Comparison of anti-candida effects of aqueous,

ethanolic extracts and essential oil of E. angustifolia

with fluconazole on the growth of clinical strains of Candida

Tohid Piri Gharaghie^1,*, Sameh Hajimohammadi²

1. Sina Borna Aria (SABA) Co., Ltd Lab, Biotechnology Research Center, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran.

2. Sina Borna Aria (SABA) Co., Ltd Lab, Biotechnology Research Center, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran.

Abstract

Aim and Background: Candida species are opportunistic pathogens that can be considered as the main cause of a wide range of diseases. Due to the increased resistance of these fungi to chemical drugs and also the adverse effects of these compounds on patients, it is necessary to replace these drugs with herbal compounds. In this study, the antifungal effect of aqueous and ethanolic extracts and essential oil of E. angustifolia on the growth of Candida albicans with fluconazole was compared.

Materials and Methods: In this laboratory study conducted in 1398 in Shahrekord Azad University Biotechnology Research Center, 80 candidate fungal samples were prepared from Parsian Hospital in Shahrekord and 50 Candida albicans samples were isolated by diagnostic tests. E. Angustifolia plants were obtained from Shahrekord Azad University Faculty of Agriculture. The extract was extracted by percolation and the essential oil was extracted by water distillation. The antifungal effect of E. angustifolia extracts along with E. angustifolia essential oil with fluconazole was compared on these isolates by disk diffusion and microdilution methods.

Results: The minimum and maximum diameter zone of inhibation obtained by disk diffusion method for E. angustifolia extracts, no growth halo formation with 1 and the lowest and maximum halo diameter for E. angustifolia essential oil were 6 and 37 mm. Therefore, the mean diameter of non-growth zone of inhibation for E. angustifolia extracts was 1 and for E. angustifoliathe essential oil was 23.4 mm. Comparison of the mean diameter of 25 mg fluconazole inhibition zone as control with an average of 16.26 mm shows a weaker antifungal performance and a significant difference compared to E. angustifolia essential oil. (P ≤ 0.05). The minimum inhibitory concentrations (MIC) of ethanolic and aqueous extracts of E. angustifolia and fluconazole were 4, 8, and 8 mg/ml, respectively; While the minimum fungicidal concentrations(MFC) were 8, 16, and 8 mg/ml, respectively; Showed a significant difference in inhibition of E. angustifoli ethanolic extract compared to 25 mg fluconazole disk (P ≤ 0.01). 

Discussion and Conclusion: According to the results of the above research, it seems that the ethanolic extract of E. angustifoliacan be used as a suitable drug candidate with better antifungal performance than fluconazole in the pharmaceutical industry.

Keywords: Essential oil, Fluconazole, Candida albicans, E. angustifolia extract, Iau Science .

مقدمه

کاندیدیازیس یکی از مهم­ترین و شایع­ترین عفونت­های قارچی فرصت­طلب در انسان است که به­وسیله برخی از گونه­های مخمری کاندیدا به­ویژه کاندیدا آلبیکنس ایجاد می شود (1). شیوع این عفونت­ها در دو دهه گذشته رشد چشم­گیری داشته است، به­گونه­ای که در فاصله سال­های 2010 تا 2020 رشد این عفونت­ها به­طور تقریبی ٥ برابر شده است (2،1). این قارچ فرصت­طلب می­تواند موجب تظاهرات بالینی فراوانی از قبیل برفک، واژینیت، عفونت پوست، اندوکاردیت[1]، مننژیت[2]، آبسه مغزی، آرتریت[3]، پیلونفریت[4] و ... در میزبان انسانی شود (3). کاندیدا آلبیکنس جزئی از فلور طبیعی سطوح مخاطی حفره دهانی، دستگاه گوارش و واژن است. این قارچ در سطوح مخاطی کلونیزه می­شود و بنابراین بیش­تر عفونت­های درون زاد از این ناحیه ایجاد می­شود (3). اکثر افراد با مکانیسم دفاعی فیزیولوژیک و سیستم ایمنی سالم، رشد و انتشار این مخمر را کنترل می­کنند. ولی تحت شرایط خاص و با وجود فاکتورهای مستعد کننده از قبیل دیابت، نقص سیستم ایمنی، مصرف آنتی­بیوتیک­های وسیع­الطیف این فرصت ایجاد می­شود تا کاندیدا آلبیکنس از شکل هم­زیست به­شکل بیماری­زا تبدیل شود و قابلیت ایجاد عفونت در بافت­های مختلف و امکان ایجاد بیماری سیستمیک کشنده را داشته باشد (3،4). در سال­های اخیر گزارش­های متعددی از شکست در درمان مبتلایان به اشکال بالینی متفاوت کاندیدیازیس اشاره شده است (4-1). داروهای ضدقارچی با فرمولاسیون­های متفاوت جهت درمان وجود دارد که در بسیاری موارد به­دلیل عدم پاسخ مناسب به درمان بیماری به­شکل مزمن در آمده، گاهی عودهای مکرر مشاهده می­شود (5،6). در میان داروهای ضدقارچی داروی فلوکونازول به­دلیل انتشار مناسب در اکثر بافت­های بدن میزبان، استفاده گسترده­تری در درمان اشکال موضعی و منتشره بیماری دارد (7). در سال­های اخیر مطالعه­های انجام گرفته در مورد حساسیت گونه­های کاندیدا نسبت­به داروهای ضدقارچی و به­خصوص فلوکونازول، مکانیسم­های مولکولی مختلفی را در جهت بیان دلایل مقاومت دارویی گونه­های کاندیدا نشان داده است (9،8). هم­چنین نیاز به مصرف طولانی مدت داروهای ضدقارچی که خود منجر به بروز عوارض جانبی ناشی از مصرف آن­ها می­گردد و شناسایی بعضی از فاکتورهای ژنتیکی در ارتباط با مقاومت دارویی نسبت­به فلوکونازول محدودیت­هایی را در استفاده از این قبیل ترکیب­های ضدقارچی به­وجود آورده است، لذا تحقیقات مختلفی در زمینه یافتن ترکیب­های ضدقارچی مؤثر با منشاء طبیعی و اثرهای جانبی کم­تر انجام پذیرفته است (10،11). داروهای گروه آزول­ها به­ویژه فلوکونازول یک تری­آزول دوتایی و فلورینه شده محلول در آب است که به­دلیل وزن مولکولی کم، جذب آن سریع بوده و قابلیت انتشار به اکثر بافت­های بدن را دارد. این داروها در بیماری­های قارچی به­خصوص کاندیدیازیس بسیار زیاد استفاده می­گردند. فلوکونازول یک داروی آزولی است که با مهار آنزیم 14 آلفا دی­متیلاز اثرهای ضدقارچی خود را اعمال می­کند. این دارو به­طور وسیع در بیماری­های قارچی به­خصوص کاندیدیازیس استفاده می­گردد (11). به­دلیل افزایش مقاومت در بین گونه­های کاندیدیایی به داروهای شیمیایی و هم­چنین اثرهای نامطلوبی مثل تهوع، درد شکمی،استفراغ و سردرد، راش­های پوستی و... این ترکیب­ها بر روی بیماران، لازم است تحقیقات بیش­تری در جهت جایگزینی این ترکیب­ها با ترکیب­های گیاهی بدون عارضه جانبی یا ترکیب­های شیمیایی و یا سنجش هم­اثری این ترکیب­ها با آنتی­بیوتیک­ها، جهت کاهش سمیت داروهای شیمیایی انجام شود (12).

E. angustifolia ازجمله گیاهانی که در سال 1940 در فهرست ملی گیاهان دارویی آمریکا قرار داشت اما پس از جایگزینی انواع آنتی­بیوتیک­ها از فهرست مزبور حذف شد (13،14). سرخارگل گیاهی علفی و چند ساله از تیره کاسنی است که ارتفاع آن حداکثر به ۱ تا 5/1 متر می‌رسد. برگ‌های پایین ساقه تخم­مرغی تا نیزه‌ای شکل هستند که حداکثر ۳۰ سانتی‌متر طول و ۲۰ سانتی‌متر عرض دارند (13). پلی­ساکاریدهای این گیاه شامل اکیناسئین، اکیناکوزید و آکینولون هستند  که دارای خواص دارویی و ضدمیکروبی مشابه با ترکیب­های گیاه سیر و آلیسین است (34،13). این گیاه در سال­های اخیر به­علت مقاومت­های میکروبی بار دیگر مورد توجه قرار گرفته است و در طب سنتی در درمان سرماخوردگی، مارگزیدگی، سینوزیت و مسمومیت­های خونی استفاده می­شود. عصاره این گیاه هم­چنین بر سیستم گوارش اثر داشته و دارای اثرهای تب­بری و ضد رونشیت است. از خواص دیگر این گیاه می­توان به خواص آنتی­اکسیدانی، التیام زخم، درمان مالاریا و ... اشاره کرد (15). از آنجا که مطالعه­ای بر روی اثرهای ضدقارچی عصاره قسمت گلریزه گیاه  E. angustifoliaروی رشد کاندیدا آلبیکنس بررسی نشده است، لذا در این مطالعه به­منظور مقایسه اثر ضدقارچی عصاره­های آبی و اتانولی  E. angustifolia با داروی فلوکونازول روی رشد کاندیدا آلبیکنس پرداخته شد.

مواد و روش­ها

جداسازی و شناسایی سویه های مخمری

به­دنبال کشت 80 نمونه قارچی کاندیدایی جداسازی شده از بیماران مبتلا به اشکال بالینی مختلف کاندیدیازیس که در طول سال 1398 به آزمایشگاه­های قارچ­شناسی بیمارستان پارسیان شهرکرد مراجعه کرده بودند، نمونه­ها ابتدا در محیط سابورو دکستروز آگار کشت و سپس از لحاظ میکروسکوپی و ماکروسکوپی تعیین گونه گردیدند. سپس کلنی­ها به­مدت 24 ساعت در محیط پوتیتودکستروز آگار^[5] (PDA) کشت داده شدند. مقدار  ml3 سالین استریل ریخته با خراش پیپت پاستور روی سطح کلونی و تکان آرام محیط، کونیدی­ها و هایف­ها معلق و به­وسیله شیکر مخلوط شدند. سپس جهت شناسایی سویه­های قارچی از محیط افتراقی کروم آگار کاندیدا (تالیژن پارس، ایران) استفاده شده رنگ و مورفولوژی کلنی­ها برای هر یک از جدایه­ها ثبت شد. چگونگی جذب قند در 3 نوبت به فاصله­های 24، 48 و 72 ساعت نسبت­به حفره شاهد توسط هر یک از مخمرها با استفاده از کیت API20C (شرکت Biomerieux SA، فرانسه) مورد بررسی قرار گرفت و درنهایت نتایج براساس الگوی ارائه شده کارخانه برای شناسایی کاندیدا آلبیکنس (شکل 1C) تعیین هویت شدند (16).

تهیه مواد دارویی و گیاهی

تهیه دیسک­های فلوکونازول و رقت­های دارویی

طبق استاندارد انتشار از دیسک CLSI 2018، برای تهیه دیسک­های 25 میلی­گرمی فلوکونازول، 2 میلی­گرم پودر آن (Apotex, CANADA) را در 1 میلی­لیتر بافر فسفات سالین حل کرده پس از 30 دقیقه در دمای آزمایشگاه استریل و توسط فیلتر سرنگی، فیلتر و به­میزان 5/12 میکرولیتر استوک دارویی بر روی دیسک­ها با قطر 5 میلی­متر تلقیح و به­مدت 24-48 ساعت در 37 درجه سلسیوس انکوبه شده و پس از خشک شدن در دمای 4 درجه سلسیوس نگهداری گردید. در این بررسی داروی ضدقارچی (پارس دارو، ایران) به­صورت پودری بود که از فرمول زیر استفاده شد:

طبق پروتکل مؤسسه استاندارد کلینیکی و آزمایشگاهی M-27-A، چون رقت1600 میلی­گرم بر میلی­لیتر نیاز بود، 16 میلی­گرم از دارو مذکور با درجه خلوص 9/99 میلی­گرم بر میلی­لیتر در 10 میلی­لیتر حلال آب حل گردید تا محلول استوک دارویی با رقت حدود 1600 میلی­گرم بر میلی­ لیتر حاصل شد. سپس به­منظور تهیه رقت­های دارویی از محیط کشت RPMI 1640 (HyClone, China) به­نسبت 1 به 50  استفاده گردید و رقت­های 32، 16، 8، 4، 2، 1، 5/0، 25/0، 125/05، 0625/0 میلی­گرم بر میلی­لیتر از طریق رقت­های سریالی تهیه گردید (38). چون 1/0 میلی­لیتر از هر رقت برای یک تست استفاده می­شود پس 1 میلی­لیتر حدودی برای 8 تست کافی است (17).

تهیه اسانس و عصاره­های گیاهی

الف: تهیه عصاره آبی و اتانولی E. angustifolia

بوته­های گیاه E. angustifolia کشت شده در مزرعه آموزشی پژوهشی دانشکده کشاورزی دانشگاه آزاد شهرکرد توسط کارشناس تأیید هویت شد. سپس قسمت گلریز گیاه خشک شده و 100 گرم از پودر گیاه در 1000 میلی­لیتر آب مقطر به­مدت 3 ساعت روی هیتر برقی با دمای 70-80 درجه سلسیوس خیسانده، قرار گرفت. سپس عصاره آبی جمع­آوری شده و در دمای 70- درجه سلسیوس جهت مصارف بعدی نگهداری شد. جهت تهیه عصاره اتانولی 50 گرم از قسمت گلریز گیاه در 2 لیتر الکل 70 درصد پس از سه روز در دستگاه روتاری در دمای 65 درجه سلسیوس به­مدت 20-30 دقیقه گذاشته شد. سپس حلال توسط دستگاه روتاری، جداشد. پس از آن عصاره­ها سانتریفیوژ (2500 دور بر دقیقه تا 10 دقیقه) و فیلتر (45/0 میکرومتر) شده و در یخچال 0-4 درجه سلسیوس نگهداری شد. اطراف لوله آزمایش توسط فویل برای جلوگیری از رسیدن نور به عصاره پوشانده شد (18).

ب: تهیه اسانس

جهت تهیه اسانس به­روش تقطیر با بخار آب، 50 گرم از پودر گیاه E. angustifolia در 1000 میلی­لیتر آب 80 درجه سلسیوس به­مدت 24 ساعت خیسانده شد و سپس با صاف کردن به­وسیله کاغذ صافی واتمن و تبخیر حلال در فشار کم اسانس غلیظی به­دست آمد (33).

پ: تهیه رقت­های عصاره E. angustifolia 

عصاره به­دست آمده از گیاه E. angustifolia توسط محیط کشت  RPMI 1640رقت­سازی شد. برای این منظور غلظت mg/ml 16 عصاره اتانولی و آبی به­ترتیب توسط دی­متیل­سولفوکساید و محیط  RPMI 1640مخلوط شده و رقت­گیری سریالی تا غلظت mg/ml 64/0 (mg/ml 64/0، 125/0، 25/0، 5/0، 1، 2، 4، 8، 16) انجام شد (18).

تست حساسیت دارویی سویه قارچ کاندیدا آلبیکنس نسبت­به داروی فلوکونازول به روش دیسک دیفیوژن

در این روش از جدایه­های 24 -48 ساعته کاندیدا آلبیکنس رشد کرده بر روی پلیت­های حاوی سابورودکستروز آگار، سوسپانسیونی از سرم فیزیولوژیک استریل حاوی 5/0 درصد توئین 80 به­تعدادCFU/ml  10⁸×5/1 معادل کدورت 5/0 مک­فارلند استاندارد تهیه و توسط اسپکتروفوتومتر تNیید گردید. سپس با استفاده از سواب استریل از این سوسپانسیون بر روی محیط مولر هینتون اگار حاوی 2 درصد گلوکز و 5/0 میکروگرم درمیلی­لیتر متیلن­بلو تلقیح شد. دیسک­های 25 میکروگرمی فلوکونازول را روی پلیت­ها قرار داده و پس از 24-48 ساعت انکوباسیون در 37 درجه، قطر نواحی مهار رشد اطراف دیسک­ها اندازه­گیری گردید. براساس استانداردهای تعیین شده در متد CLSI جدایه­ها با قطر مهاری کم­تر از 14 میلی­متر مقاوم، بین 5-21 میلی­متری دارای حساسیت وابسته­به دوز و بیش­تر از 22 میلی­متر حساس نسبت­به دارو طبقه­بندی شدند. از سوش ATCC 18804 کاندیدا آلبیکنس به­عنوان کنترل حساس­به فلوکونازول و از سوشATCC 1023  کاندیدا آلبیکنس به­عنوان کنترل مقاوم­به فلوکونازول استفاده شد (19).

ارزیابی تأثیر دارو و عصاره E. angustifolia 

ارزیابی تأثیر داروی فلوکونازول و عصاره­های گیاهی به­روش دیسک دیفیوژن

روش دیسک­گذاری طبق پروتکل مؤسسه استاندارد کلینیکی و آزمایشگاهی انجام شد. برای این کار در ابتدا از کاندیدا آلبیکنس کشت 24 ساعته تهیه شد. سپس از این نمونه­ها سوسپانسیونی با رقت نیم مک­فارلند آماده شد (با طول موج 530 نانومتر و اپتیکال دنسیتی بین 13/0- 09/0). قبل از کشت، سوسپانسیون به­مدت 3-5 دقیقه ورتکس و به­صورت کشت متراکم بر روی محیط کشت مولر هینتون آگار کشت داده شد. بعد از حدود 15 دقیقه دیسک­های استریل فلوکونازول و دیسک­های استریل حاوی رقت­های مختلف گیاه E. angustifolia که توسط دی­متیل­سولفوکساید و RPMI 1640 رقیق شده بود به­کمک پنس استریل بر روی محیط کشت قرار داده شد. دیسک­ها باید با فاصله مناسب از هم و فاصله مناسب از دیواره قرار بگیرند. سپس قطر هاله ممانعت از رشد پس از 24-48-72 ساعت انکوباسیون پلیت­ها در دمای 37 درجه سلسیوس اندازه­گیری شد. هم­چنین اثر ضدمیکروبی این عصاره و اسانس­ها در مقایسه با دیسک­های  mg25 آنتی­بیوتیک فلوکونازول مورد بررسی قرار گرفت (20،21). با توجه­به این­که در روش دیسک دیفیوژن غلظت­های دارو و عصاره­های گیاهی متفاوت است، از این­رو نمی­تواند روش دقیقی برای مقایسه اعتبارسنجی عملکرد ضدمیکروبی بین دارو و عصاره­های گیاهی باشد. از این­رو از روش میکرودایلوشن براث که حداقل غلظت بازدارندگی و کشندگی دارو و عصاره را مشخص می­کند، جهت تأیید فعالیت ضدمیکروبی تیمارها استفاده شد.

ارزیابی تأثیر دارو فلوکونازول و عصاره آبی و اتانولی E. angustifolia به­روش میکرودایلوشن

به­منظور ارزیابی تأثیر داروهای ضدقارچی، میکروپلیت­های 96 خانه-ای ته صاف­ به ابعاد 12×8 استفاده گردید. در هر سری یک چاهک کنترل در نظر گرفته شد که حاوی 1/0 سی­سی محیط کشت RPMI 1640 و 1/0 سی­سی سوسپانسیون قارچی رقیق شده بود. در چاهک 1 بالاترین رقت دارویی به­میزان 1/0 میلی­لیتر ریخته شد تا چاهک 10 که کم­ترین رقت دارویی ریخته می­شود. سپس در هر چاهک 1/0 سی­سی سوسپانسیون قارچ موردنظر افزوده شد و پیپتاژ شد. رقت­های دارویی فلوکونازول در مجاورت قارچ­ها 32، 16، 8، 4، 2، 1، 5/0، 25/0، 125/0، 0625/0 میکروگرم بر میلی­لیتر و رقت عصاره­ها 64/0، 125/0، 25/0، 5/0، 1، 2، 4، 8 و 16 میلی­گرم بر میلی­لیتر بود. حداقل غلظت کشندگی­(MFC) عصاره­ها با توجه­به نتایجMIC  تعیین شد. از چاهک­هایی که رشد قارچ در آن­ها به­طور کامل متوقف شده بود با سواب استریل نمونه­برداری و روی محیط کشت نوترینت و سابورودکستروز آگار کشت داده و در دمای 37 درجه سلسیوس گرمخانه­گذاری شدند. پس از 24 ساعت کم­ترین غلظتی از عصاره E. angustifolia و دارو فلوکونازول که قارچ در آن رشد نکرده بودند به­عنوان مقادیرMFC گزارش شدند. از سویه کاندیدا آلبیکنس ATCC 18804 وATCC 1023  به­عنوان سویه استاندارد به­منظور صحت عملکرد و کنترل کیفیت کار استفاده شد (22).

آنالیز آماری

از نسخه 16 نرم­افزارSPSS  برای انجام آنالیز آماری نتایج استفاده شد. تحلیل واریانس یک­طرفه (ANOVA) به-همراه آزمون Tukey برای مقایسه داده­ها استفاده شد. تمامی آزمون­ها به-شکل 3 بار تکرار انجام شد. رسم نمودارها با نرم­افزار گرف­پد پریسم 8 انجام شد. در این مطالعه از لحاظ آماری اختلاف میانگین­ها در سطح 01/0P< و 05/0P< معنی­دار تلقی شد.

نتایج

در بررسی رنگ­آمیزی این پژوهش، تمام 80 نمونه که از بیماران مبتلا به عفونت­های جلدی، مخاطی، واژینال و عمیق تهیه شده بودند، سلول­های مخمری جوانه­دار در لام تشکیل دادند. پس از کشت این نمونه­ها در محیط کروم آگار، 50 مورد کلنی سبز رنگ مشاهده شد که به­عنوان جدایه کاندیدا آلبیکنس شناسایی شدند. 12 مورد دارای کلنی بنفش رنگ بودند که به­عنوان کاندیدا گلابراتا، 13 مورد کلنی صورتی رنگ به عنوان کاندیدا کروزه ای و 5 مورد کلنی آبی با هاله قهوه­ای به­عنوان کاندیدا تروپیکالیس شناسایی شد. سپس آزمایش جذب قند با کیت API20C (شرکت Biomerieux SA، فرانسه) انجام و نوارهای رنگی جهت تشخیص گونه کاندیدا آلبیکنس در شکل C 1 نشان داده شد. 50 نمونه کاندیدا آلبیکنس جداسازی شده به­عنوان منبع برای تست­های دارویی مورد استفاده قرار گرفت.

سپس با استفاده از دیسک های تهیه شده طبق پروتکل موسسه استاندارد کلینیکی و آزمایشگاهی M- 27-A، با رقت1600 میلی­گرم بر میلی­لیتر، تست آنتی بیوگرام سویه های قارچی انجام و هر یک از سویه ها درصدی از مقاومت را از خود نشان دادند.

نتایج دیسک دیفیوژن (Disk diffusion) فلوکونازول و عصاره E. angustifolia

در این روش 4 تیمار مختلف را برای نمونه­های مختلف قارچ کاندیدا آلبیکنس درنظر گرفته و داده­های مربوط به هر تیمار برحسب میلی­متر ثبت گردید. داروی شیمیایی فلوکونازول با 2 تیمار عصاره آبی و اتانولی و 1 تیمار اسانس E. angustifolia مقایسه و عملکرد آن­ها ارزیابی شد. در این روش، بیش­ترین عدد در هر ردیف نمونه بهترین عملکرد محسوب می­شود. هر چه اندازه هاله بیش­تر باشد، میکروارگانیسم مقاومت کم­تری نسبت­به آن دیسک دارد.

هیچ هاله عدم رشدی در این روش برای عصاره­های آبی و اتانولی در تمام تیمارها وجود نداشت که برای محاسبه آماری برابر با یک در نظر گرفته شد. در روش آماری به­جای عدد حداقل، 1 و به­جای بیش­تر از 30 عدد 31 را قرار دادیم، تا از لحاظ آماری قابل توجیه باشد. فقط در 4 سویه شماره 2، 28، 29 و 31 بیش­ترین مقدار هاله عدم رشد برای داروی فلوکونازول برابر با 31 بود در حالی­که برای اسانس E. angustifolia تعداد 13 سویه هاله عدم رشد 31 را نشان دادند. در این روش داروی فلوکونازول با اسانس E. angustifolia و 2 تیمار دیگر مقایسه شد، و طبق مجموع داده اندازه هاله­ها و میانگین آن­ها، مشخص شد که اسانس E. angustifolia عملکرد مشابه و حتی بهتری نسبت­به داروی فلوکونازول دارد. چون هر چه اندازه هاله بیش­تر باشد خاصیت ضدقارچی بهتر است. انحراف معیار اسانس E. angustifolia بسیار زیاد بود. داده­های اسانس E. angustifolia پراکنش بیش­تری داشتند. عصاره آبی و اتانولی E. angustifolia در این روش واکنشی نشان ندادند (شکل 2).

انحراف معیار یکی از شاخص­های پراکندگی است که نشان می‌دهد به‌طور میانگین داده‌ها چه مقدار از مقدار متوسط فاصله دارند. اگر انحراف معیار مجموعه‌ای از داده‌ها نزدیک به صفر باشد، نشانه آن است که داده‌ها نزدیک به میانگین هستند و پراکندگی اندکی دارند؛ در حالی­که انحراف معیار بزرگ بیانگر پراکندگی قابل توجه داده‌ها است. به­طور معمول داده‌های با اختلاف بیش­تر از دو انحراف معیار از مقدار میانگین به­عنوان داده‌های پرت در نظر گرفته و از تحلیل، خارج می‌شوند. مطابق با شکل 2 (ب) انحراف معیار فلوکونازول کم­تر از اسانس E. angustifolia بود که نشان­دهنده دامنه عملکردی ضدقارچی بهتر فلوکونازول نسبت­به اسانس E. angustifolia است. هم­چنین میانگین قطر هاله عدم رشد فلوکونازول بیش­تر از اسانس E. angustifolia بود که نشان از خاصیت ضدقارچی بهتر آن نسبت­به اسانس

شکل 2- نمودار مربوط به مقایسه میانگین، میانه و انحراف معیار در روشDisk  برای 4 تیمار. میزان بازدارندگی نشان­دهنده عملکرد جزیی بهتر اسانس نسبت­به فلوکونازول است.

الف) میزان بازدارندگی کلی فلوکونازول (A) نسبت­به اسانس (B)، عصاره­های آبی (C) و الکلی (D)

ب) انحراف معیار، میانه و میانگین عصاره­های آبی، الکلی و اسانس E. angustifolia نسبت­به فلوکونازول

E. angustifolia بود (05/0P<). از این­رو، با این­که نتایج کلی میزان بازدارندگی نشان­دهنده عملکرد جزیی بهتر اسانس نسبت­به فلوکونازول است (شکل 2 الف)، اما با توجه­به انحراف معیار بالای اسانس (2 ب) می­توان چنین نتیجه گرفت که نتایج کلی تست دیسک دیفیوژن بر ای تعیین عملکرد ضدقارچی کافی نیست و لزوم تحقیقات بیش­تر را آشکار می­کند.

2نتایج حداقل غلظت بازدارندگی (MIC) فلوکونازول و عصاره E. angustifolia

در این تست حداقل غلظت بازدارندگی داروی فلوکونازول با 2 عصاره از گیاه E. angustifolia مقایسه و عملکرد آن­ها ارزیابی شد. کم­ترین عدد در هر ردیف نمونه، بهترین عملکرد برای MIC محسوب شد. چون در همان غلظت کم از دارو رشد قارچ متوقف شده است. هر چه در غلظت کمی رشد قارچ متوقف شود، اثرپذیری دارو بیش­تر است (جدول 2).

با توجه­به جمع داده­ها و مقدار میانگین عصاره اتانولی E. angustifolia در مقایسه با تیمار شاهد فلوکونازول، عملکرد بهتری داشته است. از لحاظ آماری نیز هر چه انحراف معیار کم­تر باشد بهتر است، یعنی عصاره­ها هم­خوانی بهتری در هر تیمار نسبت­به داروی شیمیایی فلوکونازول داشتند. با توجه­به نتایج، انحراف معیار عصاره­های گیاهی E. angustifolia نسبت­به فلوکونازول کم­تر است که نشان­دهنده تفاوت معنی­دار و عملکرد بهتر عصاره­ها نسبت­به فلوکونازول است (05/0P ≤). هم­چنین بین عصاره­های گیاهی کم­ترین انحراف معیار مربوط به عصاره اتانولی E. angustifolia است که این عصاره خاصیت ضد قارچی بهتری را از خود نشان داد.

شکل 3- نتایج آزمایشگاهی روش MIC، عصاره­ها و فلوکونازول. کم­ترین عدد در هر نمونه، بهترین عملکرد برای MIC محسوب می­شود. براین اساس، عصاره اتانولی E. angustifolia دارای کم­ترین مقدار MIC است و نسبت ­به فلوکونازول تفاوت معنی­داری در سطح P<0.01 را نشان می­دهد.

حداقل غلظت کشندگی (MFC[6]) فلوکونازول و عصاره E. angustifolia

در این روش نیز (MFC) برای هر 50 نمونه مختلف قارچ کاندیدا آلبیکنس 3 تیمار درنظر گرفته، داروی شیمیایی فلوکونازول با 2 عصاره مختلف آبی و اتانولی از گیاه E. angustifolia مقایسه شد. کم­ترین عدد در هر ردیف نمونه بهترین عملکرد محسوب شد. چون در همان غلظت کم از دارو قارچ می­میرد. هر چه در غلظت کم­تری دارو باعث مرگ قارچ شود، اثرپذیری دارو بیش­تر است. عصاره آبی E. angustifolia در 27 سویه مقدار MFC بیش­تری را نسبت داروی فلوکونازول نشان داد که نشان­دهنده عملکرد ضعیف آن نسبت­به فلوکونازول بود. در حالی­که در 38 سویه قارچی، عصاره اتانولی E. angustifolia عملکردی بهتر یا مشابه به فلوکونازول را نشان داد. مطابق نتایج MFC، تفاوت جزیی در عصاره اتانولی E. angustifolia با داروی فلوکونازول وجود داشت، هرچند که این تفاوت معنی­دار نبود (05/0≤ P). از لحاظ آماری هر چه انحراف معیار کم­تر باشد بهتر است. از این­رو، داروی فلوکونازول و عصاره اتانولی E. angustifolia داده­های آماری مناسب با خطای میانگین حداقل را در بین تیمارها دارا بودند. عدد میانه عصاره اتانولی E. angustifolia و فلوکونازول یکسان بود.

طبق نتایج آنالیز داده­ها MIC و MFC میانگین رشد 3 تیمار با هم برابر نیست. ولی بین تیمار 1 (فلوکونازول) با تیمار عصاره اتانولی E. angustifolia تفاوت معناداری وجود دارد که نشان­دهنده عملکرد کلی بهتر عصاره اتانولی E. angustifolia نسبت­به فلوکونازول است. هم­چنین آنالیز نتایج دیسک دیفیوژن نشان داد که میانگین رشد تیمارها (4 تیمار حاوی فلوکونازول، اسانس E. angustifolia، عصاره آبی و اتانولی E. angustifolia) با هم برابر نیست و بین تیمار 1 (فلوکوزانول) با تیمارهای 2 و 3 و 4 (عصاره­های E. angustifolia و اسانس E. angustifolia) تفاوت معناداری وجود دارد. در واقع، عصاره­ها بهتر از اسانس در این روش به آزمایش دیسک واکنش نشان داده است. اما مقایسه عملکرد اسانس E. angustifolia نسبت­به تیمار شاهد (فلوکونازول) حاکی از عملکرد بهتر فلوکونازول است.

بحث

عفونت­های قارچی سیستمیک ناشی از کاندیدا آلبیکنس در طول سالیان اخیر به­دلیل افزایش بیماری­های تضعیف کننده

شکل 4- مقایسه انحراف معیار، میانگین و میانه عصاره­های E. angustifolia با فلوکونازول در روش MFC. عصاره آبی E. angustifolia مقدار MFC بیش­تری را نسبت داروی فلوکونازول نشان داد که نشان­دهنده عملکرد ضعیف آن نسبت­به فلوکونازول است. اما عصاره اتانولی نتایجی مشابه با فلوکونازول را نشان داد.

سیستم ایمنی نظیر ایدز، بدخیمی­های خونی، مصرف بی­رویه کورتیکواستروئیدها، به­عنوان یکی از عوامل اصلی مرگ­و­میر به­خصوص برای بیماران بستری در بیمارستان مطرح است (20). شیوع این عفونت­ها و استفاده بی­رویه از ترکیب­های ازولی مثل فلوکونازول باعث ایجاد مقاومت قارچی به این دارو شده است (2). لذا استفاده از ترکیب­ها جایگزین به­ویژه گیاهان دارویی جهت درمان و پیشگیری از مقاومت ثانویه توصیه می­گردد.

نتایج مطالعه Sharifi-Rad و همکاران (2018) با هدف بررسی خواص دارویی گونه­های اکیناسه، کشت آن­ها، ترکیب شیمیایی و کاربردهای بالقوه این گیاهان به­عنوان عوامل آنتی­اکسیدان و ضدباکتری نشان داد که عصاره گیاه اکیناسه دارای فعالیت­های آنتی­اکسیدانی و ضدمیکروبی و ایمنی بالایی است (22).

 Bachirو همکاران (2015) در مطالعه­ای به بررسی فعالیت بازدارندگی اسانس E. angustifolia در انواعی از پاتوژن­ها پرداختند. مطابق با نتایج این گروه، اسانسE. angustifolia فعالیت ضدمیکروبی در برابر میکروارگانیسم­های آزمایش شده با قطر هاله عدم رشد بیش از 3 میلی­متر نشان دادند. بیش­ترین فعالیت برای Z. baillii وS. cereviceae به­ترتیب با غلظت 10 و ppm 100 مشاهده شد، در حالی­که برای بقیه سویه­ها قطر منطقه مهار 1 و 5/2 میلی­متر بود. نتایج مطالعه حاضر هم­سو با مطالعه-های Bachir و همکاران بیانگر پتانسیل مهیج عصارهE. angustifolia برای آینده است (23). 

Carolina Chiellini و همکاران (2017) مطالعه­ای تحت عنوان داده­های اولیه در مورد فعالیت ضدباکتریایی انجمن­های باکتریایی مرتبط با گیاه Echinacea purpurea در برابر سویه­های کمپلکس Burkholderia cepacia ، پاتوژن­های فرصت­طلب بیماران فیبروز کیستیک انجام دادند. نتایج این گروه نشان داد که باکتری­های هم­زیست با گیاه E. angustifolia فعالیت ضد Burkholderia cepacia بالایی از خود نشان دادند. این مطالعه نشان داد که ترکیب­های گیاهی اثرهای خوبی روی میکروارگانیسم­ها دارند و می­توان امیدوار بود که در آینده بتوان به داروهای گیاهی و به­احتمال ترکیب­های جدیدی در جهت درمان عفونت­های کاندیدیایی دست یافت (24).

Bagheri و همکاران (2015) اثر ضدقارچی Fumaria officinalis ، Echinacea angustifolia، سرکه سیب و انگور و فلوکونازول در برابر Candida albicans و Candida glabrata جدا شده از کاندیدیازیس واژن را بررسی کردند. براساس نتایج مطالعه این گروه، فلوکونازول در مقایسه با ترکیب­های آلی مورد مطالعه، منطقه مهار بیش­تری داشت. با این­حال، سرکه­های سیب و انگور تأثیر قابل­توجهی در میان ترکیب­های طبیعی داشتند. سایر ترکیب­ها هیچ تأثیر قابل توجهی نداشتند. از این­رو گیاهان و سرکه­های طبیعی منطقه مهار کم­تری نسبت­به فلوکونازول داشتند، هیچ عارضه جانبی جدی نداشتند و هزینه بسیار کم­تری را تحمیل می­کردند (25). 

S. Merali و همکاران (2003) مطالعه­ای تحت عنوان ارزیابی فعالیت ضدقارچی و ضد التهابی جنس اکیناسه انجام دادند. در این بررسی اسانس Echinacea فعالیت ضدقارچی علیه اکثر قارچ­های بیماری زا نشان داد (26). در مطالعه Falahati و همکاران در سال 1391 فعالیت ضدقارچی عصاره اتانولی موسیر ایرانی بر ضد تمامی گونه­های کاندیدایی نسبت­به عصاره آبی بیش­تر بود (11). 

Mir-Rashed و همکاران در سال 2010 پژوهشی با عنوان اختلال در دیواره سلولی قارچ توسط عصاره­های ضدقارچ اکیناسه انجام دادند. براساس نتایج این گروه، S. cerevisiae تحت درمان با اکیناسه به­طور قابل توجهی مستعد آسیب دیواره سلول نسبت­به سلول­های غیر تیمار شده است. این مطالعه شواهد قانع­کننده­ای را نشان می­دهد که دیواره سلولی قارچ هدف عصاره گیاهان اکیناسه است و بنابراین می­تواند کاربرد این گیاه پزشکی در درمان میکوز را توضیح دهد (27). 

نتایج مطالعه حاضر همسو با نتایج Sharifi-Rad و همکاران (2018)، Bachir و همکاران (2015)، Carolina Chiellini و همکاران (2017)، Bagheri و همکاران (2015)، Mir-Rashed و همکاران (2010) و S. Merali و همکاران (2003) نشان داد که عصاره گیاهی جنس Echinacea نسبت­به داروی شیمیایی (فلوکونازول) عملکرد ضد قارچی بهتری دارد. هم­چنین مشخص شد که حساسیت کاندیدا آلبیکنس به عصاره اتانولی E. angustifolia نسبت­به داروی فلوکونازول بیش­تر است.

Ankri و Mirelman با بررسی اثر مهاری عصاره­های گیاهی تازه با استفاده از روش میکرودایلوشن براث بر گونه­های کاندیدا آلبیکنس، کاندیدا تروپیکالیس، کاندیدا گالبراتا، کاندیدا کروزه­ای به این نتیجه دست یافتند که روش میکرودایلوشن براث روشی مؤثر و دقیق برای تعیین مهار رشد قارچ­ها است (3). در تحقیق حاضر نیز مشخص شد که روش میکرودایلوشن براث نسبت­به دیسک دیفیوژن برای محاسبه فعالیت ضدقارچی عصاره گیاهی برحسب غلظت عصاره، کارآیی بیش­تری دارد.

خاصیت ضدمیکروبی گیاهان به­طور عمومی به­دلیل وجود ترکیب­های فنولی، ساپونین، پلی­ساکاریدها و فلاونوئیدهای موجود در ساختار آن­ها است و برخی از این عوامل روی غشای پلاسمایی یا روی مهار آنزیم­های ساختاری غشای سلولی میکروارگانیسم­ها مؤثر است و می­تواند خواص ضدمیکروبی خود را اعمال نماید. تحقیقات فیتوشیمیایی گذشته اثرهای ضدمیکروبی عصاره­های مختلف را روی تعدادی از میکروارگانیسم­ها بررسی کرده است (31-28). فعالیت ضدمیکروبی پلی­ساکاریدهای گیاه E. angustifolia شامل اکیناسئین، اکیناکوزید و آکینولون را می­توان مشابه با آلیسین موجود در سیر دانست که با حضور بعضی از ترکیب­های عمده مانند α-پینن همراه با ترکیب­های دیگر با مقدار کم­تر مانند لینالول به­شکل مشخصی فعالیت ضدمیکروبی و باکتریواستاتیک آن تشخیص داده شده است (34-31). از طرفی گزارش شده است که خاصیت ضدقارچی با قطر هاله عدم رشد عصاره اتانولی بیش­تر از عصاره آبی است (35). با توجه­به این­که عصاره­هایی با روش­ها و حلال­های متفاوت از یک گیاه گرفته می­شود، می­تواند اثرهای ضدقارچی متفاوتی از خود نشان دهند. عصاره اتانولی تهیه شده در این پژوهش نسبت­به عصاره آبی اثر مهاری بیش­تری را روی کاندیدا آلبیکنس نشان داد. پژوهش­های پیشین نشان می­دهند که مواد ضدمیکروبی موجود در گیاهان توسط حلال­های آلی بهتر استخراج می­شوند (36). تصور بر این است که به­احتمال آلکالوئیدهای موجود در گیاه E. angustifolia در تماس با اتانول بهتر استخراج شده و به این ترتیب عصاره اتانولی قدرت بازدارنگی بیش­تری دارد. از طرفی ممکن است انتشار عصاره آبی در محیط کشت حاوی آگار با مشکل مواجه گردیده و یا در اثر ترکیب با مواد موجود در محیط کشت از اثر ممانعت کنندگی آن­ها کاسته شده باشد. Li Dahui و همکاران (2011) با بررسی فعالیت ضدقارچی عصاره ریشه E. angustifolia و تجزیه و تحلیل ترکیب­های آن با استفاده از طیف­سنجی جرمی کروماتوگرافی گازی (GC-MS) نشان دادند که عصاره ریشه E. angustifolia دارای فعالیت ضدقارچی قوی علیه B. cinerea با مقادیر EC50 و EC90 به­ترتیب 948 و 1869 میکروگرم در میلی­لیتر، حداقل غلظت مهاری­(MIC)  250 میکروگرم در میلی­لیتر و حداقل غلظت قارچ­کشی (MFC) 2000 میکروگرم در میلی­لیتر بود (37) از طرفی، ایجاد تغییرها در دیواره قارچ و اندامک­های داخلی در اثر اسانس نیز نشان­دهنده تأثیر ضدمیکروبی این گیاه بوده و وجود ترکیب­های ضدمیکروبی در گیاه را تأیید کرد (12).

Raho G و همکاران (2015) با بررسی اثرهای مهاری اسانس E. angustifolia در رشد پنج ارگانیسم بیماری­زا: Coliform Spp،PseudomonasSpp ،Saccharomyces Cerevisiae ، ZygosaccharomycesBailii و Lactobacillus Plantarum چنین گزارش کردند که این گیاه اثر باکتریواستاتیک ضعیفی در برابر برخی از مهم­ترین علل عفونت ایجاد می کند که پتانسیل هیجان­انگیزی در حرکت به سمت گزینه­های طبیعی­تر آنتی­بیوتیکی برای آینده فراهم می­کند (32). در این تحقیق همسو با تحقیقات گذشته، ویژگی­های ضدقارچی گونه گیاهی E. angustifolia علیه قارچ کاندیدا آلبیکنس بررسی و نتایج نشان­دهنده تاثیر مناسب عصاره این گیاه بر مهار رشد بود.

نتیجه­گیری

مطابق با نتایج، به نظر می­رسد که عصاره اتانولی E. angustifolia کاندید مناسبی برای جایگزینی فلوکونازول در بیماری­های قارچی کاندیدایی باشد. با این وجود ممکن است انتشار عصاره­ی آبی در محیط کشت حاوی آگار با مشکل مواجه گردیده و یا در اثر ترکیب با مواد موجود در محیط کشت از اثر ممانعت کنندگی آنها کاسته شده باشد. با توجه به نتایج، عصاره اتانولی گیاه E. angustifolia در مقایسه با داروی فلوکونازول برای درمان عفونت­های قارچی کاندیدایی مناسب می­باشد. لذا مطالعات بیشتر در خصوص اثرهای ضد قارچی عصاره­های گیاه E. angustifolia توصیه می­شود.