جستجو در مقالات منتشر شده


۱۰ نتیجه برای کلونینگ

سمیه احتشام ، سید محسن اصغری، افسانه صدر ممتاز ،
دوره ۲، شماره ۷ - ( ۶-۱۳۹۱ )
چکیده

سابقه و هدف: الاستاز حاصل از سودوموناس آئروجینوزا یک آنزیم مهم در زمینه مطالعات بنیادی بر روی Zn-متالوپروتئازها و نیز بعنوان فاکتور ویرولانس این باکتری مطرح است. در این مطالعه ژن مربوط به آنزیم الاستاز از سودوموناس آئروجینوزا (PAE) استخراج و کلون شده و پس از بیان و تخلیص، خصوصیات بیوشیمیایی آن شامل دما و pH بهینه و نیز فعالیت در حور حلالهای آلی گلیسرول، دی متیل فرمامید (DMF)، متانول، اتانول، اتیلن گلایکول و ایزوپروپانول مورد مطالعه قرار گرفت.

مواد و روشها: تایید گونه باکتری با تستهای بیوشیمیایی شامل سیترات، SIM، MR-VP و TSI انجام شد. DNA ژنومی توسط کیت استخراج و با پرایمر اختصاصی بوسیله PCR ژن الاستاز بدست آمد. کلونینگ در وکتور pET۲۱a(+) با مکان های برش HindIII و NdeI صورت گرفت. ترانسفورماسیون به روش شیمیایی انجام شد. سپس سلول ها در محیط LB تحت القای IPTG ۱mM قرار گرفته و زمان و شرایط تولید بهینه گردید.

یافته ها: بدنبال تایید گونه باکتریایی توسط تستهای بیوشیمیایی، DNA ژنومی استخراج شد و سپس ژن PAE به کمک پرایمر اختصاصی توسط PCR جدا شد. ژن الاستاز که بصورت پری پرو الاستاز کد می شود، درون وکتور) pET۲۱a(+ کلون و در باکتری E. coli سویه BL۲۱ ترانسفورم گردید. آنالیز سکانس نوکلئوتیدی ژن یک چارچوب خوانش (ORF) دارای ۱۴۹۷ جفت باز که ۴۹۷ آمینواسید را کد می کند نشان داد. بدنبال القاء به کمک IPTG آنزیم فعال در درون سلول یافت شد. سپس آنزیم توسط کروماتوگرافی تمایلی تخلیص گردید. بررسی خصوصیات آنزیم از قبیل دمای بهینه، pH بهینه و غیر فعال سازی حرارتی برگشت ناپذیرانجام شد و همچنین فعالیت آنزیم در حضور حلالهای آلی بررسی گردید و بخوبی نشان داده شد که آنزیم مذکور از مقاومت و فعالیت بسیار بالایی در حلالهای آلی برخوردار است.

نتیجه گیری:آنزیم الاستاز سویه PTCC ۱۴۳۰ در مقایسه با آنزیم سویه PAO۱، که ساختار کریستالی آن تعیین شده، تنها یک تغییر در ناحیه سیگنال را نشان می دهد. خصوصیات بیوشیمیایی نشان می دهد که الاستاز یک آنزیم با پایداری زیاد در حلال های آلی است.


اکبر حیدری، مهرداد موسی زاده مقدم، حسین آقا ملایی، محمد باقر یخچالی، بیژن بمبئی، علی محمد لطیفی، محمد هیئت،
دوره ۳، شماره ۹ - ( ۱۱-۱۳۹۱ )
چکیده

سابقه و هدف : لیپازها بیوکاتالیست های ارزشمندی هستند که به علت کاتالیز نمودن واکنش های شیمیایی مانند آبکافت، کافت الکلی، کافت اسیدی و استرفیکاسیون در صنعت دارای کاربردهای فراوانی می باشند. لیپازهای میکروبی از مهمترین انواع این آنزیم ها هستند که به علت پایداری بالا در حلال های آلی، توانایی کاتالیز ملایم واکنش های هیدرولازی، سهولت در تولید و هزینه های نسبتا پایین آن یکی از مهمترین منابع تولید در صنعت محسوب می گردند. باکتری باسیلوس پومیلوس یکی از مهمترین منابع میکروبی این آنزیم می باشد، اما بیان و ترشح پایین این لیپاز یکی از مهمترین مشکلات پیش رو جهت تولید آن توسط این باکتری محسوب می شود. هدف از این تحقیق تولید نوترکیب آنزیم لیپاز سویه بومی باسیلوس پومیلوس بصورت ترشحی به منظور افزایش سطح بیان آن در باکتری باسیلوس سوبتیلیس می باشد.

مواد و روش ها : ژن تولید کننده آنزیم لیپاز این سوش با استفاده از مهندسی ژنتیک در پلاسمید pWB۹۸۰ همسانه سازی شد و پس از آن به سوش باسیلوس سوبتیلیس WB۶۰۰ به عنوان میزبان منتقل گردید. در ادامه سطح بیان و ترشح آنزیم به صورت طبیعی و نوترکیب بررسی و مقایسه گردید.

یافته ها: آنزیم لیپاز در باسیلوس سوبتیلیس بصورت ترشحی بیان شد. میزان بیان این آنزیم نسبت به سوش طبیعی بیشتر می باشد.

نتیجه گیری : تولیدنوترکیب لیپاز باسیلوس پومیلوس در باکتری باسیلوس سوبتیلیس روش مناسبی برای افزایش میزان بیان این آنزیم می باشد.


محمدتقی برجیان بروجنی، سید امید رعنایی سیادت، شیرین یوسفیان، فرناز نیکزاد جمنانی،
دوره ۳، شماره ۹ - ( ۱۱-۱۳۹۱ )
چکیده

سابقه و هدف: فیتیک‌اسید، یکی از ترکیبات معدنی بسیار مهمی است که در درون گیاهان ذخیره‌ می‌شود. فیتاز ( E.C. ۳,۱.۳.۸ یا E.C. ۳.۱.۳.۲۶ ) به صورت گسترده‌ای به عنوان یک افزودنی جهت افزایش جذب فسفر و سایر عناصر در حیوانات تک‌معده‌ای به غذای آنها اضافه شده و بدین ترتیب سبب کاهش دفع فسفات به داخل محیط می‌گردد. در این تحقیق، کلونینگ و افزودن برچسب شش آمینواسیدی هیستیدین به ژن نوترکیب فیتاز در باکتری اشرشیا‌کلی و سپس مخمر، به منظور خالص‌سازی آنزیم تولید شده در مقادیر بالا در این میزبان، انجام شد.

مواد و روش‌ها: توالی پروتئینی آنزیم فیتاز قارچ P. lycii از بانک های اطلاعاتی پروتئین استخراج شده و با توجه به ترجیح کدنی مخمر ، توالی ژن طراحی و سنتز گردید. با طراحی پرایمرهای مناسب توالی حاوی شش هیستیدین به ژن مورد نظر داخل حامل دوگانه­ی pFPMTMF ۱۴α'> اضافه شده و در نهایت با استفاده از الکتروپوریشن به داخل مخمر انتقال یافت.

یافته‌ها: سازه‌ی نوترکیب حاوی ژن فیتاز به همراه برچسب شش آمینواسیدی هیستیدین تولید شد. حضور ژن در داخل باکتری و مخمر با استفاده از روش‌های هضم آنزیمی و PCR تایید گردید.

نتیجه­گیری: کلونینگ موفق ژن فیتاز قارچی حاوی برچسب شش هیستیدین، در باکتری اشرشیاکلی و مخمر به منظور بیان بالا و سپس خالص سازی این آنزیم، انجام شد.


فاطمه جعفری نژاد، گلناز اسعدی تهرانی، محمد امین بخش، بهرام کاظمی، وحید رضا یاسائی، فاطمه یاریان، آمنه کوچکی، زینب سلیمانی فر، مژگان بنده پور،
دوره ۴، شماره ۱۵ - ( ۶-۱۳۹۳ )
چکیده

سابقه و هدف: ویروس انفلوانزا A یکی از عوامل اصلی مرگ ومیر سالیانه می باشد و از سال ۱۹۶۰ میلادی بر علیه آن واکسن موثر در دسترس بوده است. تغییرات مداوم آنتی ژنیک ویروس چالش بزرگی در مسیر تولید سالیانه واکسن می باشد. در حال حاضر محققین روی آنتی ژنهای ثابت ویروس مطالعه می کنند. پروتئینM۲ یک کانال یونی درون پوشش ویروس انفلوانزای A تشکیل می دهد که در عفونت زایی آن موثر است. این پروتئین حفاظت شده است و هدف مناسبی برای تولید واکسن انفلوانزا میباشد.
مواد و روش ها: با توجه به محدودیت کشت ویروس انفلوانزا در آزمایشگاه توالی ژن M۲ از ویروس سویه H۱N۱ ایران انتخاب و سنتز شد. ژن M۲ در وکتور pET۲۲b ساب کلون گردید. پروتئین نوترکیب در باکتری E.coli سویه BL۲۱DE۳ بیان و از آنتی بادی اختصاصی در روش SDS-PAGE و وسترن بلات برای تایید آن استفاده شد.
یافته ها: غلظت پروتئین حاصل ۳۰۰ میکروگرم در هر میلی لیتر بدست آمد و با آنتی بادی اختصاصی تایید گردید. 
نتیجه گیری: پروتئین M۲ ویروس آنفلوانزا در باکتری Ecoli سویه BL۲۱ (DE۳) قابل بیان است.

حمید حسینیان، بهار برزمینی،
دوره ۴، شماره ۱۶ - ( ۹-۱۳۹۳ )
چکیده

سابقه و هدف: ال-آسپاراژیناز ΙΙ کاربرد موثری در درمان لوسمی لنفوبلاستیک (ALL) دارد. این آنزیم از منابع باکتریایی جدا شده و به صورت تجاری به عنوان داروی ضدسرطان عرضه می شود. سلول های سرطانی برخلاف سلول های نرمال، نیاز شدیدی به ال-آسپاراژین دارند، در صورت به کارگیری ال-آسپاراژیناز  (E.C. ۳,۵.۱.۱) ال-آسپاراژین به ال-آسپارتات و آمونیوم تبدیل می شود که در نهایت به تخریب سلول های سرطانی منجر می شود. هدف از این پژوهش، کلون کردن ژن ال-آسپاراژیناز E. coli II در B. subtilis جهت تولید انبوه این آنزیم انجام گرفت.
مواد و روش ها: ژن ال-آسپاراژیناز  ansB) II) با روش PCR از E. coli BL۲۱ جدا گردید. قطعه تکثیر یافته و شاتل وکتور بیانی pMR۱۲ توسط آنزیم های HindΙΙΙ، BamHΙ هضم شد. واکنش اتصال بین قطعه PCR و شاتل وکتور بیانی برش خورده با روش استاندارد انجام گرفت. در مرحله بعد، وکتور نوترکیب با روش شوک با CaCl۲ سرد بهE. coli JM۱۰۱ ترانسفورم شد. در نهایت به میزبان B. subtilis با روش شیمیایی انتقال یافت.
یافته ها: در این مطالعه، ژن ansB به وسیله PCR از E. coli BL۲۱ جدا و توسط تجزیه و تحلیل آنزیمی محصول PCR تایید گردید و در شاتل وکتور بیانی pMR۱۲ کلون شد. سپس وکتور نوترکیب ابتدا در E. coli کلون گردید و وجود ژن ۱۰۴۷bp با تجزیه و تحلیل آنزیمی و واکنش PCR تایید شد به دنبال آن داخل B. subtilis کلون شد و استخراج پلاسمید انجام گرفت و با باند شاتل وکتور بیانی pMR۱۲ دارای ژن ansB به صورت صحیح، مقایسه و تایید گردید.
نتیجه گیری: در این تحقیق با استفاده از شاتل وکتور بیانی pMR۱۲ توانستیم ژن ansB را در B. subtilis کلون کنیم. این مطالعه، اولین گزارش کلونینگ ژن ansB در B. subtilis است.
زهرا حجازی، محمد رضا عباس زادگان، مهران غلامین، محمد مهدی فرقانی فرد،
دوره ۵، شماره ۱۹ - ( ۴-۱۳۹۴ )
چکیده

سابقه و هدف: کنسر تستیس آنتی ژن ها دست های از آنتی ژن ها می باشند که به طور ویژه بیان آن ها در سلول های زایا و انواع مختلفی از سرطان ها دیده شده است. یکی از اعضای این خانوادهMAGEA۴ می باشد که این آنتی ژن با انواع تومورها در ارتباط است. از آنجا که عملکرد این ژن هنوز به درستی مشخص نشده است، هدف از این مطالعه تکثیر و کلونینگ این ژن در وکتور بیانی به منظور تولید پروتئین نوترکیب بیان کننده MAGEA۴ است.
مواد و روش ها: از طریقPCR و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی حاوی برش آنزیم محدود کننده ژن MAGEA۴ تکثیر شد. محصول PCR خاص شده بین سایت های BamH۱ وXho۱ وکتور pTZ۵۷/R قرار گرفت و در سویه Top۱۰ اشرشیاکلی ترانسفورم گردید و توسط IPTG وX-Gal غربالگری شد. صحیح قرا گرفتن قطعه MAGEA۴ توسط برش آنزیمی و تعیین توالی بررسی گردید. سپس ساب کلونینگ این ژن در وکتور بیانی pRUF با همان جایگاه های برش آنزیمی صورت پذیرفت.
یافته ها: تایید نهایی از طریق PCRکلنی و برش آنزیمی، تعیین توالی صورت گرفت. بنابراین ژنMAGEA۴ در جایگاه برشی آنزیمی پلاسمید pRUF کلون شد.
نتیجه گیری: مطالعه حاضر گام مهمی جهت تولید پروتئین نوترکیب و استفاده از آن جهت پی بردن به عملکرد این ژن و اهداف درمانی به منظور درمان سرطان می باشد.

شکوفه رضایی، احمدفرهاد طالبی،
دوره ۱۰، شماره ۳۸ - ( ۱-۱۳۹۹ )
چکیده

امروزه با استفاده از مهندسی ژنتیک، پروتئین‌های نوترکیب می‌توانند در حجم انبوه، کیفیت مطلوب و هزینه پایین برای پاسخگویی به خواسته‌های صنایع مختلف تولید شوند. پروتئین‌های نوترکیب می‌توانند در روش‌های بیانی مختلفی نظیر سیستم‌های بیانی عاری از سلول یا بر پایه سلول­های پروکاریوتی یا یوکاروتی بیان شوند. با توجه به مزایای استفاده از سلول­های پروکاریوتی، یکی از سیستم­های متداول برای تولید پروتئین­های نوترکیب، استفاده از باکتری اشریشیاکلی (E.coli) است. هدف از مطالعه حاضر بررسی دقیق­تر بیان پروتئین نوترکیب در باکتری E. coli و ارائه راه­کارهای مناسب برای دستیابی به کشت با تراکم سلولی بالا و با قابلیت بیان بیشینه است. از این رو با مطالعه حدود ۶۳ مقاله چاپ شده در زمینه مهندسی ژنتیک، سیستم­های بیانی گوناگون برای تولید پروتئین­های نوترکیب معرفی و سپس راهکارهای عمومی برای بیان بالاتر آنها بررسی شدند. رویکردهای متعددی برای افزایش بازدهی و حلالیت به­کار گرفته شده است؛ تغییر سرعت سنتز پروتئین­ها، استفاده از پروتئین­های اتصالی، موتاسیون در پروتئین هدف، بیان هم­زمان چاپرون­های ملکولی و بهینه سازی شرایط کشت از جمله روش­هایی است که در این مطالعه ارزیابی شده­اند. کلونینگ مجازی در بستر توسعه روش­های نرم­افزاری و پایگاه­های اطلاعاتی غنی­تر به کمک ابزار و آزمون­های آزمایشگاهی آمده و توانسته است به رفع محدودیت­های بیان نوترکیب پروتئین­ها در میزبان­هایی با سیستم بیانی متفاوت منجر شود.
محمدجواد دهقان عصمت آبادی، محمود براتی، محمدعلی یعقوبی مقدم،
دوره ۱۰، شماره ۴۰ - ( ۶-۱۳۹۹ )
چکیده

سابقه و هدف: باکتری های بورخولدریا مالئی و سودومالئی (Burkholderia mallei and pseudomallei species) جزو عوامل بیماری زای خطرناک انسانی محسوب می شوند. تشخیص برپایه کشت برای این باکتری، هزینه بر و زمان بر و از طرف دیگر کار با این باکتری بسیار خطرناک بوده و همچنین امکان دسترسی به این باکتری و حتی ژنوم آن بسیار مشکل می باشد. هدف از انجام این مطالعه طراحی و سنتز کنترل مثبتی ایمن و کارآمد برای تشخیص باکتری بورخولدریا می باشد.
مواد و روش ها: در ابتدا، یک سازه شبیه ساز که، حاوی ژن های مرجع و اختصاصی باکتری بورخولدریا مالئی و سودومالئی می باشد و در دیگر گونه های خانواده مشاهده نمیشود ساخته شد و سپس کارایی عملیاتی سازه طراحی شده، با استفاده از روشPCR Real-Time کمی ( با استفاده از رنگ SYBER Green ) و کیفی(با استفاده از پروب TaqMan )، مورد ارزیابی قرار گرفت. درنهایت محصولات تکثیری PCR Real-Time با استفاده از منحنی ذوب و الکتروفورز مورد بررسی قرار گرفتند.
یافته ها: میزان حداقل و حداکثر حساسیت به ترتیب ۱/۰پیکو گرم و ۱۰ نانوگرم بر روی سازه طراحی شده در مطالعه حاضر، حاصل شد.
نتیجه گیری: این سازه شبیه ساز میتواند به عنوان کنترل مثبت مناسبی، جهت تشخیص عامل بورخولدریا مورد استفاده قرار گیرد و همچنین می تواند در آینده باعث پیشرفت هرچه بیشتر کیت های تشخیصی جدید در این حوزه بشود.
محمدعلی یعقوبی مقدم، علیرضا سعیدی نیا، افشین صمیمی نعمتی، محمدجواد دهقان عصمت آبادی،
دوره ۱۱، شماره ۴۳ - ( ۴-۱۴۰۰ )
چکیده

سابقه و هدف: با ظهور تکنولوژی کلونینگ و DNA نوترکیب، امکان تولید داروها و واکسن هایی محقق شد که در گذشته ممکن نبود. پروتئین نوترکیب بخش عظیمی از صنعت زیست دارو را به خود اختصاص داده که یکی از مهمترین بخش های آن واکسن سازی می‌باشد.
مواد و روش ها: در این پژوهش با هدف دستیابی به کاندید پروتئینی واکسن وبا، ابتدا کلونینگ پلاسمید طراحی شده به میزبان باکتریاییE. coli DE۳ Rossetagamiترانسفورم شده، پس از آن با استفاده از IPTG القاء بیان صورت گرفته و پس از بررسی بیان پروتئین توسط ژل الکتروفورز SDS-PAGE، پروتئین مورد نظر توسط ستون کروماتوگرافی نیکل-سفاروز خالص سازی شده است.
یافته ها: نتایج حاصل از پژوهش نشان می‌دهد پروتئین خالص سازی شده دارای وزن مولکولی ۳۱ کیلودالتون می‌باشد همچنین میزان پروتئین خالص سازی شده ۱ میلی گرم می‌باشد.
بحث و نتیجه گیری: با توجه به نتایج حاصل از این مطالعه و مقایسه آن با دیگر مطالعات مشابه، پروتئین حاصل از خلوصی مناسب برخوردار بوده و می‌توان برای مطالعات بعدی مورد استفاده قرارگیرد.
محمد ابراهیمی فرد، محمد مهدی فرقانی فرد، احد یامچی، وجیهه زرین پور،
دوره ۱۲، شماره ۴۵ - ( ۸-۱۴۰۰ )
چکیده

سابقه و هدف: انتروکیناز یک آنزیم دستگاه گوارش است که به عنوان یک پروتئاز با توالی خاص عمل می کند. به دلیل توانایی انتروکیناز برای هضم آنزیمی پروتئین نوترکیب در سایت اختصاصی آن (شامل چهار اسید آمینه آسپارتیک اسد و یک اسید آمینه لیزین می باشد) که در پروتئین هدف قرار داده می شود، به عنوان یک ابزار بسیار مفید برای امکان خالص سازی و جداسازی بخش پروتئین هدف از بخش غیر هدف در صنایع دارویی، غذایی و صنعتی مورد استفاده قرار می گیرد.
مواد و روش­ها: متغیرهای مستقل مورد استفاده شامل میزان OD (۶/۰، ۲/۱ و ۸/۱) در طول موج ۶۰۰ نانومتر، غلظت IPTG  (۲/۰، ۵/۰ و ۸/۰ میلی مولار) و نوع سویه باکتری (ShuffleT۷, BL۲۱, NICO۲۱) بود. از روش سطح پاسخ (RSM) در قالب طرح مرکب مرکزی برای پیش بینی متغیرهای مستقل بر میزان تولید آنزیم انتروکیناز استفاده شد.
یافته­ ها: میزان OD برابر با ۸/۱ در طول موج ۶۰۰ نانومتر، غلظت IPTG ۷۱/۰ میلی مولار و نوع سویه باکتری ShuffleT۷، محیط کشت LB، غلظت لاکتوز ۵/۲ میلی مولار و دمای القاء ۲۵ درجه سانتیگراد، برای تولید آنزیم انتروکیناز نوترکیب بهینه سازی شد.
بحث و نتیجه گیری: پروتئین­های دارویی نقش مهمی در درمان­های نوین پزشکی مولکولی دارند. بیان ژن انتروکیناز در سیستم باکتریایی، تسهیل در خالص سازی غلظت هایی که پایین است را فراهم می کند، بنابراین پروتئین های نوترکیب در مقیاس وسیع و با خلوص زیاد می توانند در سیستم باکتریایی تولید و بهینه سازی شوند.

صفحه ۱ از ۱     

کلیه حقوق این وب سایت متعلق به مجله تازه های بیوتکنولوژی سلولی - مولکولی می باشد.

طراحی و برنامه نویسی : یکتاوب افزار شرق

© 2025 CC BY-NC 4.0 | New Cellular and Molecular Biotechnology Journal

Designed & Developed by : Yektaweb