Volume 9, Issue 36 (9-2019)
P. 43-52
P. 53-66
Abstract
(3615 Views) |
چکیده |
Full-Text (PDF)
(1609 Downloads)
| Highlights
Production of silver Nano particle by mesophilic aerobic bacteria isolated from Persian Gulf
Marzieh Khodaverdi Tajabadi 1, Babak Kheyrkhah 2*, Kumarss Amini 3
1 Department of Microbiology, School of Basic Sciences, Kerman Branch, Islamic Azad University, Kerman, Iran.
2 Assistant Professor, Department of Microbiology, School of Basic Sciences, Kerman Branch, Islamic Azad University, Kerman, Iran.
3 Associate Professor, Department of Microbiology, School of Basic Sciences, Saveh Branch, Islamic Azad University, Saveh, Iran.
*Corresponding author: Dr. Babak Kheyrkhah, Department of Microbiology, Kerman Branch, Islamic Azad University, Kerman, Iran.
E-mail: babakkheirkhah@yahoo.com
Abstract
Aim and Background: Nanoparticles are widely used in medical, pharmaceutical and health sciences. The aim of this project was to evaluate the mesophilic bacteria isolated from the Gulf coast in the production of silver nanoparticles and investigate the antimicrobial effect of these nanoparticles on some pathogenic bacteria.
Material and methods: This descriptive and cross-sectional study was performed over a period of 8-month from April to November 2017. The isolates were purified from water and sediments samples of the coasts of Hormozgan Province - Iran, after that the purified isolates were cultivated in Zobell Marine Broth medium. The obtained supernatant of the medium was added to the silver nitrate (AgNO3) solution (0/001 M) with (1:5) ratio at the light condition in order to the reduction of AgNO3 to metallic silver. The synthesis of silver nanoparticles (AgNPs) was investigated by UV-Vis spectrophotometer, Transmission electron microscope(TEM), and Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy analysis. The antimicrobial activity of AgNPs was evaluated against 6 microbes.
Results: The results indicated that supernatants of all isolates are capable of producing silver nanoparticles. The surface plasmon resonance of AgNPs showed a maximum peak near 420 nm, which UV–vis spectra correspond to the absorbance of AgNPs. The results of TEM micrographs image of silver nanoparticles produced by dominant strain showed spherical shapes and size of 2/88 to 19 nm. The synthesized AgNPs showed the antimicrobial activity and inhibitory effects on the growth of tested microbes.
Conclusion: The desired isolates have a potential ability to producing AgNPs, and to summarize, this is a low cost, ecofriendly, and quick method for the synthesis of AgNPs.
Keywords: Aerobic mesophilic bacteria, Persian Gulf, silver nanoparticles.
تولید نانوذرههای نقره توسط باکتریهای هوازی مزوفیل جداسازی شده از آبهای خلیج فارس
مرضیه خداوردی تاجآبادی 1، بابک خیرخواه 2*، کیومرث امینی 3
1 دانشآموخته کارشناسی ارشد، گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، واحد کرمان، دانشگاه آزاد اسلامی، کرمان، ایران.
2 استادیار، گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، واحد کرمان، دانشگاه آزاد اسلامی، کرمان، ایران.
3 استادیار، گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، واحد ساوه، دانشگاه آزاد اسلامی، ساوه، ایران.
* مولف مسئول: دکتر بابک خیرخواه- گروه میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرمان.
ایمیل نویسنده مسئول : babakkheirkhah@yahoo.com
چکیده
سابقه و هدف: نانوذرهها کاربرد وسیعی در علوم پزشکی و دارویی و بهداشتی دارند. هدف از انجام پروژه حاضر، ارزیابی باکتریهای مزوفیل جداسازی شده از سواحل خلیج‌فارس در تولید نانوذرههای نقره و بررسی اثر ضد میکروبی این نانوذرهها بر روی برخی از باکتریهای پاتوژن میباشد.
مواد و روشها: این مطالعه توصیفی-مقطعی در یک بازه زمانی8 ماهه از اردیبهشت لغایت آذر 1396انجام شد. پس ازخالص سازی جدایه ها از آب و رسوب ها ازسواحل استان هرمزگان و کشت در محیط زوبل مارین براث، سوپر ناتانت حاصل در شرایط نوری به نسبت 1به5 بامحلول نیترات نقره 001/0مولاربه جهت احیای فلزی تیمارشد.وجود نانو ذره های نقره از طریق اسپکتروفتومتر،میکروسکوپ الکترونی TEM،آنالیز FTIR وخواص ضد میکروبی ،نانو ذره ها علیه 6 میکروب مورد بررسی قرار گرفت.
یافته ها:سوپر ناتانت کلیه جدایه ها توانایی تولید نانو ذره های نقره را دارد .در اسپکتروفتومتر نقطه اوج 420 نانو متر، مربوط به رزونانس پلاسمون سطحی نانو ذره های نقره است ونتایج FTIR وجود ترکیبات احتمالی، دخیل در تولید نانو ذره ها را اثبات کرد.تصاویر میکروسکوپ الکترونیTEM نانو ذره های تولیدی توسط سویه برتر را کروی شکل با ابعاد19-88/2نانومتر نشان داد وخواص ضد میکروبی با توانایی مهار، رشد میکروب ها توسط نانو ذره های تولیدی مشخص شد.
نتیجه گیری:جدایه های مورد نظر توان تولید نانو ذره های نقره را دارند واین روش تولید برای محیط زیست ایمن،واز نظر اقتصادی وزمان به صرفه است.
واژههای کلیدی: باکتری مزوفیل هوازی، خلیج‌فارس، نانوذره های نقره
مقدمه
امروزه علم نانو یا نانو فناوری به‌سرعت در حال رشد میباشد و فناوری نانو درمجموع توصیف فناوری و علم مربوط به نانوذرهها است و افزایش دامنه تحقیقها و تنظیم فعل و انفعالها در سطح سلولی بین مواد مصنوعی و سیستمهای بیولوژیک را در پی دارد. از نانوذرهها میتوان به‌عنوان یک ابزار کارآمد برای کشف بر ترین فرآیندها در پروسهی بیولوژیکی و علوم پزشکی استفاده کرد (1). تولید نانوذرههای نقره یک دستاورد شگرف علمی از علم نانوتکنولوژی است که در عرصههای مختلف علوم پزشکی و صنایع مختلف مثل کشاورزی، دامپروری، آرایشی و بهداشتی کاربرد دارد (2). امروزه سنتز نانوذرههای فلزی بهخصوص نانوذره های نقره بهدلیل اهمیت زیستی و کاربردهای پزشکی بسیار موردتوجه قرارگرفته‌اند. به‌طورکلی سه روش شیمیایی، فیزیکی و بیولوژیکی به‌منظور سنتز این نانوذرههای نقره بهکار میرود؛ در روشهای فیزیکی و شیمیایی علاوه بر تحمیل هزینه‌های بالا، آلودگیهای زیست‌محیطی بسیاری را به همراه دارند (3، 4). تولید نانوذرههای نقره توسط روشهای زیستی علاوه بر ارزان بودن وعدم نیازبه تجهیزهای گران قیمت و به‌کارگیری روشهای آسان و در نظر گرفتن این نکته که ازلحاظ پایداری نسبت به روشهای شیمیایی و فیزیکی از پایداری بالاتری برخوردار خواهند بود، به‌مرور جایگزین روشهای فوق خواهند شد ( 5). از طرفی توسعه مقاومتهای آنتیبیوتیکی علیه میکروارگانیسمها به یک مشکل تبدیل‌شده است و با توجه به اینکه حدود 70 درصد از اکوسیستمهای کره زمین را آبها پوشانده‌اند و دارای تنوع عظیم میکروبی هستند؛ میکروارگانیسمهای آب‌شور کمتر موردتوجه قرارگرفته‌اند (6). در سالهای اخیر جستجو برای منابع بالقوه از تحمل فلزی میکروارگانیسمها ،قارچها، سیانو باکتریها و جلبکهای آب‌شور برای سنتز نانوذرههای فلزی کم تر بوده است. در این روش از گیاهان و میکروارگانیسمهایی مانند باکتریها، قارچها، مخمرها و اکتینومیستها جهت تولید نانوذرهها استفاده میشود. هنگامی‌که میکروارگانیسمها در معرض نمکهای فلزی قرار میگیرند ، با استفاده از آنزیم های خاص مانند: NADH ردوکتاز و یا نیترات ردوکتاز یون های فلزی را احیا و نانو ذره ها رابه صورت داخل سلولی و یا خارج سلولی تولید میکنند (7). باکتریها در مقایسه با قارچها به دلیل کاربرد آسان‌تر موردتوجه گرفته‌اند. از تشکیل مواد بیولوژیکی معدنی توسط باکتریها به تازگی گزارشهایی ارائه گردیدهاست ازجمله : تشکیل نانوکریستالهای لانتیوم توسط باکتری سودوموناس آنروژِینوزا و اشرشیا کلی در محیط حاوی نیترات لانتیوم است. میزان مقاومت باکتری به یونهای فلزی و تشکیل ذرههای معدنی به ترکیبهای محیط رشد و ظرفیت جذب سلولها برای جذب یونهای فلزی سنگین وابسته است. تیوباسیلوس فرواکسیدانس و تیوباسیلوس تیواکسیدانس قادر به فروشویی سولفیدهای معدنی و تولید نانوذرههای نقره است. یکی از مثالهای باکتریهای تجمع دهندهی فلزات، سودوموناس استاتزری است که قادر به تولید نانوذرههای نقره کمتر از 400 نانومتراست. با توجه به خاصیت ضدمیکروبی نقره بایستی مکانیسمهایی در باکتری سودوموناس استاتزری وجود داشتهباشد که سبب مقاومت این باکتری به نقره است (8، 9، 10، 11). با توجه به اینکه بیوتکنولوژی میکروبی دریا راه نوینی برای پیدا کردن میکروارگانیسمهای جدید جهت استفاده از پتانسیلهای بالقوه آنها محسوب میشود؛ آبهای شور میتوانند منبع خوبی برای تحمل فلزی میکروارگانیسمها باشد (12). از نانوذرههای نقره میتوان به‌عنوان دارو در درمان بیماریهای پوستی مانند جوش، انواع جراحتها، سوختگیها، بیماریهای باکتریایی، بیماریهای قارچی، بیماریهای گوارشی، بیماریهای عفونی و بیماریهای جنسی استفاده کرد. در مواد دندانی، نانوذرههای نقره با قطر ذرههای اولیه کوچکتر از 40 نانومتر به‌عنوان یک ضد باکتری در طول فرآیند پلیمریزاسیون استفاده میشوند (13). نانوذره های نقره بااتصال به گلیکوپروتئین 120 کیلودالتونی که در سطح ویروس ایدز قرار دارد مانع از چسبیدن ویروس ایدز به سلولهای زنده میشود. دانشمندان در حال حاضر مشغول ساختن مادهای با استفاده از این نانوذرهها برای پیشگیری از ایدز هستند (14 و 15). در ایران تولید نانوذرههای نقره با استفاده از میکروبهای آب‌شور موردبررسی قرار نگرفته لذا لزوم توجه به پتانسیل باکتریهای مزوفیل جداسازی شده خلیج‌فارس احساس شده و در پژوهش حاضر این پتانسیل در مقیاس آزمایشگاهی بررسی گردید؛ لذا در این مطالعه به جداسازی باکتریهای مزوفیل هوازی دارای توانمندی تولید نانوذرههای نقره از آبهای شور خلیج‌فارس پرداخته شد و سویههای برتر شناسایی و معرفی گردیدند.
روش کار
نمونهبرداری از آب دریا و جداسازی باکتریها
در این مطالعهی توصیفی-مقطعی که در یک بازه زمانی 8 ماهه از ابتدای اردیبهشت لغایت انتهای آذر 1396 انجام گردید، نمونه آب و رسوبها از سواحل و مناطق مختلف خلیج‌فارس ازجمله ساحل بندرلنگه، ساحل شهر بندرعباس، ساحل میشین، جزیره قشم و جزیره هرمز در بطریهای استریل درب پیچدار جمع‌آوری شد و با رعایت شرایط سرمایی 5-2 درجه سانتی گراد در جعبه یخ به آزمایشگاه منتقل گردید. در آزمایشگاه، از کلیهی نمونهها در شرایط استریل رقتهای سریالی در محلول رینگر (شرکت فرآورده هایی تزریقی ودارویی-ایران )تهیه شد و از رقت های تهیه‌شده در شرایط استریل مقدار 2/0 میلیلیتر در سطح محیط کشت پلیت کانت آگار (مرک-آلمان )ریخته شد و کشت سطحی انجام شد و محیط های کشت به مدت 48 ساعت در دمای 30 درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری شدند (انکوباتور مدل بهداد-ایران )و سپس ازلحاظ رشد و عدم رشد مورد پایش قرار گرفتند. براساس خصوصیتهای ظاهری، باکتریهای رشد کرده انتخاب و در سطح محیطهای کشت پلیت کانت آگار به‌صورت خطی برای گرفتن کلنی خالص کشت داده شد و پس‌ازآن در دمای 30 درجه سانتی گراد به مدت 48-24 ساعت گرم خانه گذاری شدند و ازلحاظ خلوص موردبررسی قرار گرفتند. به‌منظور اطمینان از جداسازی میکروارگانیسمها با منبع دریایی علاوه بر محیط پلیت کانت آگار از محیط اختصاصی زوبل مارینآگار (هیمدیا-هند)و زوبلمارینبراث (هیمدیا-هند)نیز استفاده شد.
بررسی توانایی تولید نانوذرههای نقره توسط جدایهها
از کلیه جدایههای به‌دست‌آمده با منبع دریایی و چند جدایه که منبع دریایی نداشتند که در مرحلهی غربالگری خالصسازی و از آنها کشت جوان تهیه‌شده بود. سوسپانسیون باکتریایی معادل نیم مک فارلند تهیه و به مقدار 1 میلی لیتر به محیط کشت تلفیقی نوترینتبراث(مرک-آلمان) و زوبل مارین براث که به آن 7 درصد آب و رسوب های دریا اضافه شده بود، تلقیح شد. کلیهی محیطها در دمای30 درجه سانتی گراد به مدت 48 ساعت در انکوباتور شیکردار(مدل بهداد-ایران)، دور rpm150 قرار داده شدند و سپس از سوپرناتانت )روماند) و بیومس )توده زیستی( رشد کرده برای تولید نانوذرههای نقره به دو روش عمل شد. درروش اول بعد از سانتریفیوژ(مدل بهداد-ایران) محیط کشت در شرایط استریل در دور rpm 5000 به مدت 20 دقیقه روماند حاصل جداسازی و به نسبت 1 به 5 به محلول نیترات نقره 001/0 مولار(فلوکا-فرانسه) تلقیح و در شرایط نوری قرار داده‌شد و ازلحاظ تولید نانوذرهها مورد پایش قرار گرفتند. درروش دوم از تودهی زیستی به‌دست‌آمده از محیط کشت بعد از سانتریفیوژ به نسبت 1به 5 به محلول نیترات نقره 001/0 مولار افزوده شد و نمونه در شرایط تاریکی )فویل آلومینیومی) به مدت 48 ساعت و روشنایی در عرض چند ثانیه نگهداری و ازلحاظ تولید نانوذرهها نقره مورد پایش قرار گرفتند. محلولهایی که دارای رنگ خرمایی بودند میتوانند حاوی نانوذرههای نقره باشند که برای ادامه کار و اثبات نانوذرهها نقره از روشهای دستگاهی استفاده شد. از کلیه نانوذرههای نقره تولیدی در پروژه حاضر ارزیابیهای حساسیت ضد میکروبی به روش رقتسازی در مایع[1] صورت گرفت. در تمام مراحل این واکنش از سویه باسیلوس سرئوس ATCC 25922 به عنوان سویهای ناتوان در تولید نانوذره استفاده شد.لازم به ذکر است که میکرو ارگانیسم ها با احیایونهای نقره از نمک های نقره به فرم اتمی سبب بقا خود میشوند.
اندازه گیری جذب نوری محلول های حاوی نانو ذره های نقره توسط دستگاه اسپکتروفتومترUV-VIS
اندازه گیری جذب نوری محلول ها بعد از گذشت 2 ساعت از زمان واکنش روماند جدایه ها با نیترات نقره به تفکیک در طول موج های 500-250نانو متر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر(فتونیکسAR.2015-ایران)انجام ونتایج یادداشت شد.
روش طیف‌سنجی تبدیل فوریه مادون‌قرمز[2] (FTIR)
این آنالیز برای محلولهای حاوی نانوذرات نقره تولیدی که دارای پایداری بالا و رنگ خرمایی و خواص ضد میکروبی مطلوبتری انجام شد. این روش به شناسایی تعاملات بین نمک نقره وپروتئین وسایر ترکیبات احتمالی دخیل در تولید نانوذره های نقره کمک می کند.در این آزمون 4 نمونه انتخاب و در دستگاه FTIR مدل تنسور 27 مورد آنالیز دستگاهی قرار گرفتند.
تصویربرداری میکروسکوپ الکترونی گذاره (TEM [3])
برای اثبات وجود نانوذرههای نقره و همچنین تعیین اندازه، شکل، آرایش و پوشش پروتئینی اطراف آنها از بین کلیهی نانوذرههای نقره تولیدی فقط یک نمونه که خواص ضد میکروبی مطلوبتری داشت و در آنالیزهای دستگاهی اولیه اثبات شده بودند و برای تصویربرداری توسط TEM به آزمایشگاه ارسال گردیدند. ابتدا محلول توسط پنبه و قیف (برای تفکیک به تر و تراکم کم تر) صاف و سپس محلول به مدت 15 دقیقه سونیکیت شد و سپس یک قطره از نمونه بر روی صفحههای مسی پوشیده شده با کربن قرار داده شد تا لایه‌نازکی از نمونه حاصل شود و با استفاده از دستمالهای مخصوص نمونه اضافی برداشته شد و این نمونه با TEM تصویربرداری گردید.
شناسایی باکتری تولیدکنندهی نانوذرههای نقره به روش مولکولی
علاوه بر مشاهدههای مورفولوژیکی و انجام آزمایش های بیوشیمیایی از روش تعیین توالی ژن 16SrRNA نیز جهت اثبات جنس باکتری موردنظر استفاده شد. استخراج DNA با استفاده از کیت شرکت سیناژن (مدل: EX6071) انجام شد. پس از انتخاب پرایمرهای مناسب و بلاست [4] نمودن آنها در سایت NCBI، واکنش PCR به حجم نهایی 25 میکرو لیتر شامل 5/12 میکرو لیتر PCR master mix 5X (سینا کلون، ایران) حاوی (U/μl05/0) Taq DNA polymerase ،(Mm3) MgCl2 و (Mm4/0) dNTPs ، 8/ 0 میکرو لیتر از هر یک از پرایمرها به غلظت 8/0 میکرومولار، 1 میکرو لیتر از DNA الگو (10 نانوگرم) و 3/8 میکرو لیتر آب دو بار تقطیر استریل با استفاده از گرادیانت ترموسایکلر (اپندورف، آلمان) برای 30 سیکل به‌صورت زیر انجام گرفت؛ با انتخاب برنامه مرتبط به‌صورت ذیل عمل گردید: گام اول واسرشت ثانویه 94 درجه سانتی گراد 50 ثانیه، گام دوم اتصال آغازگر 55 درجه برای 45 ثانیه، گام سوم بسط اولیه 72 درجه سانتی گراد برای 2 دقیقه و یک بسط نهایی 72 درجه برای 10 دقیقه در نظر گرفته شد. در پایان، محصول های واکنش PCR در ژل آگارز 1% حاوی اتیدیوم بروماید (µg/ml 0.5) الکتروفورز گردید. همچنین محصولهای PCR با استفاده از روش سانگر و توسط شرکت ژن فن اوران تعیین توالی گردید.
جدول 1- توالی الیگونوکلئوتیدی پرایمرهای استفاده شده در مطالعه پیش رو
رسم درخت فیلوژنتیک
بعد از توالی یابی و شناسایی جدایهها، درخت فیلوژنتیک برای سویههای برتر رسم شد (تصویر 3). هم‌ردیفی توالی ژن 16SrRNA نمونهها به همراه تعدادی از گونه‌های جنس مارینوباکتر به روش ماسل [5] در برنامه مگا 6[6] انجام گرفت و سپس ارتباط تبارشناسی سویه‌ها با روش الحاق همسایگی مشخص شد. همچنین درخت تبار شناختی رسم شده، توسط گونه‌ی سراشیا اودوریفرا سویه XY21 به عنوان گروه خارجی[7] ، ریشه‌دار گردید.
تعیین کمترین غلظت مهاری نانوذرهها بر برخی از باکتریهای پاتوژن
در این مطالعه سویههای اشرشیا کلی ATCC 25922، سودوموناس آئروژینوزا ATCC 27853، استافیلوکوکوس اورئوس ATCC 25922، باسیلوس سرئوس ATCC 21772 و انتروکوکوس فکالیس ATCC 29212وکاندیدا آلبیکنز ATCC1778 از بانک میکروبی دانشگاه علوم پزشکی ایران تهیه شدند. سویههای موردمطالعه با استفاده از محیطهای افتراقی، انتخابی و اختصاصی و با استفاده از تستهای بیوشیمیایی تائید هویت گردیدند. آزمون تعیین حساسیت آنتیبیوتیکی به‌منظور تعیین کمترین غلظت مهاری (MIC) با استفاده از روش رقتسازی لولهای و بر اساس دستورالعمل مؤسسه استانداردهای آزمایشگاهی و بالینی (CLSI) انجام گردید. بهطور خلاصه، ابتدا محلول ذخیره با غلظت 1024 میلی‌گرم در میلیلیتر از نانوذره تهیه و سپس، رقتهای سریالی با طیف 1 تا 512 میلی‌گرم در میلیلیتر در لوله‌های مولر هینتون براث (مرک- آلمان) فراهم گردید. عمل تلقیح سوسپانسیون میکروبی با کدورت نیم مک فارلند به لوله‌های براث حاوی نانوذره انجام شد. پس از 24 ساعت نگه داری در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوباتور، اولین لولهای که فاقد کدورت قابل‌مشاهده بود، به عنوان MIC تعیین و ثبت گردید.
یافتهها
کشت نمونهها
در محیط پلیت کانت آگار (مرک- آلمان) درمجموع در مرحله غربال گری اولیه 39 و در محیط کشت زوبل مارین آگار (هیمدیا-هند) 16جدایه باکتریایی جداسازی و خالص شدند. انواع کلنی ازنظر شکل، رنگ و نوع از نمونههای مختلف جدا شد. در محیط کشت تهیه‌شده بر پایه آب دریا نیز 27 جدایه باکتری جدا گردید.
ارزیابی نمونههای با منبع دریایی و غیردریایی برای تولید نانوذره های نقره
نتایج ارزیابی تولید نانوذرههای نقره توسط روماند و بیومس از جدایهها با منبع دریایی و غیردریایی به شرح جدول 2 و 3 میباشد.
نتایج ارزیابی تولید نانوذرههای نقره با دستگاه اسپکتروفتومتر
برای اطمینان از تولید نانوذرههای نقره در نمونههای موردنظر، جذب نوری محلولهای به‌دست‌آمده در طول‌موج‌های مختلف اندازه‌گیری شد که در جدول 4 آمده است. بدون در نظر گرفتن نمونه بیش ترین جذب نوری مربوط به طول‌موج 420 نانومتر و کم ترین جذب نوری در 550 نانومتر میباشد.
نتایج آنالیز تبدیل فوریه مادون‌قرمز (FTIR)
در مورد محلولهای موردنظر خصوصیتهای بیشتر نانوذرههای نقره تولیدی با استفاده از طیف‌سنجی تبدیل فوریه مادون‌قرمز از نمونههای مایع شفاف باکتریها که با نیترات نقره 001/0 مولار تیمار شدهبود و سپس در نور به رنگ خرمایی تغییر داده بود توسط دستگاهFTIR ، جذب باندها در نواحی ذیل گزارش شد :)تصویر7-4)
a″2= 3463, 2065, 1634, 546 cm-1
D= 3463, 2065, 1635, 547 cm-1
y2= 3462, 2066, 1635, 556cm-1
y7= 3463, 2065, 1636, 547cm -1
نتایج تصویربرداری میکروسکوپ الکترونی TEM
نتایج و تصاویر میکروسکوپ الکترونی گذاره نشان‌دهندهی حضور نانوذرههای نقره بوده که اندازهی آنها متغیر بوده و دارای شکل کروی و بدون چسبندگی (غیر آگریگه) به یکدیگر بوده که پوشش پروتئینی اطراف آنها نیز قابل‌مشاهده است (تصویر2)
شناسایی میکروارگانیسم به روش تعیین ترادف ژن 16S rRNA
تصویر ژل آگارز حاصل از تکثیر ژن 16S rRNA سویههای موردنظر در تصویر 1 آورده شده است. همچنین محصولهای PCR با استفاده از روش سانگر و توسط شرکت ژن فن آوران تعیین توالی گردید. نتایج حاصل از تعیین توالی نشان داد که با ایدینتیتی[8] بالای 98% این سویه احتمالا مربوط به جنس مارینوباکتر سویه np-4 با اگزشن نامبر kt763388.1[9] میباشد.
درخت فیلوژنتیک
درخت فیلوژنی از سویهی برتر با نام مارینو باکتر سویه np-4 ترسیم گردید. ارزش بوت استرپ با بیان درصد از 1000 تکرار در بالای شاخه‌ها نشان داده‌شده است و شاخه‌های بالای50 درصد ارزش قابل استناد محسوب شد.
نتایج حاصل از آزمون سنجش حساسیت میکروبی به نانوذرات نقره تولیدی
نتایج آزمون حساسیت میکروبی به نانوذرات نقره تولیدی درروش رقتسازی لولهای بر سویههای موردنظر در جدول 5 ذکرشده است.
بحث
تولید نانوذرههای فلزی و نانو ساختارها به علت خواص نوری، شیمیایی، فتوشیمیایی و الکتریکی غیرمعمولی که دارند، جالب‌توجه است. فلزهایی مانند نقره و طلا که رزونانس پلاسمون سطحی قوی دارند بسیار حایز اهمیت هستند. ذرههای نانو کریستالی نقره کاربردهای عمده‌ای در تشخیصهای بیومولکولی بسیار حساس، خواص ضدمیکروبی، درمان، کاتالیز و ساخت سنسورها دارند (16). نانوذرههای نقره از طریق موجودهای زنده مانند میکروارگانیسمها از قبیل قارچها، باکتریها، مخمرها و یا ماکروارگانیسمها مانند گیاهان، جلبکها و غیره سنتز میشود (17)که استفاده از میکروارگانیسمهای مختلف یک پروتکل کم‌هزینه و سازگار با محیط زیست برای سنتز نانوذرههای نقره است ؛ با توجه به مشکلهای عمده‌ای که در روشهای فیزیکی و شیمیایی برای تولید نانوذره وجود دارد نیاز به روشهایی آسان، کم‌هزینه، ایمن، غیرسمی و سازگار با محیط‌زیست وجود دارد (16). رسوب های دریایی بهطور معمول حاوی یک مخزن از کربن آلی و مواد مغذی ضروری است و فرض بر این است که فعالیتهای آنزیمی در رسوب های دریایی نسبت به آب دریا افزایش می یابد (18).
در این تحقیق تولید نانوذرهها توسط میکروارگانیسمها نشان داده‌شده است. در مرحلهی اول بر روی محیط پایه پلیت کانت که درصد بالایی از میکروارگانیسمها بر روی این محیط رشد میکنند تعداد 39 کلنی خالص شد. در مرحله بعد از محیط کشت زوبل مارین آگار که محیط کشت اختصاصی برای رشد باکتریهای دریایی است و به تقلید از آب دریا فرموله شده است استفاده شد که تعداد 16کلنی خالص شد و از محیط کشت تهیه شده از تلفیق نوترینت براث و زوبل مارین براث با آب دریا نیز 27 کلنی جدا شد.
مشکل بزرگ سنتز نانوذرهها بر پایهی بیولوژیک، سرعت‌پایین آن است اما در این‌گونه باکتریها در عرض چند ثانیه از مایع شفاف رویی و در عرض 24 تا 48 ساعت از توده زیستی باکتری نانوذرههای نقره شروع به تولید و سنتز میکند و تغییر رنگ از زرد به قهوه‌ای یا خرمایی صورت میگیرد و این رنگ پایدار است و حتی بعد از گذشت 40-30 روز یا بیشتر و این نانوذرهها نیاز به پایدارکننده ندارد در بعضی موارد تولید نانوذرهها توسط عصارهی گیاهان ناپایداری مشاهده میشود که باید توسط مواد شیمیایی یا عصارههای زیستی پایدار شوند (22). نتایج حاصل از این پژوهش با نتایج حاصل از پژوهش Malarcodi و همکاران در سال 2013 (19) و Sechardi و همکاران در سال 2012 کاملاً مشابه بود (19). طیفهای اسپکتوفتومتری UV-Vis بهطور کامل نشان‌دهنده افزایش ارتعاشهای پلاسمون رزونانس سطحی در طول‌موج 420 نانومتر است که برای همه‌سویه‌ها طول‌موج 420 نانومتر اوج پیک نانوذرهها است که نشان‌دهندهی پیک نانوذرههای نقره است که با نتایج کار حاصل از پژوهش Shivakrishna و همکاران در هندوستان در سال 2013 و Sechardi و همکاران در سال 2012 بهطور کامل مشابه بودهاست (20 و 21).
در بین نمونههای دریایی 4 نمونه که رنگ خرمایی پررنگتر داشتند و سرعت به تر و بیشتری در تولید نانوذرههای نقره نشان دادند برای آنالیز FTIR انتخاب شدند. نتایج حاصل از پیک اثبات کننده حفظ ساختار دوم پروتئینها پس از برهم‌کنش با نانوذرهها است. بنابراین پروتئینهای حاصل از باکتریها نه‌تنها عامل احیای یون نقرهاند، بلکه این پروتئینها اطراف نانوذرهها را فراگرفتهاند و مانع از تجمع و آلگومره شدن نانوذرهها شدهاند که این نتایج با نتایج Dee pa و همکاران در هندوستان در سال 2013 (22) و Yokesh Babu و همکاران در سال 2013 در هندوستان (23) مشابهت و همخوانی داشت.
پس از ظهور و افزایش مقاومت باکتریها و دیگر میکروارگانیسمها به آنتی‌بیوتیک‌ها تحقیقهای بسیاری در سطح آزمایشگاهی برای کشف مواد جایگزین آنتی‌بیوتیک‌ها انجام‌شده است. نقره در فرم یونی یا در ابعاد خاص خاصیت ضدمیکروبی بالایی داشته و میتواند برای کنترل میکروبهای بیماریزا نسبت به آنتی‌بیوتیک‌ها کاربرد داشته باشد(24). در تحقیق اخیر اشرشیا کلی و سودوموناس آئروژینوزا در رقتهایmg/ml 16/1به‌عنوان کمترین غلظت مهاری، کاندیدا آلبیکنز رقت mg/ml 8/1 به‌عنوان کمترین غلظت مهاری، باسیلوس سرئوس و استافیلوکوکوس ارئوس رقت mg/ml 4/1 به‌عنوان کمترین غلظت مهاری در نظر گرفته شد و نتیجهی اثر ضدمیکروبی نانوذرههای سنتز شده توسط باکتری که با نتایج حاصل از کار Yokesh Babu و همکاران (23) در سال 2013 همخوانی داشت که تحقیقهای مشابه بر روی دیسکهای دیفیوژن این تست انجام‌شده بود ولی این تحقیق بر روش رقتسازی لولهای و تعیین کمترین غلظت مهاری و کمترین غلظت کشندگی انجام گرفت که از دقت و اطمینان بیشتری برخوردار است.
تصاویر بهدست آمده از میکروسکوپ الکترونی گذاره نشان میدهد که گسترهی اندازهی نانوذرهها در محدودهی 88-19/2 نانومتر کروی[10] و پوشش پروتئینی در اطراف آنها است. بنابراین پروتئینهای باکتریایی نه‌تنها عامل احیای یون نقرهاند بلکه یک سری از این پروتئینها اطراف نانوذرهها را فراگرفتهاند و عامل پایداری و مانع چسبندگی و تجمع[11] نانوذرهها میگردند و این ذرهها حتی بعد از گذشت 50-40 روز پایداری[12] خود را حفظ کردند. مزیت ارزیابی باکتریهای جداشده از خلیج‌فارس در تولید نانوذرههای نقره در این است که در این خصوص قبلا کاری صورت نگرفته است.
نتیجه‌گیری
به‌طورکلی نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که باکتریهای جدا شده با منبع دریایی و درصد بالایی از باکتریهای غیردریایی از خلیج‌فارس قادر به تولید نانوذرههای نقره به‌صورت درون و برون سلولی میباشند که این عمل با استفاده از آنزیمها و پروتئینها که باکتریها به محیط ترشح میکنند، صورت میگیرد و نیاز به استخراج نداشته و بدون داشتن هزینه و مشکلهای ناشی از استخراج میتوانند مورداستفاده قرار گیرند.
سپاسگزاری
از کلیهی مسئولین محترم دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرمان آزمایشگاه تحقیقاتی پاسارگاد (تهران) که در انجام کارهای آزمایشگاهی و تهیهی نمونههای این تحقیق کمال همکاری و مساعدت لازم را مبذول فرمودهاند، سپاسگزاری فراوان میگردد.
جدول 2- نتایج تولید نانوذره های نقره تولیدی توسط روماند و بیومس جدایه های بدست آمده
جدول 3 - نتایج تولید نانوذره های نقره تولیدی توسط روماند جدایه های با منبع غیر دریایی
جدول 4 - نتایج اندازه گیری جذب نوری نانوذره های سنتز شده در طول موج های مختلف
جدول 5- حداقل غلظت ممانعت کنندگی نانوذره ها بر سویه های مورد نظر
تصویر1: ژل آگارز حاصل از تکثیر ژن 16S rRNA ایزوله های مورد نظر. باند M؛ سایز مارکرbp DNA size marker 100 (فرمنتاز)، باندC+؛ کنترل مثبت (سودوموناس آئروژینوزا ATCC 15442)، باند 1؛ ایزوله مورد نظر با طول باند bp 1500، باندC-؛ کنترل منفی (آب مقطر)
تصویر2: تصاویر میکروسکوپ الکترونی TEM مربوط به نانوذره های سنتز شده در دو مقیاس (کروی و بدون چسبندگی)
تصویر 3. درخت فیلوژنی از سویه برتر با نام مارینوباکتر np-4
تصویر 4 طیف جذبیFTIRاز نمونه a”2
تصویر 6 طیف جذبیFTIRاز نمونه y2
منابع
1. Moharrer S., Mohammadi B., Gharamohammadi RA, Yargoli M. Biological synthesis of silver nanoparticles by Aspergillus flavus, isolated from soil of Ahar copper mine. Indi J sci tech. 2012. 5(S3):2443-4.
2. Souza GIH, Macato PD, Duran N, Esposito E. Utilization of Fusarium oxysporum in the biosynthesis of silver nanoparticles and its antibacterial activities. In: Proceed .IX Nation Meet . Enviro Micrib, 2004:25.
3. Sharma VK, Yangard RA, Lin Y. Silver nanoparticles: Green synthesis and their antimicrobial activities. Adv Colloid Interface Sci, 2009, 145(1-2):83-96.
4 .Haefeli C, Franklin C, Hardy K. Plasmid-determined silver resistance in Pseudomonas stutzeri isolated from a silver mine. J Bacter, 1984. 158(1):389-92.
5. Mandal D, Bolander ME, Mukhopadhyay D, Sarkar G, Mukherjee P.
Marzieh Khodaverdi Tajabadi 1, Babak Kheyrkhah 2*, Kumarss Amini 3
1 Department of Microbiology, School of Basic Sciences, Kerman Branch, Islamic Azad University, Kerman, Iran.
2 Assistant Professor, Department of Microbiology, School of Basic Sciences, Kerman Branch, Islamic Azad University, Kerman, Iran.
3 Associate Professor, Department of Microbiology, School of Basic Sciences, Saveh Branch, Islamic Azad University, Saveh, Iran.
*Corresponding author: Dr. Babak Kheyrkhah, Department of Microbiology, Kerman Branch, Islamic Azad University, Kerman, Iran.
E-mail: babakkheirkhah@yahoo.com
Abstract
Aim and Background: Nanoparticles are widely used in medical, pharmaceutical and health sciences. The aim of this project was to evaluate the mesophilic bacteria isolated from the Gulf coast in the production of silver nanoparticles and investigate the antimicrobial effect of these nanoparticles on some pathogenic bacteria.
Material and methods: This descriptive and cross-sectional study was performed over a period of 8-month from April to November 2017. The isolates were purified from water and sediments samples of the coasts of Hormozgan Province - Iran, after that the purified isolates were cultivated in Zobell Marine Broth medium. The obtained supernatant of the medium was added to the silver nitrate (AgNO3) solution (0/001 M) with (1:5) ratio at the light condition in order to the reduction of AgNO3 to metallic silver. The synthesis of silver nanoparticles (AgNPs) was investigated by UV-Vis spectrophotometer, Transmission electron microscope(TEM), and Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy analysis. The antimicrobial activity of AgNPs was evaluated against 6 microbes.
Results: The results indicated that supernatants of all isolates are capable of producing silver nanoparticles. The surface plasmon resonance of AgNPs showed a maximum peak near 420 nm, which UV–vis spectra correspond to the absorbance of AgNPs. The results of TEM micrographs image of silver nanoparticles produced by dominant strain showed spherical shapes and size of 2/88 to 19 nm. The synthesized AgNPs showed the antimicrobial activity and inhibitory effects on the growth of tested microbes.
Conclusion: The desired isolates have a potential ability to producing AgNPs, and to summarize, this is a low cost, ecofriendly, and quick method for the synthesis of AgNPs.
Keywords: Aerobic mesophilic bacteria, Persian Gulf, silver nanoparticles.
تولید نانوذرههای نقره توسط باکتریهای هوازی مزوفیل جداسازی شده از آبهای خلیج فارس
مرضیه خداوردی تاجآبادی 1، بابک خیرخواه 2*، کیومرث امینی 3
1 دانشآموخته کارشناسی ارشد، گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، واحد کرمان، دانشگاه آزاد اسلامی، کرمان، ایران.
2 استادیار، گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، واحد کرمان، دانشگاه آزاد اسلامی، کرمان، ایران.
3 استادیار، گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، واحد ساوه، دانشگاه آزاد اسلامی، ساوه، ایران.
* مولف مسئول: دکتر بابک خیرخواه- گروه میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرمان.
ایمیل نویسنده مسئول : babakkheirkhah@yahoo.com
چکیده
سابقه و هدف: نانوذرهها کاربرد وسیعی در علوم پزشکی و دارویی و بهداشتی دارند. هدف از انجام پروژه حاضر، ارزیابی باکتریهای مزوفیل جداسازی شده از سواحل خلیج‌فارس در تولید نانوذرههای نقره و بررسی اثر ضد میکروبی این نانوذرهها بر روی برخی از باکتریهای پاتوژن میباشد.
مواد و روشها: این مطالعه توصیفی-مقطعی در یک بازه زمانی8 ماهه از اردیبهشت لغایت آذر 1396انجام شد. پس ازخالص سازی جدایه ها از آب و رسوب ها ازسواحل استان هرمزگان و کشت در محیط زوبل مارین براث، سوپر ناتانت حاصل در شرایط نوری به نسبت 1به5 بامحلول نیترات نقره 001/0مولاربه جهت احیای فلزی تیمارشد.وجود نانو ذره های نقره از طریق اسپکتروفتومتر،میکروسکوپ الکترونی TEM،آنالیز FTIR وخواص ضد میکروبی ،نانو ذره ها علیه 6 میکروب مورد بررسی قرار گرفت.
یافته ها:سوپر ناتانت کلیه جدایه ها توانایی تولید نانو ذره های نقره را دارد .در اسپکتروفتومتر نقطه اوج 420 نانو متر، مربوط به رزونانس پلاسمون سطحی نانو ذره های نقره است ونتایج FTIR وجود ترکیبات احتمالی، دخیل در تولید نانو ذره ها را اثبات کرد.تصاویر میکروسکوپ الکترونیTEM نانو ذره های تولیدی توسط سویه برتر را کروی شکل با ابعاد19-88/2نانومتر نشان داد وخواص ضد میکروبی با توانایی مهار، رشد میکروب ها توسط نانو ذره های تولیدی مشخص شد.
نتیجه گیری:جدایه های مورد نظر توان تولید نانو ذره های نقره را دارند واین روش تولید برای محیط زیست ایمن،واز نظر اقتصادی وزمان به صرفه است.
واژههای کلیدی: باکتری مزوفیل هوازی، خلیج‌فارس، نانوذره های نقره
مقدمه
امروزه علم نانو یا نانو فناوری به‌سرعت در حال رشد میباشد و فناوری نانو درمجموع توصیف فناوری و علم مربوط به نانوذرهها است و افزایش دامنه تحقیقها و تنظیم فعل و انفعالها در سطح سلولی بین مواد مصنوعی و سیستمهای بیولوژیک را در پی دارد. از نانوذرهها میتوان به‌عنوان یک ابزار کارآمد برای کشف بر ترین فرآیندها در پروسهی بیولوژیکی و علوم پزشکی استفاده کرد (1). تولید نانوذرههای نقره یک دستاورد شگرف علمی از علم نانوتکنولوژی است که در عرصههای مختلف علوم پزشکی و صنایع مختلف مثل کشاورزی، دامپروری، آرایشی و بهداشتی کاربرد دارد (2). امروزه سنتز نانوذرههای فلزی بهخصوص نانوذره های نقره بهدلیل اهمیت زیستی و کاربردهای پزشکی بسیار موردتوجه قرارگرفته‌اند. به‌طورکلی سه روش شیمیایی، فیزیکی و بیولوژیکی به‌منظور سنتز این نانوذرههای نقره بهکار میرود؛ در روشهای فیزیکی و شیمیایی علاوه بر تحمیل هزینه‌های بالا، آلودگیهای زیست‌محیطی بسیاری را به همراه دارند (3، 4). تولید نانوذرههای نقره توسط روشهای زیستی علاوه بر ارزان بودن وعدم نیازبه تجهیزهای گران قیمت و به‌کارگیری روشهای آسان و در نظر گرفتن این نکته که ازلحاظ پایداری نسبت به روشهای شیمیایی و فیزیکی از پایداری بالاتری برخوردار خواهند بود، به‌مرور جایگزین روشهای فوق خواهند شد ( 5). از طرفی توسعه مقاومتهای آنتیبیوتیکی علیه میکروارگانیسمها به یک مشکل تبدیل‌شده است و با توجه به اینکه حدود 70 درصد از اکوسیستمهای کره زمین را آبها پوشانده‌اند و دارای تنوع عظیم میکروبی هستند؛ میکروارگانیسمهای آب‌شور کمتر موردتوجه قرارگرفته‌اند (6). در سالهای اخیر جستجو برای منابع بالقوه از تحمل فلزی میکروارگانیسمها ،قارچها، سیانو باکتریها و جلبکهای آب‌شور برای سنتز نانوذرههای فلزی کم تر بوده است. در این روش از گیاهان و میکروارگانیسمهایی مانند باکتریها، قارچها، مخمرها و اکتینومیستها جهت تولید نانوذرهها استفاده میشود. هنگامی‌که میکروارگانیسمها در معرض نمکهای فلزی قرار میگیرند ، با استفاده از آنزیم های خاص مانند: NADH ردوکتاز و یا نیترات ردوکتاز یون های فلزی را احیا و نانو ذره ها رابه صورت داخل سلولی و یا خارج سلولی تولید میکنند (7). باکتریها در مقایسه با قارچها به دلیل کاربرد آسان‌تر موردتوجه گرفته‌اند. از تشکیل مواد بیولوژیکی معدنی توسط باکتریها به تازگی گزارشهایی ارائه گردیدهاست ازجمله : تشکیل نانوکریستالهای لانتیوم توسط باکتری سودوموناس آنروژِینوزا و اشرشیا کلی در محیط حاوی نیترات لانتیوم است. میزان مقاومت باکتری به یونهای فلزی و تشکیل ذرههای معدنی به ترکیبهای محیط رشد و ظرفیت جذب سلولها برای جذب یونهای فلزی سنگین وابسته است. تیوباسیلوس فرواکسیدانس و تیوباسیلوس تیواکسیدانس قادر به فروشویی سولفیدهای معدنی و تولید نانوذرههای نقره است. یکی از مثالهای باکتریهای تجمع دهندهی فلزات، سودوموناس استاتزری است که قادر به تولید نانوذرههای نقره کمتر از 400 نانومتراست. با توجه به خاصیت ضدمیکروبی نقره بایستی مکانیسمهایی در باکتری سودوموناس استاتزری وجود داشتهباشد که سبب مقاومت این باکتری به نقره است (8، 9، 10، 11). با توجه به اینکه بیوتکنولوژی میکروبی دریا راه نوینی برای پیدا کردن میکروارگانیسمهای جدید جهت استفاده از پتانسیلهای بالقوه آنها محسوب میشود؛ آبهای شور میتوانند منبع خوبی برای تحمل فلزی میکروارگانیسمها باشد (12). از نانوذرههای نقره میتوان به‌عنوان دارو در درمان بیماریهای پوستی مانند جوش، انواع جراحتها، سوختگیها، بیماریهای باکتریایی، بیماریهای قارچی، بیماریهای گوارشی، بیماریهای عفونی و بیماریهای جنسی استفاده کرد. در مواد دندانی، نانوذرههای نقره با قطر ذرههای اولیه کوچکتر از 40 نانومتر به‌عنوان یک ضد باکتری در طول فرآیند پلیمریزاسیون استفاده میشوند (13). نانوذره های نقره بااتصال به گلیکوپروتئین 120 کیلودالتونی که در سطح ویروس ایدز قرار دارد مانع از چسبیدن ویروس ایدز به سلولهای زنده میشود. دانشمندان در حال حاضر مشغول ساختن مادهای با استفاده از این نانوذرهها برای پیشگیری از ایدز هستند (14 و 15). در ایران تولید نانوذرههای نقره با استفاده از میکروبهای آب‌شور موردبررسی قرار نگرفته لذا لزوم توجه به پتانسیل باکتریهای مزوفیل جداسازی شده خلیج‌فارس احساس شده و در پژوهش حاضر این پتانسیل در مقیاس آزمایشگاهی بررسی گردید؛ لذا در این مطالعه به جداسازی باکتریهای مزوفیل هوازی دارای توانمندی تولید نانوذرههای نقره از آبهای شور خلیج‌فارس پرداخته شد و سویههای برتر شناسایی و معرفی گردیدند.
روش کار
نمونهبرداری از آب دریا و جداسازی باکتریها
در این مطالعهی توصیفی-مقطعی که در یک بازه زمانی 8 ماهه از ابتدای اردیبهشت لغایت انتهای آذر 1396 انجام گردید، نمونه آب و رسوبها از سواحل و مناطق مختلف خلیج‌فارس ازجمله ساحل بندرلنگه، ساحل شهر بندرعباس، ساحل میشین، جزیره قشم و جزیره هرمز در بطریهای استریل درب پیچدار جمع‌آوری شد و با رعایت شرایط سرمایی 5-2 درجه سانتی گراد در جعبه یخ به آزمایشگاه منتقل گردید. در آزمایشگاه، از کلیهی نمونهها در شرایط استریل رقتهای سریالی در محلول رینگر (شرکت فرآورده هایی تزریقی ودارویی-ایران )تهیه شد و از رقت های تهیه‌شده در شرایط استریل مقدار 2/0 میلیلیتر در سطح محیط کشت پلیت کانت آگار (مرک-آلمان )ریخته شد و کشت سطحی انجام شد و محیط های کشت به مدت 48 ساعت در دمای 30 درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری شدند (انکوباتور مدل بهداد-ایران )و سپس ازلحاظ رشد و عدم رشد مورد پایش قرار گرفتند. براساس خصوصیتهای ظاهری، باکتریهای رشد کرده انتخاب و در سطح محیطهای کشت پلیت کانت آگار به‌صورت خطی برای گرفتن کلنی خالص کشت داده شد و پس‌ازآن در دمای 30 درجه سانتی گراد به مدت 48-24 ساعت گرم خانه گذاری شدند و ازلحاظ خلوص موردبررسی قرار گرفتند. به‌منظور اطمینان از جداسازی میکروارگانیسمها با منبع دریایی علاوه بر محیط پلیت کانت آگار از محیط اختصاصی زوبل مارینآگار (هیمدیا-هند)و زوبلمارینبراث (هیمدیا-هند)نیز استفاده شد.
بررسی توانایی تولید نانوذرههای نقره توسط جدایهها
از کلیه جدایههای به‌دست‌آمده با منبع دریایی و چند جدایه که منبع دریایی نداشتند که در مرحلهی غربالگری خالصسازی و از آنها کشت جوان تهیه‌شده بود. سوسپانسیون باکتریایی معادل نیم مک فارلند تهیه و به مقدار 1 میلی لیتر به محیط کشت تلفیقی نوترینتبراث(مرک-آلمان) و زوبل مارین براث که به آن 7 درصد آب و رسوب های دریا اضافه شده بود، تلقیح شد. کلیهی محیطها در دمای30 درجه سانتی گراد به مدت 48 ساعت در انکوباتور شیکردار(مدل بهداد-ایران)، دور rpm150 قرار داده شدند و سپس از سوپرناتانت )روماند) و بیومس )توده زیستی( رشد کرده برای تولید نانوذرههای نقره به دو روش عمل شد. درروش اول بعد از سانتریفیوژ(مدل بهداد-ایران) محیط کشت در شرایط استریل در دور rpm 5000 به مدت 20 دقیقه روماند حاصل جداسازی و به نسبت 1 به 5 به محلول نیترات نقره 001/0 مولار(فلوکا-فرانسه) تلقیح و در شرایط نوری قرار داده‌شد و ازلحاظ تولید نانوذرهها مورد پایش قرار گرفتند. درروش دوم از تودهی زیستی به‌دست‌آمده از محیط کشت بعد از سانتریفیوژ به نسبت 1به 5 به محلول نیترات نقره 001/0 مولار افزوده شد و نمونه در شرایط تاریکی )فویل آلومینیومی) به مدت 48 ساعت و روشنایی در عرض چند ثانیه نگهداری و ازلحاظ تولید نانوذرهها نقره مورد پایش قرار گرفتند. محلولهایی که دارای رنگ خرمایی بودند میتوانند حاوی نانوذرههای نقره باشند که برای ادامه کار و اثبات نانوذرهها نقره از روشهای دستگاهی استفاده شد. از کلیه نانوذرههای نقره تولیدی در پروژه حاضر ارزیابیهای حساسیت ضد میکروبی به روش رقتسازی در مایع[1] صورت گرفت. در تمام مراحل این واکنش از سویه باسیلوس سرئوس ATCC 25922 به عنوان سویهای ناتوان در تولید نانوذره استفاده شد.لازم به ذکر است که میکرو ارگانیسم ها با احیایونهای نقره از نمک های نقره به فرم اتمی سبب بقا خود میشوند.
اندازه گیری جذب نوری محلول های حاوی نانو ذره های نقره توسط دستگاه اسپکتروفتومترUV-VIS
اندازه گیری جذب نوری محلول ها بعد از گذشت 2 ساعت از زمان واکنش روماند جدایه ها با نیترات نقره به تفکیک در طول موج های 500-250نانو متر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر(فتونیکسAR.2015-ایران)انجام ونتایج یادداشت شد.
روش طیف‌سنجی تبدیل فوریه مادون‌قرمز[2] (FTIR)
این آنالیز برای محلولهای حاوی نانوذرات نقره تولیدی که دارای پایداری بالا و رنگ خرمایی و خواص ضد میکروبی مطلوبتری انجام شد. این روش به شناسایی تعاملات بین نمک نقره وپروتئین وسایر ترکیبات احتمالی دخیل در تولید نانوذره های نقره کمک می کند.در این آزمون 4 نمونه انتخاب و در دستگاه FTIR مدل تنسور 27 مورد آنالیز دستگاهی قرار گرفتند.
تصویربرداری میکروسکوپ الکترونی گذاره (TEM [3])
برای اثبات وجود نانوذرههای نقره و همچنین تعیین اندازه، شکل، آرایش و پوشش پروتئینی اطراف آنها از بین کلیهی نانوذرههای نقره تولیدی فقط یک نمونه که خواص ضد میکروبی مطلوبتری داشت و در آنالیزهای دستگاهی اولیه اثبات شده بودند و برای تصویربرداری توسط TEM به آزمایشگاه ارسال گردیدند. ابتدا محلول توسط پنبه و قیف (برای تفکیک به تر و تراکم کم تر) صاف و سپس محلول به مدت 15 دقیقه سونیکیت شد و سپس یک قطره از نمونه بر روی صفحههای مسی پوشیده شده با کربن قرار داده شد تا لایه‌نازکی از نمونه حاصل شود و با استفاده از دستمالهای مخصوص نمونه اضافی برداشته شد و این نمونه با TEM تصویربرداری گردید.
شناسایی باکتری تولیدکنندهی نانوذرههای نقره به روش مولکولی
علاوه بر مشاهدههای مورفولوژیکی و انجام آزمایش های بیوشیمیایی از روش تعیین توالی ژن 16SrRNA نیز جهت اثبات جنس باکتری موردنظر استفاده شد. استخراج DNA با استفاده از کیت شرکت سیناژن (مدل: EX6071) انجام شد. پس از انتخاب پرایمرهای مناسب و بلاست [4] نمودن آنها در سایت NCBI، واکنش PCR به حجم نهایی 25 میکرو لیتر شامل 5/12 میکرو لیتر PCR master mix 5X (سینا کلون، ایران) حاوی (U/μl05/0) Taq DNA polymerase ،(Mm3) MgCl2 و (Mm4/0) dNTPs ، 8/ 0 میکرو لیتر از هر یک از پرایمرها به غلظت 8/0 میکرومولار، 1 میکرو لیتر از DNA الگو (10 نانوگرم) و 3/8 میکرو لیتر آب دو بار تقطیر استریل با استفاده از گرادیانت ترموسایکلر (اپندورف، آلمان) برای 30 سیکل به‌صورت زیر انجام گرفت؛ با انتخاب برنامه مرتبط به‌صورت ذیل عمل گردید: گام اول واسرشت ثانویه 94 درجه سانتی گراد 50 ثانیه، گام دوم اتصال آغازگر 55 درجه برای 45 ثانیه، گام سوم بسط اولیه 72 درجه سانتی گراد برای 2 دقیقه و یک بسط نهایی 72 درجه برای 10 دقیقه در نظر گرفته شد. در پایان، محصول های واکنش PCR در ژل آگارز 1% حاوی اتیدیوم بروماید (µg/ml 0.5) الکتروفورز گردید. همچنین محصولهای PCR با استفاده از روش سانگر و توسط شرکت ژن فن اوران تعیین توالی گردید.
جدول 1- توالی الیگونوکلئوتیدی پرایمرهای استفاده شده در مطالعه پیش رو
| توالی الیگونوکلئوتیدی ('3→'5) | قطعه مورد نظر |
| F:AGAGTTTGATCCTGG CTCAG R:CGGTTACCTTGTTACGACTT |
16SrRNA |
رسم درخت فیلوژنتیک
بعد از توالی یابی و شناسایی جدایهها، درخت فیلوژنتیک برای سویههای برتر رسم شد (تصویر 3). هم‌ردیفی توالی ژن 16SrRNA نمونهها به همراه تعدادی از گونه‌های جنس مارینوباکتر به روش ماسل [5] در برنامه مگا 6[6] انجام گرفت و سپس ارتباط تبارشناسی سویه‌ها با روش الحاق همسایگی مشخص شد. همچنین درخت تبار شناختی رسم شده، توسط گونه‌ی سراشیا اودوریفرا سویه XY21 به عنوان گروه خارجی[7] ، ریشه‌دار گردید.
تعیین کمترین غلظت مهاری نانوذرهها بر برخی از باکتریهای پاتوژن
در این مطالعه سویههای اشرشیا کلی ATCC 25922، سودوموناس آئروژینوزا ATCC 27853، استافیلوکوکوس اورئوس ATCC 25922، باسیلوس سرئوس ATCC 21772 و انتروکوکوس فکالیس ATCC 29212وکاندیدا آلبیکنز ATCC1778 از بانک میکروبی دانشگاه علوم پزشکی ایران تهیه شدند. سویههای موردمطالعه با استفاده از محیطهای افتراقی، انتخابی و اختصاصی و با استفاده از تستهای بیوشیمیایی تائید هویت گردیدند. آزمون تعیین حساسیت آنتیبیوتیکی به‌منظور تعیین کمترین غلظت مهاری (MIC) با استفاده از روش رقتسازی لولهای و بر اساس دستورالعمل مؤسسه استانداردهای آزمایشگاهی و بالینی (CLSI) انجام گردید. بهطور خلاصه، ابتدا محلول ذخیره با غلظت 1024 میلی‌گرم در میلیلیتر از نانوذره تهیه و سپس، رقتهای سریالی با طیف 1 تا 512 میلی‌گرم در میلیلیتر در لوله‌های مولر هینتون براث (مرک- آلمان) فراهم گردید. عمل تلقیح سوسپانسیون میکروبی با کدورت نیم مک فارلند به لوله‌های براث حاوی نانوذره انجام شد. پس از 24 ساعت نگه داری در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوباتور، اولین لولهای که فاقد کدورت قابل‌مشاهده بود، به عنوان MIC تعیین و ثبت گردید.
یافتهها
کشت نمونهها
در محیط پلیت کانت آگار (مرک- آلمان) درمجموع در مرحله غربال گری اولیه 39 و در محیط کشت زوبل مارین آگار (هیمدیا-هند) 16جدایه باکتریایی جداسازی و خالص شدند. انواع کلنی ازنظر شکل، رنگ و نوع از نمونههای مختلف جدا شد. در محیط کشت تهیه‌شده بر پایه آب دریا نیز 27 جدایه باکتری جدا گردید.
ارزیابی نمونههای با منبع دریایی و غیردریایی برای تولید نانوذره های نقره
نتایج ارزیابی تولید نانوذرههای نقره توسط روماند و بیومس از جدایهها با منبع دریایی و غیردریایی به شرح جدول 2 و 3 میباشد.
نتایج ارزیابی تولید نانوذرههای نقره با دستگاه اسپکتروفتومتر
برای اطمینان از تولید نانوذرههای نقره در نمونههای موردنظر، جذب نوری محلولهای به‌دست‌آمده در طول‌موج‌های مختلف اندازه‌گیری شد که در جدول 4 آمده است. بدون در نظر گرفتن نمونه بیش ترین جذب نوری مربوط به طول‌موج 420 نانومتر و کم ترین جذب نوری در 550 نانومتر میباشد.
نتایج آنالیز تبدیل فوریه مادون‌قرمز (FTIR)
در مورد محلولهای موردنظر خصوصیتهای بیشتر نانوذرههای نقره تولیدی با استفاده از طیف‌سنجی تبدیل فوریه مادون‌قرمز از نمونههای مایع شفاف باکتریها که با نیترات نقره 001/0 مولار تیمار شدهبود و سپس در نور به رنگ خرمایی تغییر داده بود توسط دستگاهFTIR ، جذب باندها در نواحی ذیل گزارش شد :)تصویر7-4)
a″2= 3463, 2065, 1634, 546 cm-1
D= 3463, 2065, 1635, 547 cm-1
y2= 3462, 2066, 1635, 556cm-1
y7= 3463, 2065, 1636, 547cm -1
نتایج تصویربرداری میکروسکوپ الکترونی TEM
نتایج و تصاویر میکروسکوپ الکترونی گذاره نشان‌دهندهی حضور نانوذرههای نقره بوده که اندازهی آنها متغیر بوده و دارای شکل کروی و بدون چسبندگی (غیر آگریگه) به یکدیگر بوده که پوشش پروتئینی اطراف آنها نیز قابل‌مشاهده است (تصویر2)
شناسایی میکروارگانیسم به روش تعیین ترادف ژن 16S rRNA
تصویر ژل آگارز حاصل از تکثیر ژن 16S rRNA سویههای موردنظر در تصویر 1 آورده شده است. همچنین محصولهای PCR با استفاده از روش سانگر و توسط شرکت ژن فن آوران تعیین توالی گردید. نتایج حاصل از تعیین توالی نشان داد که با ایدینتیتی[8] بالای 98% این سویه احتمالا مربوط به جنس مارینوباکتر سویه np-4 با اگزشن نامبر kt763388.1[9] میباشد.
درخت فیلوژنتیک
درخت فیلوژنی از سویهی برتر با نام مارینو باکتر سویه np-4 ترسیم گردید. ارزش بوت استرپ با بیان درصد از 1000 تکرار در بالای شاخه‌ها نشان داده‌شده است و شاخه‌های بالای50 درصد ارزش قابل استناد محسوب شد.
نتایج حاصل از آزمون سنجش حساسیت میکروبی به نانوذرات نقره تولیدی
نتایج آزمون حساسیت میکروبی به نانوذرات نقره تولیدی درروش رقتسازی لولهای بر سویههای موردنظر در جدول 5 ذکرشده است.
بحث
تولید نانوذرههای فلزی و نانو ساختارها به علت خواص نوری، شیمیایی، فتوشیمیایی و الکتریکی غیرمعمولی که دارند، جالب‌توجه است. فلزهایی مانند نقره و طلا که رزونانس پلاسمون سطحی قوی دارند بسیار حایز اهمیت هستند. ذرههای نانو کریستالی نقره کاربردهای عمده‌ای در تشخیصهای بیومولکولی بسیار حساس، خواص ضدمیکروبی، درمان، کاتالیز و ساخت سنسورها دارند (16). نانوذرههای نقره از طریق موجودهای زنده مانند میکروارگانیسمها از قبیل قارچها، باکتریها، مخمرها و یا ماکروارگانیسمها مانند گیاهان، جلبکها و غیره سنتز میشود (17)که استفاده از میکروارگانیسمهای مختلف یک پروتکل کم‌هزینه و سازگار با محیط زیست برای سنتز نانوذرههای نقره است ؛ با توجه به مشکلهای عمده‌ای که در روشهای فیزیکی و شیمیایی برای تولید نانوذره وجود دارد نیاز به روشهایی آسان، کم‌هزینه، ایمن، غیرسمی و سازگار با محیط‌زیست وجود دارد (16). رسوب های دریایی بهطور معمول حاوی یک مخزن از کربن آلی و مواد مغذی ضروری است و فرض بر این است که فعالیتهای آنزیمی در رسوب های دریایی نسبت به آب دریا افزایش می یابد (18).
در این تحقیق تولید نانوذرهها توسط میکروارگانیسمها نشان داده‌شده است. در مرحلهی اول بر روی محیط پایه پلیت کانت که درصد بالایی از میکروارگانیسمها بر روی این محیط رشد میکنند تعداد 39 کلنی خالص شد. در مرحله بعد از محیط کشت زوبل مارین آگار که محیط کشت اختصاصی برای رشد باکتریهای دریایی است و به تقلید از آب دریا فرموله شده است استفاده شد که تعداد 16کلنی خالص شد و از محیط کشت تهیه شده از تلفیق نوترینت براث و زوبل مارین براث با آب دریا نیز 27 کلنی جدا شد.
مشکل بزرگ سنتز نانوذرهها بر پایهی بیولوژیک، سرعت‌پایین آن است اما در این‌گونه باکتریها در عرض چند ثانیه از مایع شفاف رویی و در عرض 24 تا 48 ساعت از توده زیستی باکتری نانوذرههای نقره شروع به تولید و سنتز میکند و تغییر رنگ از زرد به قهوه‌ای یا خرمایی صورت میگیرد و این رنگ پایدار است و حتی بعد از گذشت 40-30 روز یا بیشتر و این نانوذرهها نیاز به پایدارکننده ندارد در بعضی موارد تولید نانوذرهها توسط عصارهی گیاهان ناپایداری مشاهده میشود که باید توسط مواد شیمیایی یا عصارههای زیستی پایدار شوند (22). نتایج حاصل از این پژوهش با نتایج حاصل از پژوهش Malarcodi و همکاران در سال 2013 (19) و Sechardi و همکاران در سال 2012 کاملاً مشابه بود (19). طیفهای اسپکتوفتومتری UV-Vis بهطور کامل نشان‌دهنده افزایش ارتعاشهای پلاسمون رزونانس سطحی در طول‌موج 420 نانومتر است که برای همه‌سویه‌ها طول‌موج 420 نانومتر اوج پیک نانوذرهها است که نشان‌دهندهی پیک نانوذرههای نقره است که با نتایج کار حاصل از پژوهش Shivakrishna و همکاران در هندوستان در سال 2013 و Sechardi و همکاران در سال 2012 بهطور کامل مشابه بودهاست (20 و 21).
در بین نمونههای دریایی 4 نمونه که رنگ خرمایی پررنگتر داشتند و سرعت به تر و بیشتری در تولید نانوذرههای نقره نشان دادند برای آنالیز FTIR انتخاب شدند. نتایج حاصل از پیک اثبات کننده حفظ ساختار دوم پروتئینها پس از برهم‌کنش با نانوذرهها است. بنابراین پروتئینهای حاصل از باکتریها نه‌تنها عامل احیای یون نقرهاند، بلکه این پروتئینها اطراف نانوذرهها را فراگرفتهاند و مانع از تجمع و آلگومره شدن نانوذرهها شدهاند که این نتایج با نتایج Dee pa و همکاران در هندوستان در سال 2013 (22) و Yokesh Babu و همکاران در سال 2013 در هندوستان (23) مشابهت و همخوانی داشت.
پس از ظهور و افزایش مقاومت باکتریها و دیگر میکروارگانیسمها به آنتی‌بیوتیک‌ها تحقیقهای بسیاری در سطح آزمایشگاهی برای کشف مواد جایگزین آنتی‌بیوتیک‌ها انجام‌شده است. نقره در فرم یونی یا در ابعاد خاص خاصیت ضدمیکروبی بالایی داشته و میتواند برای کنترل میکروبهای بیماریزا نسبت به آنتی‌بیوتیک‌ها کاربرد داشته باشد(24). در تحقیق اخیر اشرشیا کلی و سودوموناس آئروژینوزا در رقتهایmg/ml 16/1به‌عنوان کمترین غلظت مهاری، کاندیدا آلبیکنز رقت mg/ml 8/1 به‌عنوان کمترین غلظت مهاری، باسیلوس سرئوس و استافیلوکوکوس ارئوس رقت mg/ml 4/1 به‌عنوان کمترین غلظت مهاری در نظر گرفته شد و نتیجهی اثر ضدمیکروبی نانوذرههای سنتز شده توسط باکتری که با نتایج حاصل از کار Yokesh Babu و همکاران (23) در سال 2013 همخوانی داشت که تحقیقهای مشابه بر روی دیسکهای دیفیوژن این تست انجام‌شده بود ولی این تحقیق بر روش رقتسازی لولهای و تعیین کمترین غلظت مهاری و کمترین غلظت کشندگی انجام گرفت که از دقت و اطمینان بیشتری برخوردار است.
تصاویر بهدست آمده از میکروسکوپ الکترونی گذاره نشان میدهد که گسترهی اندازهی نانوذرهها در محدودهی 88-19/2 نانومتر کروی[10] و پوشش پروتئینی در اطراف آنها است. بنابراین پروتئینهای باکتریایی نه‌تنها عامل احیای یون نقرهاند بلکه یک سری از این پروتئینها اطراف نانوذرهها را فراگرفتهاند و عامل پایداری و مانع چسبندگی و تجمع[11] نانوذرهها میگردند و این ذرهها حتی بعد از گذشت 50-40 روز پایداری[12] خود را حفظ کردند. مزیت ارزیابی باکتریهای جداشده از خلیج‌فارس در تولید نانوذرههای نقره در این است که در این خصوص قبلا کاری صورت نگرفته است.
نتیجه‌گیری
به‌طورکلی نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که باکتریهای جدا شده با منبع دریایی و درصد بالایی از باکتریهای غیردریایی از خلیج‌فارس قادر به تولید نانوذرههای نقره به‌صورت درون و برون سلولی میباشند که این عمل با استفاده از آنزیمها و پروتئینها که باکتریها به محیط ترشح میکنند، صورت میگیرد و نیاز به استخراج نداشته و بدون داشتن هزینه و مشکلهای ناشی از استخراج میتوانند مورداستفاده قرار گیرند.
سپاسگزاری
از کلیهی مسئولین محترم دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرمان آزمایشگاه تحقیقاتی پاسارگاد (تهران) که در انجام کارهای آزمایشگاهی و تهیهی نمونههای این تحقیق کمال همکاری و مساعدت لازم را مبذول فرمودهاند، سپاسگزاری فراوان میگردد.
جدول 2- نتایج تولید نانوذره های نقره تولیدی توسط روماند و بیومس جدایه های بدست آمده
| نام جدایه | مایع رویی در نور تولید رنگ خرمایی |
مایع رویی در تاریکی |
بیومس در نور |
بیومس در تاریکی |
| T2 | + | ⁻ | ⁻ | ⁻ |
| S1 | + | ⁻ | ⁻ | ⁻ |
| a1 | + | ⁻ | ⁻ | ⁻ |
| a 1 | + | ⁻ | ⁻ | ⁻ |
| a 1 | + | ⁻ | ⁻ | + |
| D | + | ⁻ | ⁻ | + |
| g"1 | + | ⁻ | ⁻ | ⁻ |
| 2Y | + | ⁻ | ⁻ | + |
| 7Y | + | ⁻ | + | + |
جدول 3 - نتایج تولید نانوذره های نقره تولیدی توسط روماند جدایه های با منبع غیر دریایی
| نام جدایه | نمونه ها رشد یافته |
| g3 | + |
| F1 | + |
| N1 | + |
| D2 | + |
| B8 | + |
جدول 4 - نتایج اندازه گیری جذب نوری نانوذره های سنتز شده در طول موج های مختلف
| طول موج(nm) نام جدایه |
350 | 400 | 420 | 450 | 500 | 550 |
| T2 | 648/0 | 674/0 | 830/0 | 79/0 | 634/0 | 452/0 |
| S1 | 656/0 | 684/0 | 855/0 | 845/0 | 774/0 | 656/0 |
| a1 | 642/0 | 622/0 | 722/0 | 650/0 | 514/0 | 370/0 |
| a 1 | 656/0 | 666/0 | 808/0 | 756/0 | 622/0 | 480/0 |
| a 1 | 650/0 | 680/0 | 845/0 | 820/0 | 669/0 | 438/0 |
| D | 644/0 | 668/0 | 820/0 | 780/0 | 626/0 | 442/0 |
| g"1 | 658/0 | 684/0 | 855/0 | 835/0 | 796/0 | 798/0 |
| 2Y | 640/0 | 662/0 | 808/0 | 764/0 | 598/0 | 396/0 |
| 7Y | 658/0 | 690/0 | 875/0 | 865/0 | 645/0 | 440/0 |
جدول 5- حداقل غلظت ممانعت کنندگی نانوذره ها بر سویه های مورد نظر
| نام میکروارگانیسم | حداقل غلظت ممانعت کنندگی(MIC) |
| کاندیدا آلبیکنز | 8/1 (میلی گرم بر میلی لیتر) |
| اشریشیا کلی | 16/1 (میلی گرم بر میلی لیتر) |
| انتروکوکوس فکالیس | 4/1 (میلی گرم بر میلی لیتر) |
| سودوموناس آئروژینوزا | 16/1 (میلی گرم بر میلی لیتر) |
| باسیلوس سرئوس | 4/1 (میلی گرم بر میلی لیتر) |
| استافیلوکوکوس ارئوس | 4/1 (میلی گرم بر میلی لیتر) |
تصویر1: ژل آگارز حاصل از تکثیر ژن 16S rRNA ایزوله های مورد نظر. باند M؛ سایز مارکرbp DNA size marker 100 (فرمنتاز)، باندC+؛ کنترل مثبت (سودوموناس آئروژینوزا ATCC 15442)، باند 1؛ ایزوله مورد نظر با طول باند bp 1500، باندC-؛ کنترل منفی (آب مقطر)
تصویر2: تصاویر میکروسکوپ الکترونی TEM مربوط به نانوذره های سنتز شده در دو مقیاس (کروی و بدون چسبندگی)
تصویر 3. درخت فیلوژنی از سویه برتر با نام مارینوباکتر np-4
|
تصویر 5 طیف جذبیFTIR از نمونه d
|
تصویر 6 طیف جذبیFTIRاز نمونه y2
منابع
1. Moharrer S., Mohammadi B., Gharamohammadi RA, Yargoli M. Biological synthesis of silver nanoparticles by Aspergillus flavus, isolated from soil of Ahar copper mine. Indi J sci tech. 2012. 5(S3):2443-4.
2. Souza GIH, Macato PD, Duran N, Esposito E. Utilization of Fusarium oxysporum in the biosynthesis of silver nanoparticles and its antibacterial activities. In: Proceed .IX Nation Meet . Enviro Micrib, 2004:25.
3. Sharma VK, Yangard RA, Lin Y. Silver nanoparticles: Green synthesis and their antimicrobial activities. Adv Colloid Interface Sci, 2009, 145(1-2):83-96.
4 .Haefeli C, Franklin C, Hardy K. Plasmid-determined silver resistance in Pseudomonas stutzeri isolated from a silver mine. J Bacter, 1984. 158(1):389-92.
5. Mandal D, Bolander ME, Mukhopadhyay D, Sarkar G, Mukherjee P.
