تکثیر و همسانه سازی ژن سه قسمتی lsc در

 وکتور pcDNA3.1 و بررسی بیان آن در لاین سلولی

سپیده ساروقی¹ ، مریم زارع² ، روح الله کاظمی³ ، جواد معتمدی³ ، جعفر امانی^4*

1- گروه ژنتیک، دانشگاه پیام نور واحد ری، تهران، ایران.

2- گروه زیست­شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه پیام نور تهران، ایران.

3- شرکت ژن سبز، تهران، ایران.

4- انستیتو سیستم بیولوژی و مسمومیت­ها، مرکز تحقیقات میکروبیولوژی کاربردی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله (عج)، تهران، ایران.

چکیده

سابقه‌ و هدف: اسهال دومین عامل رایج مرگ و میر کودکان زیر 5 سال است. مهم­ترین سویه­های بیماری­زایی اشریشیاکلی انتروتوکسیژنیک با تولید سم Lt و St موجب بیماری اسهال مسافران و اشریشیاکلی انتروهموراژیک با ترشح سم شبه شیگا موجب اسهال خونی می­شود. زیرواحد B انتروتوکسین کلره در باکتری ویبریوکلرا در ایجاد بیماری اسهال نقش به­سزایی دارد.به­احتمال با ترکیب اپی-توپ­های CtxB، LtB و StB (LSC) و تولید واکسن تری والان می­توان آنتی­بادی اختصاصی تری برای مقابله با این سموم ایجاد کرد. هدف از این تحقیق تکثیر ژن کایمر lsc جهت کلونینگ در وکتور pcDNA3.1(+) به­منظور طراحی DNA واکسن و بررسی بیان در وکتور یوکاریوتیک است.

مواد و روش­ها: توالی ژن lsc پس از طراحی پرایمر و تکثیر به­وسیله PCR به وکتورpcDNA3.1(+) منتقل شد. وکتور pcDNA3.1(+) و محصول PCR با استفاده از آنزیم HindIII و EcoRI مورد هضم قرار گرفت. کلونینگ ژن lsc در وکتورpcDNA3.1(+) و PCR انجام شد. کلون­ها مورد هضم آنزیمی قرار گرفتند. جهت اطمینان از بیان ژن lsc به سلول HEK-293T منتقل و با استفاده از روش وسترن بلاتینگ مورد تأیید قرار گرفت.

یافته­ها: ژن lsc پس از PCR و کلونینگ در وکتورpcDNA3.1(+) با استفاده از هضم آنزیمی مورد تأیید قرار گرفت و قطعه­ای به­طول  bp933 رویت و تأیید شد. سپس با استفاده از کیت توربوفکت به سلول HEK-293T منتقل و بیان پروتئین نوترکیب به روش وسترن بلاتینگ مورد تأیید قرار گرفت و پروتئین به وزن 39 کیلودالتون تأیید شد.

نتیجه‌گیری: نتایج به­دست آمده از ژن کایمر به­خوبی در لاین سلولی بیان و توسط وسترن بلاتینگ تأیید شد که می­تواند کاندید مناسبی برای مقابله با عفونت باکتریایی باشد.

واژه­های کلیدی: همسانه­سازی، ژن lsc، DNA واکسن، IAU science

کودکان به­طور متوسط ۳ بار در سال اسهال می­گیرند (3). از سال ۲۰۱۲، این بیماری دومین عامل رایج مرگ و میر در کودکان زیر پنج سال در سطح جهان است (11%) (1،4). از میان عوامل باکتریایی مؤثر در بروز عفونت­های روده­ای می­توان به گونه­های مختلف اشریشیاکلی (Escherichia coli)، ویبریو (Vibrio)، کمپیلوباکتر (Campylobacter)، شیگلا(Shigella) و سالمونلا (Salmonella) اشاره کرد (5). در این میان اشریشیاکلی انتروهموراژیک (Entrohemoragic E.coli) و اشریشیاکلی انتروتوکسیژنیک (Entrotoxigenic E.coli) و ویبریوکلرا (Vibrio cholerae) از عوامل عمده و مهم در ایجاد اسهال اندمیک و اپیدمیک از طریق تولید سم در سراسر دنیا هستند (6). در دهه­های اخیر چندین مورد شیوع اشریشیاکلی O157:H7، شایع­ترین سوش اشریشیاکلی انتروهموراژیک (EHEC) در سطح جهان گزارش شده است (7،8). علاوه­بر اشریشیاکلی سالانه کمابیش 3/4-4/1 میلیون مورد ابتلا به کلرا گزارش می­شود که به 28000 تا 142000 مرگ در جهان ختم می­شود (9). اشریشیاکلی یک کوکوباسیل گرم منفی از خانواده انتروباکتریاسه و ساکن روده انسان و حیوان می باشد. این باکتری از طریق مسیر مدفوعی- دهانی از یک فرد به فرد دیگر منتقل می­شود (7). سم کلرا (Ctx) بر روی کروموزوم باکتری قرار دارد. این سم پس از پیدا کردن ساختار سه بعدی صحیح در فضای پری­پلاسمی باکتری، توسط سیستم­های ترشحی غشای خارجی به فضای داخل روده ترشح می­شود (10). سم حساس در برابر حرارت (lt)، توسط باکتری اشریشیاکلی انتروتوکسیژنیک (ETEC) در فضای روده کوچک تولید می­شود و دارای دو زیرواحد A (LtA) و زیرواحد B (LtB) است که  LtB خاصیت اتصال سم به سلول­های روده را برعهده دارد. دو زیرواحد، بعد از سرهم شدن در فضای پری­پلاسمی و تشکیل کل سم، توسط دستگاه ترشحی تیپ دو به بیرون سلول ترشح می­شوند (10). سم شیگا (stx) پس از سر هم شدن از طریق لیز باکتریایی که توسط فاژ القا می­گردد، به محیط آزاد شده و در سطح سلول­های یوکاریوتی مانند سلول­های اندوتلیالی کلیه و رگ­ها به میزان بالایی بیان می­شود (11). این سموم جزء خانواده سموم AB₅ بوده و دارای دو قسمت کاتالیتیکی (زیر واحد A) و متصل شونده به گیرنده (زیرواحد B) هستند (12) که پس از اتصال به غشاء، از طریق اندوسیتوز وارد سلول میزبان شده و از طریق یک مسیر معکوس به شبکه آندوپلاسمی زبر منتقل می­شوند و پس از خروج از آن، بیماری را القا می­کنند (13). هم­چنین وجود هر دو زیر واحد برای ایحاد بیماری­زایی الزامی است (12). اصلی­ترین و عمومی­ترین عامل بیماری و بروز اسهال، سموم  AB₅ تولید شده توسط این باکتری­ها است، ایجاد ایمنی بر علیه این سموم، تا حد زیادی مانع بروز بیماری و مشکلات سیستمیکی که در ادامه بیماری ایجاد می­شوند، خواهد شد. انتخاب قسمت مناسب از سم که علاوه­بر تحریک سیستم ایمنی باعث ایجاد سمیّت در فرد نشود، بسیار حائز اهمیت است. با توجه­به ساختار شرح داده شده سموم  AB₅، بهترین کاندیدای واکسن زیر واحد اتصالی سم یعنی زیر واحد B خواهد بود (14). طیف وسیع تأثیرات سمی این سموم از اسهال خفیف مسافران تا اسهال جدی و گاهی مرگ­آور که توسط ویبریوکلرا و سندرم اورمی همولیتیک که توسط گروه شیگا ایجاد می­شود متغیر است (12). توجه­به این مسئله که یک بار ابتلا به این عفونت­ها در بدن فرد ایجاد مصونیت می­کند (15)، نشان از کارایی واکسیناسیون برای ایجاد ایمنی و پیشگیری از این عفونت­ها است. انتخاب یک کاندید واکسن مناسب که بتواند ایمنی حفاظت کننده­ای علیه این باکتری­ها ایجاد کند، می تواند تضمین کننده کارایی واکسن و سلامت جامعه باشد (16). با توجه­به اهمیت میزان شیوع بیماری اسهال حتی در جوامع توسعه یافته هم­چنین عوارض و درمان در این تحقیق پس از استخراج و تکثیر ژن مورد نظر به بررسی بیان در لاین سلولی پرداخته شد.

مواد و روش­ها

تهیه ژن کایمریک lsc

در این تحقیق از ژن کایمریک که توسط Kazemi و همکاران طراحی شده بود استفاده گردید (17). توالی ژن موردنظر در بانک اطلاعاتی NCBI به شماره دسترسی JX866680 وجود دارد. ژن lsc حاوی ترادف ژن­های ltB ، stxB و ctxB مربوط به سویه­هایEnterotoxigenic E. coli ، Enterohemoragic E. coli و Vibrio cholera است.

تخلیص پلاسمید pET28a-lsc

کلون حاوی پلاسمید  pET28a-lscدر محیط LB مایع دارای آنتی­بیوتیک کانامایسین (µg/ml50) کشت داده و به­مدت 12 ساعت در دمای 37 درجه سانتی­گراد در انکوباتور شیکردار نگهداری شد. به­منظور تخلیص پلاسمید محتویات لوله سانتریفیوژ شد. سپس محلول رویی دور ریخته و از رسوب باقی­مانده جهت استخراج پلاسمید به روش لیز قلیایی از Plasmid DNA Extraction Kit طبق پروتکل شرکت Genet Bio استفاده شد: رسوب انتهایی به­ترتیب در بافر معلق کننده و بافر لیزکننده حل و به آرامی ورتکس گردید. سپس بافر اتصال دهنده اضافه و محلول رویی به آرامی جدا شد.سپس محلول به ستون سیلیس اضافه و سانتریفیوژ شد. هم­چنین بافر شستشو دهنده و بافر استخراج به ستون اضافه و سانتریفیوژ گردید. محلول به­دست آمده که حاوی پلاسمید lsc است بر روی ژل آگارز یک درصد بررسی شد.

تکثیر ژن کایمریک lsc

از پرایمرهای اختصاصی طراحی شده با نرم­افزار oligo 6 جهت تکثیر ژن کایمریک lsc استفاده شد. توالی پرایمر فرادست ATTATAAAGCTTATGGCCCCGCAGAGTATTA دارای جایگاه برش آنزیمی HindIII در ابتدای '5 بود و توالی پرایمر فرودست ACTTACGAATTCTTAGTGATGGTGATGGTGATG دارای جایگاه برش آنزیمی EcoRI در ابتدای '5 طراحی و توسط شرکت سینا کلون سنتز گردید. قابل ذکر است Tm پرایمرها به­ترتیب 7/62 و2/63 درجه سانتی­گراد محاسبه شد. هم­چنین پرایمرها از نظرعدم تشکیل حلقه (primer loop) و جفت شدن (primer Dimer) بررسی شدند. میزان و مواد لازم جهت انجام واکنش PCR شامل: 1 میکرولیتر DNA الگو (50 نانوگرم)، 1میکرولیتر کلرید منیزیم (50 میلی­مولار)، 5/2 میکرولیتر بافر X 10، 5/0 میکرولیتر dNTP (10 میلی­مولار)، 5/0 میکرولیتر پرایمر فرادست ( با غلظت اولیه 10 پیکومول/ میکرولیتر)، 5/0 میکرولیتر پرایمر فرودست ( با غلظت اولیه 10 پیکومول/ میکرولیتر)، آنزیم Taq DNA polymerase (5/0 میکرولیتر معادل یک واحد) و در نهایت حجم واکنش به 25 میکرولیتر رسانده شد. طبق برنامه PCR دمای ذوب برای پرایمرها 7/62 و2/63 درجه سانتی­گراد برای ازدیاد قطعه مورد نظر تنظیم گردید. پس از به­دست آوردن دمای بهینه (گرادیان دمایی) واکنش فوق با آنزیم Pfu DNA polymerase که دارای خاصیت تصحیح کنندگی است، انجام شد. کلیه آنزیم­ها از شرکت ترموساینتیفیک تهیه شده بود. نحوه اجرای هر چرخه  PCR عبارت بود از: واسرشتگی (Denaturation) اولیه در دمای 98 درجه سانتی­گراد به­مدت 2 دقیقه، سپس 35 چرخه واسرشتگی به­مدت 10 ثانیه در دمای 98 درجه سانتی­گراد، اتصال 20 ثانیه در دمای 60 درجه سانتی­گراد و تکثیر40 ثانیه در دمای 68 درجه سانتی­گراد ودر نهایت تکثیر در دمای 68 درجه سانتی­گراد به­مدت 5 دقیقه انجام گرفت. پس از تکثیر قطعه­ژنی، محصول PCR بر روی ژل آگارز 1 درصد بررسی شد.

همسانه­سازی وکتور بیانی pcDNA3.1(+) و اتصال ژن lsc

وکتور  pcDNA3.1(+)جهت آماده نمودن الحاق به ژن lsc با دو آنزیم EcoRI و Hind III به­مدت 2 ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی­گراد مورد هضم قرار گرفت و بر روی ژل آگارز یک درصد الکتروفورز شد. در نهایت قطعه به­دست آمده از ژل جداسازی و با استفاده از Gel Purification Kit طبق پروتکل شرکتGeNet Bio  تخلیص گردید. پس از انجام هضم آنزیمی روی وکتور و محصول PCR، الحاق قطعه هدف با پلاسمید برش خورده به نسبت یک به سه قطعه انجام گرفت. جهت اطمینان از واکنش لیگاسیون، یک واکنش شاهد(Control)  نیز طراحی و آماده­سازی شد که از هر جهت با واکنش تست یکسان بود با این تفاوت که به­جای محصول PCR به واکنش آب مقطر افزوده شد. پس از آماده­سازی، واکنش فوق به­مدت 2 ساعت در دمای 22 درجه سانتی­گراد قرار داده شد.

آماده­سازی سلول مستعد TOP10

برای آماده­سازی سلول مستعد، از روش استاندارد TFB استفاده گردید. سویه TOP10 از باکتری E.coli در محیط LB مایع به­صورت شبانه کشت داده شدند. پس از رسیدن کدورت محیط رشد باکتری در طول موج ۶۰۰ نانومتر به 4/0 محیط سانتریفیوژ گردید و رسوب به­ترتیب در محلول TFBI (KAC با غلظت نهایی 30 میلی­مولار،MnCl_2. 4H₂O  غلظت 50 میلی­مولار، KCl غلظت 100 میلی­مولار، CaCl_2.  2H₂Oغلظت 10 میلی­مولار و گلیسرول 15 درصد) و TFBII (MOPS با غلظت نهایی 10 میلی­مولار، CaCl₂. 2H₂O غلظت 75 میلی­مولار، KCl غلظت 10 میلی­مولار و گلیسرول 15 درصد) استریل حل گردید و تا زمان مصرف در دمای ۷۰- درجه سانتی­گراد نگهداری شد. سپس ناقل نوترکیب به درون باکتری مستعد شده به روش شوک حرارتی انتقال داده شد. کلونی‌ها روی پلیت­های LB حاوی آمپی­سیلین (غلظت 100 میکروگرم در هر میلی‌لیتر) ظاهر شدند.

تأیید کلون های pcDNA3.1 حاوی ژن lsc

برای تأیید همسانه­سازی ژن موردنظر از کلونی‌های تشکیل شده در دمای 37 درجه سانتی­گراد تخلیص پلاسمید با روش لیز قلیایی از Plasmid DNA Extraction Kit طبق پروتکل شرکت Genet bio انجام و به­عنوان الگو در واکنش PCR و هضم آنزیمی از EcoRI  و HindIII استفاده شد. با استفاده از پرایمرهای T7 با توالی پرایمر رفت: TAATACGACTCACTATAGGG-3́-5’ و توالی برگشت: CCGCTGAGCAATAACTAGC-3́ -5’ کلونی PCR در دمای 60 درجه‌ سانتی‌گراد انجام شد.

ارزیابی بیان ژن pcDNA3.1-lsc در سلول HEK293T

برای ارزیابی بیان پلاسمید نوترکیب حاوی ژن lsc با استفاده از کیت  TurboFect Transfection Reagent به سلول HEK293T ( انستیتو پاستور ایران) ترانسفکت انجام شد. سلول­های اپیتلیالی در کانفلوئنسی 81 درصد پاساژ داده شد. جهت ترانسفکشن، از کیت تجاری TurboFect Transfection Reagent طبق پروتکل شرکت Thermo Fisher Scientific استفاده شد که بر مبنای روش­های بیوشیمیایی عمل می­نماید. پلیت حاوی سلول­ها در انکوباتور قرار داده شد تا عمل انتقال توسط توربوفکت بعد از 24 ساعت انجام شود. بیان پلاسمید نوترکیب بعد از 72 ساعت با استفاده از روش وسترن بلاتینگ ارزیابی شد.

وسترن بلاتینگ

لیزات سلولی تهیه شده از سلول­های مرحله رشد نمایی جمع­آوری و رسوب­دهی شد. سپس با استفاده از آنتی­بادی  Anti-His tag متصل با HRP (شرکت سیگما) بر روی ژل SDS-PAGE 12 درصد الکتروفورز شد. بافر انتقال مورد استفاده بر روی غشای نیترو سلولز شامل گلایسین 39 میلی­مولار، تریس 48 میلی­مولار، اتانول 20 درصد بود. سپس کاغذ نیترو سلولز در داخل بافر بلوکه­کننده (5 گرم skim milk در 100 میلی­لیتر PBS (1x))  به­مدت 1 ساعت در 37 درجه سانتی­گراد به­منظور پوشش نواحی آزاد و فاقد پروتئین قرار گرفت. در هر مرحله کاغذ نیتروسلولز با بافر PBST (بافر PBS واجد 05/0 توئین 20) شستشو داده شد. در مرحله بعد آنتی‌بادی مونوکلونال Anti-His tag (رقت 1:2000 در داخل بافر PBS(1x)) بر روی غشای PVDF اضافه و به مدت یک ساعت در دمای  37 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. سپس کاتالیزور (30%) H₂O₂ و محلول سوبسترا DAB (دی‌ آمینو بنزیدین) بر روی غشای نیتروسلولز استفاده و پس از ظهور باندها واکنش با آب مقطر مهار گردید.

یافته­ها

ساختار ژن کایمریک

ژن کایمریک lsc حاوی بخش­های LtB (aa 104)، CtxB (aa 109) و StB (aa 70) است. ژن کدکننده این سه پروتئین با استفاده از لینکر EAAAK و YAPQDP به یکدیگر متصل شده بود. سازه مورد نظر از تحقیق Kazemi و همکاران تهیه شد (شکل 1).

تأیید حضور پلاسمید نوترکیب با تکنیک PCR

ژن مورد نظر که در سویه E.coli BL21(DE3) کلون شده بود با Plasmid DNA Extraction Kit طبق پروتکل شرکت Genet bio استخراج و روی ژل آگارز یک درصد بررسی شد. واکنش PCR بر روی ژن lsc با استفاده از پرایمر اختصاصی صورت گرفته و موجب تکثیر قطعه مورد نظر شد. ژن تکثیر یافته، در مقایسه با مارکر در اندازه ۹۳۳ جفت باز بود (شکل 2).

شکل 1- شکل شماتیکی از ژن کایمریک lsc که نشان­دهنده ژن­های ltB ، stxB و ctxB و قطعات رابط است.

شکل 2- تصویر الکتروفورز محصول واکنش PCR. ستون M: نشانگر وزن مولکولی. ستون 1: محصول واکنش زنجیره­ای پلی­مراز با آنزیم Pfu.

همسانه­سازی ژن lsc

پس از انجام واکنش اتصال، محصولات واکنش با روش شوک حرارتی به سلول مستعد E.coli TOP10 انتقال داده شد. سپس بر روی کلون­های ظاهر شده بر روی محیط LB آگار حاوی آمپی­سیلین واکنش PCR با آغازگرهای اختصاصی انجام شد (شکل 3).

شکل 3- کلونی حاوی قطعه نوترکیب. ستونM: نشانگر وزن مولکولی. ستون 1 تا 6: عدم تکثیر ژن نوترکیب در کلونی­های انتخاب شده. ستون 7: کلونی نوترکیب تکثیر شده.

هضم آنزیمی کلون­های نوترکیب

به­منظور تأیید همسانه­سازی، روی کلونی -های نوترکیب پس از PCR واکنش هضم با دو آنزیم EcoRI و HindIII انجام شد و دو باند رویت شد که نشان­دهنده جدا شدن قطعه الحاقی به­طول bp 933 از وکتور است (شکل 4).

شکل 4- هضم آنزیمی ژن lsc و وکتور pcDNA3.1(+)، هضم آنزیمی کلون­های به­دست آمده. (الف) هضم آنزیمی ژن lsc و وکتور pcDNA3.1(+). ستون M: نشانگر وزن مولکولی. ستون 1: وکتورpcDNA3.1(+). ستون 2: ژن lsc. (ب) هضم آنزیمی کلون­های به­دست آمده ستون M: نشانگر وزن مولکولی DNA، ستون 1: هضم آنزیمی پس از واکنش PCR بر روی کلون مورد نظر که جدا شدن و که حضور قطعه نوترکیب به­طول bp 933 را تأیید می­کند.

کشت سلول­های حیوانی و بررسی بیان ژن کایمریک

بیان ژن کایمریک lsc پس از کشت کلونی­های واجد پلاسمید نوترکیب روی ژل SDS-PAGE 10 درصد بررسی شد. صحت پروتئین نوترکیب تولید شده با روش وسترن بلات و آنتی­بادی ضد هیستیدین به روش کیفی بررسی شد نتایج بیان پروتئین روی ژل SDS-PAGE نشان‌دهنده حضور یک باند در محدوده‌ 39 کیلو دالتون بود که با اندازه‌ قطعه‌ 933 جفت‌بازی با احتساب بخش الحاقی مطابقت داشت (شکل 5). هم­چنین پس از تخلیص پروتئین با استفاده از روش برادفورد پروتئین موردنظر تعیین غلظت شد. در نهایت پروتئین تخلیص شده LSC در 70- درجه سانتی­گراد نگهداری شد.

شکل 5- تأیید پروتئین نوترکیب به روش وسترن بلاتینگ با استفاده از Anti-His-Tag. ستون M: نشانگر وزن پروتئین، ستون 1: نمونه لیز سلولی از سلول­های ترنسفکت شده ، ستون 2: لیز سلولی از سلول­های ترانسفکت نشده (کنترل منفی)، ستون 3: نمونه پروتئین باکتری حاوی پلاسمید نوترکیب lsc.

بحث 

واکسیناسیون به­واسطه DNA، روشی جدید و جایگزینی برای واکسن­های دیگر بوده است. ساختار اصلی و مشخصی که از ابتدا تاکنون برای این واکسن­ها درنظر گرفته شده، DNA پلاسمیدی است که به­عنوان ناقل برای انتقال ژن ترانسفورم شده به کار می­رود. در ترکیب واکسن­های زیرواحدی از عوامل بیماری­زای ETEC شامل عوامل کلونیزه­کننده و سموم روده­ای LT و ST استفاده می­شود. سم حساس به حرارت (Lt)، باکتری ETEC، سم شبه شیگا (Stx)، باکتری EHEC و سم کلرا (Ctx) باکتری ویبریوکلرا از دسته سموم AB₅ هستند که به­عنوان یک کاندیدای واکسن در طراحی واکسن­های زیرواحد مورد توجه محققان قرارگرفته و نتایج نشان داده است که به­کارگیری این عامل بیماری­زای مهم می­تواند پاسخ­های خنثی کننده و حفاظتی سیستم ایمنی را در پی داشته باشد (14).

در همین راستا، با توجه­به اهمیت نقش کلیدی توکسین­های نامبرده (LT، STX و CTX) در پاتوژنیسیته عوامل باکتریائی بیماری­های روده­ای و مطالعه­هایی که نشان­دهنده پاسخ­های حفاظتی مناسب ناشی از ایمنی­زایی مناسب توسط آن­ها است، طراحی و به­کارگیری یک کاندید واکسن با ساختار ژنی سه گانه در برگیرنده ناحیه اتصالی این ژن­ها بر مبنای مطالعه­های بیوانفورماتیکی مورد توجه قرار گرفت (17).

در مطالعه­ای Porter و همکاران در سال 2017 به چاپ رسانده­اند به تحقیق در مورد واکسن DNA، سهولت تولید، ثبات در دمای محیط بدون نیاز به زنجیره سرد و توانایی تقلید از عفونت­های طبیعی و ایجاد پاسخ ایمنی پرداخته­اند که هر یک از آن­ها از مهم­ترین جذابیت­های تولید این واکسن به شمار می­رود. هم­چنین به موفقیت­هایی در مورد صدور مجوز چندین واکسن دامپزشکی دست یافته­اند (18).

langer و همکاران در سال 2013 بر روی روش‌های جدید برای پیشگیری و درمان بیماری­های انسانی از طریق واکسیناسیون بیولوژیکی DNA انجام داده و به بررسی موارد بیش­تری با توجه­به ایمنی­زایی واکسن­های DNA، از جمله جهش­زایی در صورت ادغام کروموزومی، تشکیل احتمالی آنتی­بادی­های ضد DNA، القای پاسخ­های خود ایمنی یا تحمل سیستم ایمنی پرداخته­اند. علاوه­بر این، به واکنش­های موضعی در محل تجویز و عوارض جانبی ناشی از گسترش DNA پلاسمید به بافت­های غیر هدفمند توجه شده است. هم­چنین اگر مزایای محصول از خطرهای آن برای بیمار تحت درمان فراتر رود، یک محصول دارای منافع خطر قابل قبول خواهد بود (19). در مطالعه­ای که Ghanem و همکاران در سال 2012 بر روی واکسن با پایه DNA پلاسمید و مقایسه با واکسن­های معمولی مبتنی بر ویروس انجام دادند نشان داد که pDNA راه سریع­تری برای توسعه و تولید است. هم­چنین بر فرآیندهای کشت سلولی نسبت­به زمان اتکا داشته و انعطاف­پذیری بیش­تری در حمل و نقل و ذخیره­سازی دارند. تحریک آنتی­بادی­ها و اجزای حامل سلول از سیستم ایمنی به­عنوان برخی از مهم­ترین مزایای استفاده از واکسن­های pDNA در نظر گرفته می­شود و نیز توجه ویژه­ای به تکنیک­های کروماتوگرافی با هدف کاهش مراحل تصفیه نهایی، جداسازی پس از اولیه و بهبودی میانی، به­منظور کاهش تعداد مراحل لازم برای رسیدن به محصول نهایی خالص از پلاسمید خام انجام دادند (20). هم­چنین Amani و همکاران در سال 2009 سازه کایمریک EIT را خالص و نتایج حاصل را در موش­ها به­صورت تزریقی ارزیابی کردند (21). Kazami و همکاران در سال 2016 ایمنی­زایی زیرواحد اتصالی سم شبه شیگا rSTX2B را در موش­ها مورد بررسی قرار دادند (17). برای این سازه در تحقیق قبل، جهت جداسازی قطعه­های ژنی از لینکر استفاده شد و بررسی­های بیوانفورماتیکی نشان داده بود که به­خوبی قادر به جداسازی هر سه قسمت از یکدیگر هستند. ساختار پروتئین کایمریک حاصل به کمک نرم­افزار مورد بررسی قرار گرفت و نتایج حاصل نشان داد که از نظر پایداری و هم­چنین ساختار mRNA و نیز ساختار دوم و سوم پروتئین در وضعیت مناسبی است.

در این تحقیق همسانه­سازی ژن lsc در وکتور یوکاریوتی pcDNA3 به­منظور استفاده از آن به­عنوان  DNA واکسن موردتوجه قرار گرفته است. برای رسیدن به این منظور پس از استخراج پلاسمید نوترکیب به کمک روش هضم آنزیمی باند bp933 تأیید گردید. پس از آماده­سازی وکتور بیانی یوکاریوتیک قطعه موردنظر به آن اضافه و پس از همسانه­سازی در سلول مستعد حضور آن با روش PCR و هضم آنزیمی مورد تأیید قرار گرفت که با نتایج مورد انتظار مطابقت داشت. هم­چنین وکتور یوکاریوتی به سلول HEK293T منتقل شد. نتیجه وسترن بلاتینگ بر روی پروتئین­های استخراج شده از سلول­های HEK293T با استفاده از آنتی­بادی ضد His-Tag یک باند پروتئینی اختصاصی در محدوده 40 کیلو دالتون را نشان می­دهد که تأیید کننده بیان پروتئین نوترکیب LSC در سیستم بیانی یوکاریوت است. با توجه­به این­که His-Tag در انتهای کربوکسیلی این پروتئین نوترکیب قرار دارد نتیجه وسترن بلاتینگ نشان­دهنده بیان کامل پروتئین است. در وسترن بلاتینگ بر روی پروتئین نوترکیب LSC سیستم بیانی پروکاریوتی E.coli بیان شده باند یکسانی از نظر اندازه مشاهده می­شود. به­نظر می­رسد این نتیجه نشان­دهنده این است به­احتمال که تغییرها پس از ترجمه نظیر گلیکوزیلاسیون که می­تواند منجر به تغییر وزن پروتئین نوترکیب شود در سیستم یوکاریوت بر روی پروتئین نوترکیب انجام نشده است. نکته قابل توجه در بیان پروتئین نوترکیب LSC این است که ژن همسانه­سازی شده lsc مورد استفاده در این تحقیق که از تحقیقات قبلی مورد استفاده قرار گرفته است، بر اساس جدول ترجیح کدونی میزبان بیانی E.coli بهینه­سازی شده است. بیان این پروتئین در سیستم یوکاریوتی نشان دهنده این است که محدویت­هائی که از نظر ترجیح کدونی وجود داشته نتوانسته مانع بیان این پروتئین در سیستم یوکاریوتی شود. از جمله محدودیت­های این تحقیق استفاده از وکتورهای دارای مارکر و تزریق به بدن موجود زنده جهت بررسی مقادیر کمی و کیفی بیان ژن در بافت­های مختلف بود که می­توانست تصویر روشن­تری از عملکرد واکسن DNA موردنظر ارائه دهد.

نتیجه‌گیری

با توجه­به نتایج تحقیق به­نظر می‌رسد که پروتئین کایمریک LSC می­تواند آماده بهره‌برداری در زمینه ایمنی‌زایی در حیوان مدل بوده و به­عنوان جزئی از DNA واکسن علیه عفونت-ها مورد استفاده قرار گیرد.

سپاسگزاری

تحقیق حاضر بخشی از پایان­نامه کارشناسی ارشد رشته ژنتیک مصوب دانشگاه پیام نور تهران واحد ری است.