بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی و حضور ژنهای اینتگرون کلاس 1 در جدایه های کلبسیلا پنومونیه به دست آمده از نمونه های ادرار در استان البرز
لیلا جبل عاملی*1، مهیار رحمت پناه1، حسین گمار1، محمد شکرگزار اشکرمیدانی1، جواد جمالی پابندی1
1. گروه میکروبیولوژی، واحد کرج، دانشگاه آزاد اسلامی، کرج، ایران
* نویسنده مسئول: لیلا جبل عاملی، گروه میکروبیولوژی، واحد کرج، دانشگاه آزاد اسلامی، کرج، ایران. تلفن تماس: 09123367013 ، پست الکترونیکی: laji85@yahoo.com
بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی و حضور ژنهای اینتگرون کلاس 1 در جدایه های کلبسیلا پنومونیه به دست آمده از نمونه های ادرار در استان البرز
چکیده
سابقه و هدف: کلبسیلا پنومونیه یکی از انواع باکتری های بیماریزای انسانی مهم می باشد که پیدایش مقاومت آنتی بیوتیکی در بین آنها مشکلات درمانی زیادی را ایجاد کرده است. ژنهای اینتگرون کلاس 1 می توانند ضمن جابجایی بین باکتریها، اعطای مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک ها را در جمعیت تسهیل کنند. در این مطالعه، جداسازی باکتری های کلبسیلا پنومونیه از ادرار، تعیین الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی و ارزیابی حضور ژنهای اینتگرون کلاس 1 صورت گرفت.
مواد و روشها: جدایه های باکتریایی دریافت و تائید آنها با استفاده از تست های بیوشیمیایی تکمیلی صورت گرفت. ارزیابی مقاومت نسبت به 10 آنتی بیوتیک مختلف به روش انتشار دیسک در آگار انجام و الگوی مقاومت نیز اعلام شد. از روش PCR برای تعیین حضور ژنهای اینتگرون کلاس 1 در این جدایه ها استفاده گردید.
یافتهها: 80 جدایه کلبسیلا پنومونیه از ادرار افراد مراجعه کننده به آزمایشگاه های تشخیص طبی در کرج، بدست آمد که دو آنتی بیوتیک مروپنم و نیتروفورانتوئین به ترتیب دارای بیشترین و کم ترین اثر بر روی جدایه ها بودند. 16 جدایه به عنوان باکتری های مقاوم به چند دارو تشخیص داده شدند که برخی از آنها به هر 10 آنتی بیوتیک مورد ارزیابی مقاومت نشان دادند. 29 جدایه نیز از نظر حضور ژنهای اینتگرون کلاس 1 مثبت بودند.
بحث: با توجه به نتایج می توان درمان با آنتی بیوتیک های مروپنم، لووفلوکساسین، ایمی پنم و جنتامیسین که دارای درصد حساسیت بیش از 80 هستند را موفقیت آمیز دانست. البته حضور جدایه های مقاوم به چند دارو و همچنین تائید وجود ژنهای اینتگرون در جدایه های به دست آمده نیز می تواند زنگ خطری برای مقابله با عفونت های ناشی از کلبسیلا پنومونیه باشد.
نتیجه گیری: اطلاع از افزایش روز افزون مقاومت در بین جدایه های کلبسیلا پنومونیه ادراری و همینطور حضور موارد مقاوم به چند دارو و تائید وجود ژنهای دخیل در انتشار جدایه های مقاوم می تواند به انتخاب روش های درمانی موثر تر کمک کند.
واژگان کلیدی : کلبسیلا پنومونیه، مقاومت آنتی بیوتیکی، ژنهای اینتگرون کلاس 1، PCR ، . Iau Science
Evaluating the antibiotic resistant pattern and detecting the presence of class 1 integron genes among Klebsiella pneumoniae isolated from urine samples in Alborz province
Leila Jabalameli1*, Mahyar Rahmatpanah1, Hossein Gomar1, Mohammad Shokrgozar Ashkarmeidani1, Javad Jamali Pabandi1
1 Department of Microbiology, Karaj Branch, Islamic Azad University, Karaj, Iran
Aim and Background: Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) is one of the important human pathogens among which emergence of antibiotic resistant results in many problems in therapeutic process. Class 1 integron genes may facilitate the conferring of antibiotic resistance among bacterial population. In the present study, isolation of K. pneumoniae from urine samples, determining the antibiotic resistant pattern, and evaluating the presence of class 1 integron genes were investigated.
Materials and Methods: The obtained isolated bacteria were confirmed via biochemical tests. Evaluating the bacterial resistance against 10 different antibiotics was performed by agar disk diffusion method and antibiotic resistant pattern was also determined. PCR method was used in order to detect the presence of class 1 integron genes among isolates.
Results: 80 K. pneumoniae were isolated from the urine sample of attendees of clinical laboratories in Karaj. Meropenem and Nitrofurantoin were the most and least effective antibiotics, respectively. 16 isolates were considered as multi drug resistance (MDR) among which resistance to all 10 tested antibiotics was also observed. 29 isolates were also positive in terms of class 1 integron genes.
Discussion: Treatment with the following antibiotics; Meropenem, Levofloxacin, Imipenem, and Gemtamicin, may be successful, since more than 80% of the isolates were susceptible to them. However, presence of MDR as well as detecting class 1 integron genes may be an alarming for infections caused by K. pneumoniae.
Conclusion: Knowing about the increase in the antibiotic resistance among K. pneumoniae isolates, the presence of MDR isolates, and also detecting the presence of genes involved in dissemination of resistant isolates may help to choose the more effective therapies.
Keywords: Klebsiella pneumoniae, antibiotic resistance, class 1 integron genes, PCR, . Iau Science
مقدمه
Klebsiella pneumoniae یک باکتری گرم منفی فرصت طلب می باشد که اگرچه به عنوان فلور طبیعی دهان، پوست و دستگاه گوارش شناخته می شود اما عامل بسیاری از عفونت های بیمارستانی و همینطور اکتسابی است. از جمله بیماری های ایجاد شده توسط این باکتری می توان به پنومونی، آبسه کبدی، مننژیت، عفونت های خونی و عفونت دستگاه ادراری اشاره کرد (3-1). عفونت های مجاری ادراری با تحت تاثیر قرار دادن سالانه 150 میلیون نفر در دنیا، به عنوان متداول ترین عفونت های باکتریایی شناخته می شوند (4)، که عمدتا ناشی از آلودگی با باکتری های اشرشیا کلی (60 تا 80%) و کلبسیلا پنومونیه ( 3 تا 10%) می باشند (7-5). فاکتورهای ویرولانس کلبسیلا پنومونیه که منجربه محافظت باکتری در برابر سیستم ایمنی میزبان می شوند، متعدد بوده و شامل پلی ساکارید های کپسولی، ادهسین ها و عوامل کسب آهن می باشند (8). افزایش مقاومت کلبسیلا پنومونیه نسبت به آنتی بیوتیک ها ، یکی از مشکلات درمان بیماری های ناشی از این باکتری می باشد، به طوریکه امروزه بروز چشم گیر مقاومت در برابر آنتی بیوتیک های حائز اهمیت در درمان مثل آمینوگلیکوزیدها در بین این باکتری ها نیز گزارش شده است (9). عوامل متنوعی در ایجاد و انتشار مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک ها دخیل هستند که در این بین اکتساب ژن های مسئول ایجاد مقاومت از طریق عناصر ژنتیکی قابل تحرک به عنوان مهمترین عامل شناخته شده اند (10). از طرف دیگر، پیدایش کلبسیلا پنومونیه های مقاوم به چندین دارو (MDR) نیز مشکلات درمانی ناشی از این باکتری را بیشتر و پیچیده تر کرده است (11). اینتگرون ها یکی از عناصر ژنتیکی قابل تحرک مهم هستند که ضمن استقرار بر روی پلاسمید ها، ترانسپوزون ها و جزایر بیماریزایی می توانند به راحتی بین انواعی از باکتری ها جا به جا شوند (12). بر اساس توالی نوکلئوتیدی ژن اینتگراز، 5 کلاس از اینتگرون ها شناسایی شده اند (13) که در بین جدایه های کلینیکی کلبسیلا پنومونیه اینتگرون کلاس 1 فراوان ترین نوع بوده در حالیکه کلاس 2 گاهی اوقات و کلاس 3 به ندرت در این باکتری ها گزارش شده اند (14). از نظر ساختاری، اینتگرون ها از دو قطعه حفاظت شده به نام های5'-CS و 3'-CSتشکیل شده اند که به ترتیب در دو انتهای' 5 و' 3 توالی قرار داشته و ناحیه متغیر مرکزی یا کاست های ژنی مسئول مقاومت آنتی بیوتیکی را احاطه می کنند (15). در 5'-CS واقع در اینتگرون ها ژن اینتگراز (IntI)، محل نوترکیبی (attI) و پروموتر مشترک (Pc) قرار دارند، در حالیکه در ناحیه 3'-CS ژنهای qacEΔ1 و sul1 که به ترتیب مسئول مقاومت نسبت به مواد شوینده و سولفونامیدها هستند، واقع می باشند (16). در کاست های ژنی علاوه بر ژنهای مسئول مقاومت، یک محل نوترکیبی به نام attC نیز واقع است که وقوع نوترکیبی بین attI و attC منجر به ورود کاست ژنی در ناحیه فرودست پروموتر توسط IntI می گردد (17). با توجه به افزایش مقاومت آنتی بیوتیکی، اهمیت اینتگرون ها در اعطای مقاومت و مطالعاتی که نشان دهنده فراوانی بالای اینتگرون های کلاس 1 و 2 در جدایه های کلینیکی باکتری های گرم منفی هستند (18و 19)، این مطالعه به بررسی مقاومت آنتی بیوتیکی و همچنین ارزیابی حضور ژنهای اینتگرون کلاس 1 در جدایه های به دست آمده از نمونه ادرار افراد مراجعه کننده به مراکز تشخیص طبی واقع در استان البرز می پردازد.
مواد و روش ها
مواد: تمامی محیطهای کشت و مواد شیمیایی استفاده شده در این تحقیق از شرکت Merck (کشور آلمان) تهیه گردید. دیسکهای آنتی بیوتیک از شرکت MAST (کشور انگلستان) تهیه شدند.
جدایه های باکتریایی به دست آمده از نمونه ادرار افراد مراجعه کننده
در این مطالعه که به صورت مقطعی – توصیفی و در بازه زمانی 6 ماهه صورت پذیرفت، با رعایت اصول اخلاقی در در مجموع 80 جدایه باکتریایی بدست آمده از نمونه ادرار افراد مبتلا به عفونت ادراری از چندین آزمایشگاه تشخیص طبی در استان البرز جمع آوری شدند. با وجود اینکه آزمایشگاه های مربوطه با انجام تست های بیوشیمیایی، هویت این باکتری ها را به عنوان کلبسیلا پنومونیه اعلام نمودند، به منظور حصول اطمینان از هویت قطعی باکتری ها پس از تحویل، تست های بیوشمیایی متداول از جمله رنگ آمیزی گرم، رشد بر روی محیط مک کانکی، تست های اکسیداز، SIM ،TSI ،OF،VP ،MR ، تجزیه سیترات و اوره نیز صورت گرفت. همچنین، اطلاعاتی مانند جنسیت و رده سنی افراد مراجعه کننده در این مطالعه جمع آوری شدند.
تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی جدایه های کلبسیلا پنومونیه
به این منظور، از روش انتشار دیسک در آگار (Kirby-Bauer Disk diffusion method) مطابق با دستورالعمل موسسه استاندارد CLSI استفاده شد (20). بدین ترتیب که سوسپانسیون جدایه های باکتریایی با کدورتی معادل 5/0 مک فارلند (معادل 108×5/1 باکتری) در محیط کشت مولرهینتون اگار تلقیح شدند و پس از آن سپس دیسکهای آنتی بیوتیک در فواصل مشخص روی محیط کشت قرار داده شدند. بعد از گرماگذاری پلیت ها در دمای 37 درجه سلسیوس و به مدت 18 ساعت، قطر هاله عدم رشد توسط خط کش اندازه گیری شده و ضمن مقایسه با جدول CLSI، تفسیر نتایج صورت پذیرفت. در این مطالعه از[M1] سویهATCC 25922 E.coli به عنوان کنترل استفاده شد و آنتی بیوتیک های مورد ارزیابی نیز شامل: مروپنم، ایمی پنم، سفتریاکسون، سفتازیدیم، پیپراسیلین-تازوباکتام، لووفلوکساسین، توبرامایسین، نیتروفورانتوئین، جنتامیسین، کلرامفنیکل بودند.
ارزیابی وجود ژن های اینتگرون کلاس 1 در جدایه های کلبسیلا پنومونیه
ابتدا DNA باکتری از طریق روش جوشاندن استخراج شد (21). به این ترتیب که سوسپانسیونی از کشت شبانه جدایه ها در 250 میکرولیتر آب مقطر استریل تهیه و سپس به مدت 10 دقیقه در دمای 100 درجه سلیسیوس قرار گرفتند و پس از سانتریفیوژ مایع رویی به عنوان الگو در واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) بکار گرفته شد. از پرایمر های اختصاصی hep58 با توالی, 3 , TCATGGCTTGTTATGACTGT5 و hep59 با توالی 5, GTAGGGCTTATTATGCACGC 3, برای تکثیر ژن های اینتگرون کلاس 1 در PCR استفاده شد (22). محتویات مخلوط واکنش و شرایط دمایی انجام آن مطابق با منابع مرتبط بودند (22و 23). در نهایت، محصولات PCR توسط الکتروفورز بر روی ژل آگارز 1% مشاهده و مورد ارزیابی قرار گرفتند.
یافته ها
در این مطالعه 80 جدایه باکتریایی به واسطه انجام تست های بیوشیمیایی تائیدی به عنوان کلبسیلا پنومونیه شناسایی شدند که 35 نمونه ( % 75/43) آنها از مراجعه کنندگان مرد و مابقی (45 نمونه) از زنان به دست آمد، که محدوه سنی آنها نیز در جدول 1 نمایش داده شده است.
جدول 1. رده سنی افراد مراجعه کننده به مراکز درمانی جهت جداسازی باکتری های کلبسیلا پنومونیه از ادرار
محدوده سن مراجعه کنندگان (سال) |
تعداد جدایه های کلبسیلا پنومونیه به دست آمده |
19-0 |
18 |
40-20 |
17 |
60-41 |
18 |
80-61 |
19 |
92-81 |
8 |
تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی جدایه های کلبسیلا پنومونیه
ارزیابی جدایه های مورد مطالعه از نظر حساسیت و مقامت نسبت به آنتی بیوتیک ها در جدول 2 نشان داده شده است. نتایج بیانگر آن است که مروپنم به عنوان موثرترین آنتی بیوتیک با میزان حساسیت 90% می باشد، به طوریکه فقط 7 جدایه نسبت به این آنتی بیوتیک مقاومت نشان دادند. بیشترین مقاومت نیز نسبت به نیتروفورانتوئین دیده شد به طوریکه بیش از نیمی از جدایه ها (75%) نسبت به آن مقاوم بودند. سه آنتی بیوتیک ایمی پنم، جنتامیسین و کلرامفنیکل نیز تاثیر گذاری نسبتا یکسانی بر روی جدایه ها داشتند (با میزان حساسیت حدودا 80%).
|
|||
آنتی بیوتیک ها |
تعداد جدایه های باکتریایی (%) |
||
مقاوم |
میانه |
حساس |
|
سفتازیدیم |
21 (25/26) |
2 (5/2) |
57 (25/71) |
سفتریاکسون |
21 (25/26) |
18 (5/22) |
41 (25/51) |
کلرامفنیکل |
(5/17) 14 |
2 (5/2) |
64 (80) |
جنتامیسین |
9 (25/11) |
6(5/7) |
65 (25/81) |
ایمی پنم |
8 (10) |
7 (75/8) |
65 (25/81) |
لووفلوکساسین |
12 (15) |
0 |
68 (85) |
مروپنم |
7 (75/8) |
1 (25/1) |
72 (90) |
پیپراسیلین/ تازوباکتام |
17 (25/21) |
10 (5/12) |
53 (25/66) |
نیتروفورانتوئین |
60 (75) |
14 (5/17) |
6(5/7) |
توبرامایسین |
15 (75/18) |
32 (40) |
33 (25/41) |
همچنین بنابر تعریف، جدایه هایی که به سه یا بیش از سه خانواده آنتی بیوتیکی مقاوم بودند (24) نیز به عنوان جدایه های مقاوم به چند دارو یا MDR در نظر گرفته شدند که تعداد آنها در این مطالعه 16 بود و الگوی مقاومت چند دارویی آنها نیز در جدول 3 نمایش داده شده است. همانطور که در این جدول مشخص است، 25% از جدایه های کلبسیلا پنومونیه مقاوم به چند دارو در این مطالعه به هر 10[M3] آنتی بیوتیک مورد ارزیابی مقاومت نشان دادند و در میان 10 الگوی مقاومتی حاصل از این مطالعه، مقاومت همزمان نسبت به دو آنتی بیوتیک سفتازیدیم و سفتریاکسون در 8 الگو مشاهده شد. از دیگر آنتی بیوتیک های مشاهده شده در اغلب الگو های مقاومتی می توان به نیتروفورانتوئین و پیپراسیلین/ تازوباکتام که به ترتیب در 9 و 8 الگو قرار داشتند، اشاره کرد.
جدول 3. الگوی مقاومت به آنتی بیوتیک در جدایه های کلبسیلا پنومونیه مقاوم به چند دارو
تعداد جدایه های مقاوم به چند دارو (%) |
تعداد آنتی بیوتیک ها |
الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی در جدایه های مقاوم به چند دارو |
(75/18) 3 |
4 |
سفتازیدیم- سفتریاکسون- پیپراسیلین/ تازوباکتام- نیتروفورانتوئین |
(5/12) 2 |
4 |
سفتازیدیم- سفتریاکسون- نیتروفورانتوئین- کلرامفنیکل |
(25/6) 1 |
4 |
کلرامفنیکل- لووفلوکساسین- پیپراسیلین/ تازوباکتام- نیتروفورانتوئین |
(25/6) 1 |
4 |
سفتازیدیم- سفتریاکسون-لووفلوکساسین - پیپراسیلین/تازوباکتام- نیتروفورانتوئین- توبرامایسین |
(25/6) 1 |
7 |
سفتازیدیم- سفتریاکسون- کلرامفنیکل- جنتامیسین- لووفلوکساسین- پیپراسیلین/ تازوباکتام - توبرامایسین |
(25/6) 1 |
8 |
سفتازیدیم- سفتریاکسون- کلرامفنیکل- جنتامیسین- ایمی پنم- لووفلوکساسین- نیتروفورانتوئین- توبرامایسین |
(25/6) 1 |
8 |
کلرامفنیکل- جنتامیسین- ایمی پنم- لووفلوکساسین- مروپنم- پیپراسیلین/ تازوباکتام- نیتروفورانتوئین- توبرامایسین |
(25/6) 1 |
9 |
سفتازیدیم- سفتریاکسون- کلرامفنیکل- جنتامیسین- لووفلوکساسین- مروپنم- پیپراسیلین/ تازوباکتام- نیتروفورانتوئین- توبرامایسین |
(25/6) 1 |
9 |
سفتازیدیم- سفتریاکسون- کلرامفنیکل- ایمی پنم- لووفلوکساسین- مروپنم- پیپراسیلین/ تازوباکتام- نیتروفورانتوئین- توبرامایسین |
(25) 4 |
10 |
سفتازیدیم- سفتریاکسون- کلرامفنیکل- جنتامیسین- ایمی پنم- لووفلوکساسین- مروپنم- پیپراسیلین/ تازوباکتام- نیتروفورانتوئین- توبرامایسین |
ارزیابی وجود ژن های اینتگرون کلاس 1 در جدایه های کلبسیلا پنومونیه
از مجموع 80 جدایه مورد ارزیابی 29 جدایه کلبسیلا پنومونیه از نظر وجود اینتگرون های کلاس 1 مثبت گزارش شدند ( %36/25) که نتایج مربوط به مشاهده این ژنها در چند نمونه در شکل 1 نشان داده شده است. نتایج مشاهده شده از الکتروفورز محصولات PCR اینتگرون های کلاس 1 مجموعا نشان دهنده 5 قطعه تکثیر شده با اندازه های 1/2 ، 9/1 ، 1/1 ، 85/0 و 5/0 کیلو[M4] جف باز در جدایه های مختلف اینتگرون مثبت می باشد.
|