرژی اتصال ترکیب مهارکننده به پروتئین PLpro نشان می­دهد که این ترکیب با انرژی اتصال 69/9- به مهارکننده GRL0617 متصل شده است که سهم­های مختلف انرژی اتصال ترکیب در جدول شماره 2 نشان داده شده است. نتایج حاصل از بررسی برهم­کنش­های اسیدآمینه­ای و انرژی­های اتصال نشان می­دهد که سهم اعظم برهم­کنش­های مهارکننده و پروتئین PLpro مربوط به برهم­کنش­های قطبی حاصل از پیوندهای هیدروژنی است. 

جدول 2. انرژی­های به­دست آمده از پروتئین و مهارکننده GRL0617 بر حسب کیلو کالری بر مول

نتایج حاصل از پروتئین Spike

در نهایت بررسی برهم­کنش­های پروتئین Spike و ترکیبLCB1  با استفاده از نرم­افزارهای Cluspro و DIMPLOT نشان داد که برهم­کنش­های متعدد هیدروفوبی و قطبی بین اسیدآمینه­های مختلف این دو ترکیب وجود دارد که از جمله مهم­ترین آن­ها می­توان به برهم­کنش اسیدآمینه Tyr489 در پروتئین Spike با اسیدآمینه­های Leu6 و Gln7 در پپتید مهار کننده اشاره کرد. هم­چنین Asn501 و Tyr505 در پروتئین به­ترتیب با Glu23 و Met26 در پپتید برهم­کنش­های قوی ایجاد کرده و در نهایت Leu455 و Tyr453 برهم­کنش مستقیمی با Ser29 داشتند. در شکل 5 برهم­کنش پروتئین Spike و پپتیدLCB1  نشان داده شده است.

شکل 5. در این شکل مهارکننده پپتیدLCB1  به­صورت آلفا هلیکس با رنگ سبز و ساختار Spike با رنگ آبی نشان داده شده است.

بحث

کروناویروس دارای ماده ژنتیکی منحصر به فردی است که می­توان به میزان بالای نوترکیبی ژنتیکی این ویروس اشاره کرد که هرچند سال یک­بار منجر به پدیدار شدن سویه­های جدید و ناشناخته می­شود. دلیل این مقدار بالای نوترکیبی را می­توان به طول بسیار بلند ماده ژنتیکی این ویروس در مقایسه با سایر ویروس­ها، تکثیر پیچیده و میزان بالای خطای آنزیم همانندساز این ویروس و در نهایت، به دامنه میزبانی وسیع این ویروس­ها در انسان­ها و حیوانات مختلف نسبت داد. از این­رو بین ماده ژنتیکی و هوش ویروسی با عقل و هوش انسانی نبردی بسیار سختی برقرار شده است و لازم است تا مکانیسم­های مهاری آن به­خوبی شناسایی و بررسی گردند. بنابراین در این مطالعه مکانیسم­های مهاری پروتئین­های Spike، Protease اصلی و Papain like protease در کروناویروس بررسی شد و نتایج نشان داد که اسیدآمینه­های His163، His164، Gln189، Glu166، Cys145 و Phe140 به­واسطه پیوندهای هیدروژنی نقش کلیدی در برهم­کنش مهارکننده GC-376 با پروتئین Mpro دارند. هم­چنین بررسی انرژی اتصال ترکیب مهارکننده به پروتئین نشان می­دهد که این ترکیب با انرژی اتصال 36/6- به مهارکننده متصل شده است. نتایج داکینگ کمپلکس PLpro حاکی از آن بود که اسیدآمینه­های Tyr268، Gln269، و Asp164 به­واسطه پیوندهای هیدروژنی نقش کلیدی در برهم­کنش مهار کننده با پروتئین PLpro دارند و انرژی اتصال ترکیب مهارکننده GRL0617 به پروتئین PLpro برابر با 69/9- بود. در نهایت بررسی برهم­کنش­های پروتئین Spike و پپتیدLCB1  با استفاده از نرم­افزارهای Cluspro و DIMPLOT نشان داد که برهم­کنش­های متعدد هیدروفوبی و قطبی بین اسیدآمینه­های مختلف این دو ترکیب وجود دارد که از جمله مهم­ترین آن­ها می­توان به برهم­کنش اسیدآمینه Tyr489 در پروتئین Spike با اسیدآمینه­های Leu6 و Gln7 در پپتید مهارکننده اشاره کرد. در راستای ارزیابی نتایج حاصل از این مطالعه بررسی کاملی بر روی مقاله­های علمی انجام گرفت که در ادامه به معرفی تعدادی از مهم­ترین آن­ها می­پردازیم. در سال 2020 Dai و همکاران به بررسی داروهای مهاری بر رو پروتئین Mpro پرداختند و نتایج آن­ها نشان داد که اسیدآمینه­های His163، His164 و Phe140 نقش مهمی در برهم­کنش مهارکننده­های طراحی شده با پروتئین Mpro دارند. (25). در سال 2020 Rut و همکاران به بررسی مهارکننده­های PLpro در کروناویروس پرداختند و نتایج نشان داد که اسیدآمینه­های Gln269 و Asp164 نقش مهمی را در اتصال داروها به این پروتئین دارند (26). هم­چنین در سال 2020 Jin و همکاران به بررسی مهارکننده­های پروتئین PLpro کروناویروس پرداختند و اظهار داشتند که اسیدآمینه­های Gln189، Glu166 و Cys145 نقش مهمی در اتصال مهارکننده به پروتئین دارند (27). در سال 2020 Ma و همکاران به بررسی مهارکننده­های Mpro پرداختند. این دانشمندان اظهار داشتند که Mpro می­تواند نقطه شروع امیدوار کننده­ای برای توسعه و پیشرفت داروهای کروناویروس داشته باشد (20). در سال 2020 Ortega و همکاران Mpro را به­عنوان یک هدف مولکولی در بیماری کروناویروس مورد بررسی قرار دادند و دریافتند که مهارکننده­های Mpro به­عنوان یک رویکرد جدید برای درمان کروناویروس می­تواند مورد بررسی بیش­تر قرار گیرد (28). هم­چنین در سال 2020 Alamiri و همکاران به بررسی مهارکننده­های PLPro با استفاده از روش­های محاسباتی پرداختند. در این بررسی سه ترکیب برای SARS-CoV-2 بررسی که شد که نتایج حاکی از اتصال­های قوی اسیدآمینه Gln189 در پروتئین PLPro با ترکیب­ها بود (29). در سال 2005 Guillen و همکاران اظهار داشتند که پروتئین اسپایک می­تواند به­عنوان یکی از اصلی­ترین پروتئین­های مهاری برای کروناویروس­ها باشد (30).

نتیجه­گیری

نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که ترکیب­های مهارکننده ارائه شده در این مقاله می­توانند به­خوبی به­واسطه برهم­کنش­های قطبی و هیدروفوبی موجب مهار پروتئین­های حیاتی مهم در کروناویروس گردند.

ملاحظه­های اخلاقی

پیروی از اصول اخلاق پژوهش اصول اخلاقی در نگارش مقاله، طبق دستورالعمل کمیته اخلاق کشوری و آیین نامه کپی رعایت شده است.

حامی مالی

این مقاله حامی مالی نداشته است.

مشارکت نویسندگان

تمامی نویسندگان معیارهای استاندارد نویسندگی براساس پیشنهادات کمیته بین‌المللی ناشران مجلات پزشکی را دارا بودند.

تعارض منافع

بدین‌وسیله نویسندگان تصریح می‌کنند که هیچ‌گونه تضاد منافعی در خصوص پژوهش حاضر وجود ندارد.