Evaluation of the cytotoxicity of antagonist actinomycetes on colorectal cancer cell line
Arghavan Kouroshnia¹, Sirous Zeinali², Shiva Irani¹, Akram Sadeghi^3⁕
 
1. Department of Biology, Islamic Azad University Science and Research Brach, Tehran, Iran
2. Biotechnology Research Center, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran
3. Department of Microbial Biotechnology, Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran (ABRII), Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Karaj, Iran
 
Abstract:
Aim and Background: Actinomycetes are a good resource to discover new drugs based on their abundant secondary metabolites. Because both fungal and human cells are eukaryotes, the metabolites of fungal antagonist actinomycetes may also inhibit the growth of cancer cells.
 
Materials and Methods: The antagonistic activity of 24 actinomycete strains that inhibited the growth of cells of a plant pathogen, Phytophthora capsici, was investigated against 4 other plant pathogens. The siderophores production of two selected strains that showed the highest antagonistic activity against pathogens was evaluated. The cytotoxicity effects of two strains on the SW480 cell line was measured using MTT assay in vitro and the IC50 percentage was determined.
 
Results: Only two selected strains had 30 and 54% inhibitory effect against Phytophthora drechsleri, respectively. The strain 408 had no inhibitory effect against Pythium ultimum, while the strain 6010 completely prevented Pythium ultimum growth. The strain 6010, unlike the strain 408, controlled the growth of Rhizoctonia solani and Fusarium oxysporum pathogens about 70%. Only the strain 408 was able to produce siderophore. The significant effect of the treatment on colorectal cancer cells was observed at 2.47 and 2.71% (v/v) concentrations for both 408 and 6010 strains, respectively.
 
Conclusion: The results of this study confirmed our hypothesis that secondary metabolites of antagonistic actinomycetes can lead to cancer cells death. The use of fungal or oomycete cells is introduced as an easy, safe, and inexpensive method for screening actinomycetes that are candidates for the discovery of new anticancer drugs.
 
Keywords: Colorectal Neoplasms, Actinomycetes, Cell Viability, Iau Science.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
بررسی اثر سمیت سلولی سویه های اکتینومیستی انتاگونیست بر روی رده سلولی سرطان کلورکتال
ارغوان کورش نیا¹، سیروس زینلی²، شیوا ایرانی¹، اکرم صادقی^3*

1. گروه زیست شناسی، واحد علوم و تحقیقات تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
2. مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی، انستیتو پاستور، تهران، ایران
3. استادیار ژنتیک مولکولی، بخش بیوتکنولوژی میکروبی، پژوهشگاه بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، ایران

 

چکیده
سابقه و هدف: اکتینومیست‌ها به دلیل داشتن متابولیت‌های ثانویه فراوان منبع خوبی برای کشف داروهای جدید هستند. از آنجاکه سلول‌های قارچی و انسانی هر دو یوکاریوت هستند احتمالا متابولیت‌های اکتینومیست‌های آنتاگونیست قارچی، رشد سلول‌های سرطانی را نیز مهار می‌کنند. هدف از این پژوهش بررسی اثرات ضد سرطانی دو سویه اکتینومیست‌ بر روی سلول‌های سرطانی کلورکتال می‌باشد.
 
مواد و روشها: فعالیت آنتاگونیستی 24 سویه اکتینومیستی که از رشد سلول‌های یک بیمارگر گیاهی، Phytophthora capsici ممانعت می کردند بر علیه 4 عامل بیمارگر گیاهی دیگر بررسی شد. دو سویه منتخب که بیشترین فعالیت آنتاگونیستی را بر علیه بیمارگرها نشان دادند، از نظر تولید سیدروفور بررسی شدند. اثر سیتوتاکسیسیتی این دو سویه با استفاده از تست MTT در in vitro بر روی رده سلولی SW480 مورد سنجش قرار گرفته و درصد IC₅₀ تعیین شد.  
 
یافته ها: تنها دو سویه منتخب بر علیه بیمارگر Phytophthora drechsleri به ترتیب 30 و 54 درصد اثر بازدارندگی داشتند. سویه 408 بر علیه Pythium ultimum تاثیر ممانعت کننده نداشت در حالیکه سویه 6010 به طور کامل از رشد آن جلوگیری کرد. این سویه برخلاف سویه 408، رشد دو بیمارگر Rhizoctonia solani و Fusarium oxysporum را نیز در حدود 70 درصد کنترل کرد. تنها سویه 408 قادر به تولید سیدروفور بود.  تاثیر معنی دار تیمار بر سلول های‌سرطانی روده به ترتیب در غلظت‌های 47/2 و 71/2 درصد (حجمی/حجمی) معنی‌دار بود.  
 
نتیجه گیری: نتایج این مطالعه فرضیه ما را که متابولیت‌های ثانویه اکتینومیست‌های آنتاگونیست می‌توانند موجب مرگ سلول‌های سرطانی بشوند اثبات کرد. استفاده از سلول‌های قارچی و یا اوومیستی به عنوان روشی ساده، ایمن و ارزان برای غربال اکتینومیست‌های کاندید کشف داروهای ضد سرطان جدید معرفی می‌شود. 
 
واژه های کلیدی: ﻧﺌﻮﭘﻼﺳﻢ‌ﻫﺎی ﻛﻮﻟﻮرﻛﺘﺎل، اکتینومیست ها، قابلیت زیستی سلول، Iau Science
 

مقدمه
سرطان روده بزرگ یا کولورکتال ((CRC)Colorectal cancer) که با رشد غیرعادی تومورها در روده‌ی بزرگ ایجاد شده است، چهارمین سرطان شایع در دنیا و سومین عامل شایع مرگ و میر سرطان در جهان است (1). بر اساس داده‌های مربوط به نرخ مرگ و میر سازمان بهداشت جهانی (World Health Organization) و پیش بینی‌های انجام شده، تا سال 2035 این بیماری افزایش چشمگیری در تمام دنیا به خصوص در کشورهای اروپای شرقی، اغلب کشورهای آسیایی، خاورمیانه و شمال آفریقا و برخی از کشورهای آمریکای جنوبی خواهد داشت (2).
اگرچه تاکنون داروهای زیادی توسط سازمان غذا و داروی آمریکا (Food and Drug Administration) جهت بهبود سرطان روده بزرگ تایید شده است اما این داروها عوارض جانبی مختص به خود را دارند. از جمله می‌توان به دو داروی 5-FU (نام تجاری  Adrucil^®شرکت Teva) و Capecitabine (نام تجاری ® XELODAشرکت Roche) اشاره کرد که سمیت نسبی دارند. علاوه بر این عوارض این داروها در افراد مختلف، متفاوت و غیر قابل پیش بینی بوده است (2). 
اکتینومیست‌ها (Actinomycetes) باکتری‌های گرم مثبت و رشته‌ای هستند که به صورت آزاد، ساپروفیت و گاه همزیست با گیاهان دیده می‌شوند. این باکتری‌ها را می‌توان از تمام اکوسیستم‌ها از جمله خاک، آب، رسوبات دریایی و آب‌های گرم جداسازی کرد (3). اکتینومیست‌ها دارای پتانسیل بالایی در تولید متابولیت‌های ثانویه مانند آنتی بیوتیک‌ها، آنزیم‌ها، قارچ کش‌ها، مواد ضد سرطان و دیگر ترکیبات مفید هستند. حدود 23000 نوع متابولیت ثانویه شامل آنتی بیوتیک‌ها و ترکیبات ضد میکروبی فعال توسط میکروارگانیسم ‌ها تولید می‌شود که اکتینومیست‌ها بیش از 75 درصد آن‌ها را تولید می‌کنند. حدود ۱۴۰-۱۳۰ فرآورده میکروبی و تعداد مشابهی از مشتقات آن‌ها در پزشکی به خصوص شیمی درمانی و دامپزشکی کاربرد دارد و حدود ۲۰-۱۵ فرآورده نیز در بخش کشاورزی مورد استفاده قرار می‌گیرد (4). کشف متابولیت‌های ارزشمند موجود در منابع طبیعی بر دانش تجربی در مورد میکروب‌ها متمرکز است. پرکاربردترین گروه‌های میکروبی مورد توجه دانشمندان اکتینومیست‌ها و قارچ‌های رشته‌ای هستند.  
بطور کلی اکتینومیست‌ها از مهم‌ترین باکتری‌های خاک و شامل جنس‌های مهمی مانند استرپتومایسس (Streptomyces) و فرانکیا (Frankia) است (5). اکتینومیست‌ها مخصوصا جنس استرپتومایسس با تولید متابولیت‌های ثانویه محلول در آب و یا فرار قابلیت کنترل اکثر قارچ‌های بیماریزای گیاهی را دارند (6 و 7). بررسی قابلیت ممانعت از رشد یا آنتاگونیستی قارچ‌های بیمارگر گیاهی در شرایط آزمایشگاهی کاری بی‌خطر و کم هزینه است. سویه‌های اکتینومیستی بسیاری بر اساس این سیستم غربالگری، جداسازی، شناسایی و معرفی شده‌اند (8).
با توجه به اینکه سلول‌های انسانی و قارچی هر دو از نظر ساختاری به یوکاریوت‌ها تعلق دارند بنابراین، احتمال اینکه یک متابولیت با قابلیت بازدارندگی از رشد (آنتاگونیستی) و یا مرگ سلول‌های قارچی اثرات مشابه‌ای بر سلول‌های انسانی داشته باشد زیاد است. استفاده از سلول‌های قارچی به جای سلول‌های انسانی در مراحل اولیه غربالگری می‌تواند موجب صرفه جویی در زمان و هزینه‌های آزمایشگاهی تحقیق شود. مطالعه حاضر با هدف غربال سویه‌های تولید کننده متابولیت‌های محلول با اثر کشندگی بر یک رده سلولی سرطان کولون (SW480) از میان 24 سویه اکتینومیستی آنتاگونیست قارچ Phytophthora capsici، عامل ایجاد بیماری مرگ گیاهچه فلفل (9) انجام شد.
 
مواد و روش ها
جداسازی، کشت و بررسی خاصیت آنتاگونیستی اکتینومیست ها
بیست و چهار سویه اکتینومیستی که قبلا اثر آنتاگونیستی آنها بر علیه اوومیست فیتوفترا کپسیسی (Phytophthora capsici) بررسی شده بود از کلکسیون میکروبی پژوهشگاه بیوتکنولوژی کشاورزی ایران[1] تهیه شد. از روش کشت متقابل (10) برای ارزیابی فعالیت ضد قارچی این سویه‌ها بر علیه چهار عامل بیمارگر گیاهی دیگر شامل Phytophthora drechsleri، پیتیوم اولتیموم (Pythium ultimum)، ریﺰوﮐﺘﻮﻧﯿﺎ ﺳﻮﻻﻧﯽ (Rhizoctonia solani) و فوزاریوم اکسیسپوروم (Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum (ABRIICC 10294)) (11) استفاده شد. 
بیمارگر‌های P. drechsleri strain AZ94 (شماره دسترسی: GenBank MF138111) توسط دکتر عظیمی عضو هیات علمی موسسه تحقیقات گیاه پزشکی ایران[2] و بیمارگر‌های R. solani AG-2-2 (سویه Rh133) و P. ultimum (سویه MK1248) توسط دکتر کاکوئی نژاد عضو هیات علمی موسسه تحقیقات اصلاح و تهیه بذر چغندرقند[3] تهیه شدند.  
جهت کشت متقابل یک لوپ پر از میسلیوم و اسپور کشت جوان هر سویه باکتری به صورت خطی در دو سمت پلیت حاوی محیط کشت پوتیتو دکستروز آگار ([4]PDA) کشت داده شد. یک پـلاک مربع شکل به ضلع 5/0 سانتیمتر از کشت جوان هر بیمارگر در مرکز پلیت قرارد داده شد. سویه‌های باکتری و بیمارگر‌‌‌ها به صورت همزمان کشت داده شدند تا بتوان کارآمدترین باکتری‌های آنتاگونیست را جدا کرد. کشت همزمان و گرمخانه گذاری در شرایط بهینه قارچ به جای شرایط بهینه باکتری نیز موجب انتخاب باکتری‌هایی می شود که پتانسیل کنترل رشد قارچ را حتی در شرایطی که به سود باکتری نیست دارند (12). پلیت‌ها به مدت پنج روز در دمای C°23 انکوبه شدند. درصد مهار رشد با استفاده از فرمول n = (a − b)/a × 100 محاسبه شد، جایی که "n" درصد مهار رشد، "a" شعاع رشد عامل بیمارگر در محیط کنترل (برحسب سانتی متر) و "b" فاصله رشد بیمارگر در جهت باکتری‌ها (برحسب سانتی متر) است. این آزمایش دو بار تکرار شد.
 
تولید سیدروفور
تولید سیدروفور بر روی محیط کشت جامد حاوی کروم آزورول (CAS[5]) ارزیابی شد (13). محیط آگار CAS تهیه و در پتری دیش ریخته شد. سویه‌های باکتریایی به صورت لکه‌ای بر روی سطح محیط کشت شدند. پلیت‌ها به مدت سه روز در دمای  C°29 انکوبه شدند. نسبت قطر منطقه هاله نارنجی اطراف باکتری به قطر کلنی محاسبه و ثبت شد.
 
خصوصیات ژنوتیپی
جداسازی DNA طبق روش تریپاتی و راوال (14) انجام شد. فرآیند PCR ژن 16S rRNA طبق پروتکل Yuan و Crawford DL (15) و با استفاده از جفت آغازگر  27F(5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) و  1525R(5′- AAAGGAGGTGATCCAGCC-3′) انجام شد. توالی طول تقریبا کامل ژن 16S rRNA هر دو سویه در پایگاه داده GenBank با شماره‌های دسترسی MN889432 (سویه 408) و MN888938 (سویه 6010) ثبت شد. توالی‌های بدست آمده با توالی سایر اکتینومیست‌های موجود در پایگاه داده‌هایGenBank ، EMBL و DDBJ با استفاده از BLAST به صورت دستی هم تراز شدند (16).
 
تهیه سری رقت‌های مختلف از روشناور سویه‌های 408 و 6010
هر یک از سویه‌های 408 و 6010 در 50 میلی لیتر محیط کشت ISP2[6] (10 گرم در لیتر عصاره مالت، 4 گرم در لیتر عصاره مخمر، 4 گرم در لیتر گلوکز با اسیدیته 2/7) درون ظروف ارلن مایر 250 میلی­لیتری کشت داده شدند. ارلن‌ها به مدت 5 روز در داخل شیکر انکوباتور با دمای C°29 و سرعت 150 دور در دقیقه انکوبه شدند (17). رو‌شناور باکتری‌ها با استفاده از سانتریفیوژ (10 دقیقه در rpm 5000) جدا و جهت تیمار سلول‌های سرطانی در یخچال C°4 نگهداری شد. روشناور باکتری‌های مورد بررسی به دلیل حساسیت بالای رده سلولی به آلودگی، کاملاً صاف و فیلتر شده است.
 
کشت سلول
رده سلولی SW480 (رده سلولی سرطان روده بزرگ انسان)
از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران (کد C506) تهیه شد. سلول‌ها در محیط کشت DMEM High glucose (شرکت زیست فناوری کوثر) که با سرم جنین گاوی (FBS) 10% (Gibco) و آنتی بیوتیک‌های استرپتومایسین (100 گرم بر میلی لیتر) و پنی سیلین (100 واحد بر میلی لیتر) غنی شده بود، کشت و در انکوباتور با دمای C°37 و دی اکسیدکربن 5 درصد انکوبه شدند (18).
 
بررسی میزان سمیت سلولی با روش assay MTT
ابتدا سلول‌های SW480 با کمک تریپسین از فلاسک 25 میلی لیتری جدا و به فالکون 15 میلی لیتری منتقل شدند. رسوب سلولی با استفاده از سانتریفیوژ (5 دقیقه در rpm 1500) تهیه شد. به رسوب حاصل 2 میلی لیتر محیط کشت کامل اضافه شد. 10 میکرولیتر از آن جهت شمارش سلولی بر روی لام نئوبار قرار داده شد. سپس 100 میکرولیتر از محیط کشت حاوی 10⁴ سلول به هر چاهک پلیت 96 خانه، اضافه شد (19).
محیط کشت سلول‌ها پس از 48 ساعت انکوباسیون که سلول ها دارای کانفلوانسی 80% رسیده اند، تخلیه شد و 100 میکرولیتر محیط کشت حاوی روشناور باکتری با غلظت‌ 20، 10، 1، 1/0 و 01/0 درصد (حجمی-حجمی) به هر چاهک اضافه شد. برای هر تیمار 3 تکرار در نظر گرفته شد.
جهت خوانش نمونه‌ها در 24 ساعت اول و دوم، ابتدا 005/0 گرم از پودر MTT تهیه شده از شرکت سیگما در یک میلی لیتر بافر فسفات (PBS) حل شد و سپس محیط کشت حاوی MTT 10% تهیه و به ازای هر چاهک پلیت، 100 میکرولیتر از این محیط کشت جایگزین محیط قبلی شد. در مرحله بعد پلیت 96 خانه به مدت چهار ساعت در انکوباتور C°37 قرار داده شد. پس از خارج کردن پلیت از انکوباتور و تخلیه محیط سلول‌ها، 100 میکرولیتر DMSO (Dimethyl sulfoxide) به هر چاهک اضافه و پلیت به مدت 10 دقیقه در شیکر مخصوص قرار داده شد. در نهایت جذب نمونه‌ها در طول موج 540 نانومتر توسط دستگاه خوانش الایزا اندازه گیری شد. محاسبات آماری بر اساس تحلیل XY و رگرسیون غیرخطی توسط نرم افزار Graphpad prism انجام شد.
 
نتایج
اثرات آنتاگونیستی سویه­های اکتینومیستی بر بیمارگرهای گیاهی اوومیستی و قارچی
نتایج حاصل از بررسی خصوصیات آنتاگونیستی 24 سویه اکتینومیستی (شکل 1) نشان داد که تنها دو سویه 408 و 6010 (شکل 2) که بر علیه بیمارگر اوومیستی فیتوفترا کپسیسی فعالیت آنتاگونیستی داشتند و رشد آن را به ترتیب 20 و 100 درصد مهار می کردند بر علیه بیمارگر P. drechsleri نیز به ترتیب 30 و 54 درصد اثر بازدارندگی از رشد داشتند. سویه 408 بر علیه دیگر بیمارگر اوومیستی مورد مطالعه پیتیوم اولتیموم، تاثیر ممانعت کننده نداشت (در شکل 1 با فلش قرمز مشخص شده است) در حالیکه سویه 6010 به طور کامل از رشد آن جلوگیری کرد (در شکل 1 با فلش سبز مشخص شده است). پلیت شاهد یا قارچ بیمارگر بدون تیمار باکتری در وسط قرار دارد.
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
شکل شماره 1: مهار رشد عامل بیمارگر اوومیستی P. ultimum در شرایط  in vitroتوسط 24 سویه اکتینومیستی
 
 

 
 
 
 
 
 
 

شکل شماره 2: مورفولوژی کلنی های دو سویه منتخب
 
این سویه آنتاگونیست برخلاف سویه 408، رشد دو عامل بیمارگر قارچی شامل ریﺰوﮐﺘﻮﻧﯿﺎ ﺳﻮﻻﻧﯽ و فوزاریوم اکسیسپوروم را نیز در حدود 70 درصد کنترل کرد (جدول 1).  
 
تولید سیدروفور توسط سویه­های اکتینومیست
با بررسی نتایج حاصل از ارزیابی تولید سیدروفور با معرف CAS مشخص شد که تنها در اطراف سویه 408 هاله نارنجی رنگ تشکیل شده است (شکل 3).

شکل شماره 3: تولید هاله نارنجی در اطراف سویه 408 که نشان دهنده تولید سیدروفور توسط این باکتری است.
 
همچنین عدم تشکیل هاله نارنجی در اطراف سویه 6010 نشان دهنده ناتوانی آن در تولید سیدروفور بود.
 
شناسایی ژنتیکی سویه های منتخب
جهت شناسایی باکتری­ها، توالی­یابی ژن 16SrRNA سویه­ها انجام گرفت و نتایج آن در GeneBank ثبت شد.
سویه 408 (MN889432) و 6010 (MN888938) با شباهت بالای 99% متعلق به جنس استرپتومایسس و بیشترین شباهت را به ترتیب به S. thinghirensis وS. monomycini داشتند (جدول 1).
 
بررسی اثر سمیت سلولی روشناور کشت سویه های منتخب
یافته­ها نشان داد که سویه­های 408 و 6010 سمیت و توان کشندگی رده سلولی سرطان روده بزرگ (SW480) را دارند. همچنین نشان داده شـد کـه ایـن اثـر وابـسته بـه غلظت روشناور است (شکل شماره 4) که بر اساس تحلیل XY و رگرسیون غیرخطی محاسبه شد.
 
 
 

 
جدول شماره 1: فعالیت آنتاگونیستی، تولید سیدروفور و مشخصات ژنتیکی سویه های منتخب

سویه	محصول میزبان	درصد فعالیت ضد قارچی					تولید سیدروفور	سویه ی استاندارد با بیشترین میزان شباهت	شماره دسترسی
		P. capsici	P. drechsleri	P. ultimum	R. solani	F. oxysporum
408	گوجه‌ فرنگی	20	30	-	-	-	+	S. thinghirensis DSM 41919T (FM202482)	MN889432
6010	گندم	100	54	100	69	70	-	S. monomycini NRRL B-24309T (JNYL01000005)	MN888938

 
در واقع با افزایش غلظت، اثر بازدارندگی روشناور بر روی رده سلولی سرطانی روده بزرگ افزایش پیدا کرد. چهل و هشت ساعت پس از تیمار سلول­ها 50% مرگ سلولی (IC₅₀) سویه­های 408 و 6010 به ترتیب در غلظت­های حجمی_حجمی 47/2% و 71/2 % مشخص شد. بررسی آماری نشان داد که بازدارندگی سویه­های 408 و 6010  بـر سلول­های SW480 با غلظت­های حجمی_حجمی 47/2%  و 71/2 % دارای اخـتلاف معنـی داری است (05/0P<) است. با توجه به این نتایج می توان گفت که اثر بازدارندگی سویه 408 ((v/v) 47/2%) نسبت به سویه 6010 ((v/v) 2.71%) در شرایط یکسان به طور معنی داری بیشتر است. غلظت صفر (ستون سبز رنگ) در نمودار هر دو سویه به عنوان کنترل در نظر گرفته شده و در واقع معرف چاهکی است که تیمار نشده است. سلول­های تیمار شده با غلظت (v/v) 01/0% از سویه 408 همچنان در سطحی نزدیک به سطح کنترل (حدود 8% مرگ سلولی) قرار دارد.  
پس از افزایش 10 برابری غلظت معادل (v/v) 1/0% مرگ سلولی به میزان بسیار ناچیزی (حدود 10% مرگ سلولی) از سطح کنترل فاصله گرفت. در غلظت (v/v) 1% تقریباً کمی به IC₅₀ نزدیک شد (حدود 30% مرگ سلولی).
تیمار با غلظت­های بالاتر معادل (v/v) 10% و (v/v) 20% مرگ سلولی بالایی (حدود 80% مرگ سلولی) را نشان داد. در تیمار با غلظت (v/v) 01/0% از روشناور سویه 6010 نیز مرگ سلولی نزدیک به کنترل (حدود10% مرگ سلولی) بود. در غلظت (v/v) 1/0% از کنترل فاصله بیشتری گرفته و به حدود 25% مرگ سلولی رسید. در غلظت (v/v) 1% مرگ در تقریباً نیمی از سلول­ها (حدود  40% مرگ سلولی) مشاهده شد. در غلظت‌ 10% مرگ همچنان نزدیک به 50 درصد بود. در حالی که در تیمار با غلظت 20% (v/v) بیش از 90% مرگ سلولی مشاهده شد.

شکل شماره 4: نمودار اثرات سلولی روشناور 408 و 6010 بر روی رده سلولی SW480
 

 
بحث
هدف از این مطالعه، بررسی اثرات ضد سرطانی سویه‌های اکتینومیستی جدا شده از خاک بر روی سلول‌های سرطانی روده بود. از آنجایی که داروهای شیمیایی موجود در دنیا جهت درمان سرطان روده دارای عوارض جانبی از جمله ریزش مو، زخم‌های دهان، آسیب عصبی (نوروپاتی)، خونریزی، عفونت، اسهال و استفراغ به صورت شایع هستند، بنابراین درمانی با عوارض کمتر در اولویت‌های بهداشت جهانی قرار دارد. بنابراین، منابع طبیعی با خواص ضد سرطانی و عوارض کمتر مورد توجه چشمگیری قرار دارند (20).
اکتینومیست‌ها یکی از منابع طبیعی هستند که در زیستگاه خاک و آب به وفور مشاهده می شوند و به عنوان امیدوار کننده ترین منبع داروهای جدید برای سرطان به شمار می‌روند. این منابع نامحدود برای صنایع بیوتکنولوژی و دارویی مهم هستند زیرا انواع بسیار زیادی از میکروارگانیسم ها شامل جنس ها و گونه‌های باکتریایی در خاک وجود دارد که تاکنون موفق به شناسایی و بررسی آنها نشده‌ایم (21).
دهانشا و همکاران خاصیت ضد سرطانی Streptomyces artemisiae MCCB 248 در برابر رده سلولی سرطان ریه انسان (NCI-H460) را نشان دادند.
پراشانتی و همکاران نیز با بررسیStreptomyces griseoaurantiacus JUACT 01 بر روی رده سلول‌های سرطانی کبد (Hep G2)، تاثیر آن را بر رشد و تکثیر سلول‌های سرطانی نشان دادند.
دیویس و همکاران در طی مطالعه ای اثرات ضد سرطانی عصاره Streptomyces bingchenggensis ULS14 را بر روی تمام رده‌های سلولی نشان دادند. پس از بررسی ساختار ماده موثره مشخص شد که از نظر ساختاری مشابه استاروسپورین و کیگامایسین است (22).
سیلوا و همکاران (2021) در مطالعه ای دیگر اثرات ضد سلولی متابولیت‌های ثانویه جدا شده از سویه‌های مختلف متعلق به اکتینومیست‌ها را بر روی چندین رده سلول سرطانی بررسی کردند، که نهایتاً مشخص شد ترکیبات دو سویه CMAA 1527 و CMAA 1653 موثر بودند (23). هر روز بر تعداد اکتینومیست‌های جدیدی که شناسایی می شوند اضافه می شود (24).
جهت تایید خاصیت آنتاگونیستی اکتینومیست‌ها، 24 سویه که در ابتدا بر علیه اوومیست فیتوفترا کپسیسی فعالیت ضد قارچی از خود نشان داده بودند، بر علیه 4 قارچ و اوومیست دیگر بررسی شدند. در نهایت دو سویه 408 و 6010 پس از تائید خاصیت آنتاگونیستی آنها برای بررسی اثرات ضد سلولی انتخاب شدند. تاثیر ضد قارچی و ضد اوومیستی اکتینومیست‌ها به وفور گزارش شده است. صادقی و همکاران (2017) نشان دادند که ترکیبات فرار و محلول در آب دو سویه از جنس استرپتومایسس توانایی مهار عامل بیمارگر P. drechsleri را در شرایط آزمایشگاه و گلخانه دارد (25).  
عباسی و همکاران (2020) نشان دادند که تولید سیدروفور توسط سویه‌های SS14 و IT20 توانایی خوبی در کنترل بیماری تحت شرایط گلخانه ای دارند (9).
ترکیبات محلول در آب سویه 6010 توانست به خوبی از رشد سلول‌های سرطانی ممانعت کند. این نتیجه با خصوصیت آنتاگونیستی این سویه بر علیه پنج بیمارگر قارچی و اوومیستی بررسی شده مطابقت داشت. ارتباط میان خاصیت آنتاگونیستی و ضد سرطانی بودن سویه‌های اکتینومیست‌ها در مطالعات دیگر نیز مشاهده شده است.  عبدالعزیز و همکاران (2019) اثرات ضد سرطانی (رده سلولی HepG2)، ضد قارچی، ضد باکتریایی و آنتی اکسیدانی سه استرپتومایسس جدا شده از خاک را نشان دادند (26).
سویه 408 در مقایسه با سویه 6010 تاثیر آنتاگونیستی کمتری داشت و تنها دو بیمارگر اوومیستی را کنترل کرد. هر چند تاثیر ضد سلولی خوبی حتی بهتر از سویه 6010 نشان داد. اثرات ضد سلولی برخی ترکیبات سیدروفوری گزارش شده است. کارونا و همکاران (2017) و پیو و همکاران (2019) اثرات ضد سرطانی سیدروفور را بر روی چندین سلول سرطانی انسانی گزارش کردند (27 و 28).  از آنجا که سویه 408 قادر به تولید سیدروفور است شاید بتوان تاثیر ضد سلولی آن را به این ویژگی نسبت داد. از طرفی ممکن است این سویه با استفاده از دو مکانیسم مختلف یعنی تولید متابولیت‌های محلول در آب و سیدروفور موجب مرگ سلولی شده باشد. فعالیت ضد سرطانی متابولیت‌های جدا شده از Streptomyces به اثبات رسیده است. سویه استرپتومایسسی MUM256 اثرات ضد سلول‌های سرطانی کولون دارد (29).
در این مطالعه سمیت سلولی سویه های 408 و 6010 در برابر رده سلولی سرطانی روده انسان با روش MTT که روشی است برای ارزیابی کارایی دارو مورد بررسی قرار گرفت و مقادیر IC₅₀ توسط اکتینومیست‌های 408 و 6010 بر روی رده سلول سرطانی کولورکتال (SW480) نشان داده شد.
یک داروی درمانی ایده آل باید از سمیت بالایی برخوردار باشد و بتواند بر روی سلول‌های سرطانی با گرید بالا نیز اثر کند. به همین منظور این دو سویه بر روی رده سلولی SW480 که دارای گرید چهارسرطانی است، مورد بررسی قرار گرفت و توانست در برخی از دوزهای تعیین شده مرگ بالای 50% را نمایش دهد. در حالی که، بسیاری از داروهای ضد سرطان مورد استفاده هنوز فاقد خاصیت دارویی ضد سرطانی بر روی این سلول‌های سرطانی هستند (30).
نتایج این تحقیق نشان داد سویه‌های آنتاگونیست بیمارگرهای قارچی و اوومیستی کاندیدهای خوبی برای بررسی اثرات ضد سلولی هستند. بنابراین به دلیل پر هزینه بودن تست های سلولی پیشنهاد می شود در مطالعات مربوط به انتخاب سویه‌هایی با ترکیبات موثر از سویه‌های آنتاگونیست بیمارگرهای قارچی گیاهان استفاده شود. تائید اثرات ضد قارچی و همچنین تولید سیدروفور توسط این سویه ها برای اطمینان از کارآیی سویه ساده، ایمن و ارزان است. لازم به ذکر است با توجه به محدودیت‌هایی از جمله اینکه امکان دارد سلول‌های سرطانی نسبت به این سویه‌ها از خود مقاومت نشان دهند (31). بنابراین ضروری است در مراحل بعدی با شناسایی متابولیت(های) موثر موجود در روشناور، مقاومت دارویی نیز بررسی شود. در نهایت این دو سویه ما را یک قدم به معرفی دارویی جدید برای درمان سرطان روده نزدیک تر خواهد کرد.  
 
 
نتیجه گیری:
نتایج این مطالعه اثرات ضدسرطانی قوی روشناور دو سویه اکتینومیستی را بر روی رشد سلول‌های SW480 سرطان روده بزرگ انسان نشان داد. این دو سویه طی یک مرحله غربالگری ساده، ایمن و ارزان از میان 24 سویه اکتینومیستی انتخاب شدند. با توجه به اثرات ضد سلولی قوی مشاهده شده ادامه مطالعه برای جداسازی و شناسایی متابولیت(های) موثر از این دو سویه به عنوان محصول طبیعی که به طور بالقوه این امکان وجود دارد که موجب درمان سرطان شود، پیشنهاد داده می شود که بر روی آنها بررسی بیشتری انجام شود.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

---