New Cellularand Molecular Biotechnology Journal

fa کلونینگ و بیان پلی پپتید نوترکیب HPV16 / 18 L1-L2-E7 در سیستم بیانی باکتری Cloning and Expression of the Recombinant HPV16/18 L1-L2-E7 Polypeptide in Bacterial Expression System ژنتیک Genetics مقاله پژوهشی Research Article سابقه و هدف: ویروسهای پاپیلومای انسانی (HPV) به ویژه انواع 16 و 18 مهمترین عامل سرطان دهانه رحم محسوب می شوند که شایعترین آنها، دو نوع 16 و 18 هستند. از بین انواع پروتئین های مرتبط با HPV، پروتئین های کپسیدی L1 و L2 و نیز انکوپروتئین E7 به عنوان آنتی ژن های هدف برای طراحی واکسن مطرح می باشند. در سالهای اخیر، واکسن های نوترکیب پلی پپتیدی چند اپی توپی مورد توجه قرار گرفته اند. هدف از این مطالعه طراحی سازه فیوژنی L1-L2-E7 و ارزیابی بیان آن در سیستم بیانی باکتری است. مواد و روش ها: در این مطالعه، با استفاده از آنالیزهای بیوانفورماتیکی مختلف، اپی توپ های ایمنوژنیک و حفاظت شده از پروتئین های L1، L2 و E7 ویروسهای پاپیلومای انسانی نوع 16 و 18 انتخاب شدند. پس از سنتز توالی فیوژن طراحی شده L1-L2-E7 در وکتور کلونینگ pUC57، ساب کلون کردن آن در وکتور بیان پروکاریوتی pET24a(+) توسط آنزیمهای محدودالاثر EcoRI/ HindIII انجام شد. بیان پلی پپتید چند اپی توپی نوترکیب در سویه باکتری E.coli Rosetta توسط القاگر IPTG انجام و تأیید آن توسط آنالیزهای SDS-PAGE و وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی ضد دنباله هیستیدینی صورت گرفت. بهینه سازی بیان تحت شرایط مختلف جذب (در طول موج 600 نانومتر)، دما و زمان پس از القا و غلظت IPTG انجام شد.  یافته ها: ساب کلون کردن سازه ژنی L1-L2-E7 در وکتور pET توسط حضور باند حدود 525 جفت باز روی ژل آگارز بعد از هضم آنزیمی تأیید شد. نتیجه بیان پلی پپتیدL1-L2-E7  در باکتری، حضور باند حدود 20 کیلودالتون را روی ژل SDS-PAGE و وسترن بلات آشکار کرد. بهترین شرایط برای بیان پلی پپتید نوترکیب در دمای 37 درجه، جذب حدود 7/0 تا 8/0، غلظت IPTG یک میلی مولار و زمان 16 ساعت پس از القا بود.  نتیجه گیری: بیان موفق سازه پلی پپتید چند اپی توپی L1-L2-E7  در سیستم باکتری انجام شد. تخلیص پلی پپتید نوترکیب به عنوان کاندید واکسن در مراحل بعدی صورت خواهد گرفت.  Aim and Background: Human papillomaviruses (HPVs) especially types 16 and 18 are known as the major causes of cervical cancer. Among HPV proteins, L1 and L2 capsid proteins, and also E7 oncoprotein are proposed as target antigens for vaccine design. In the recent years, the recombinant multiepitope polypeptides have attracted a special interest. The goal of this study is the design of L1-L2-E7 fusion construct and evaluation of its expression in bacterial expression system.  Materials and Methods: In this study, the immunogenic and conserved epitopes of HPV16/18 L1, L2 and E7 proteins were selected using different bioinformatics analyses. After synthesis of the designed L1-L2-E7 fusion sequence in pUC57 cloning vector, its subcloning was performed in pET24a (+) prokaryotic expression vector using EcoRI/ HindIII restriction enzymes. The expression of the recombinant multiepitope polypeptide was done in E.coli Rosetta strain using IPTG inducer, and confirmed by SDS-PAGE and western blotting using anti-His-tag antibody. The expression was optimized under different conditions such as optical density (OD in wavelength of 600 nm), temperature and time after induction, and IPTG concentration.    Results: The recombinant pET-L1-L2-E7 vector was confirmed by the presence of a clear band (~525 bp) related to the L1-L2-E7 gene on agarose gel after enzyme digestion. The expression of L1-L2-E7 polypeptide in bacteria showed the presence of a clear band (~20 kDa) in SDS-PAGE and western blotting. The best conditions for expression of the recombinant polypeptide were at temperature of 37◦C, optical density of 0.7-0.8, IPTG concentration of 1mM, and time of 16 h after induction.   Conclusion: The successful expression of the L1-L2-E7 multiepitope polypeptide was performed in bacterial system. In the next step, the recombinant polypeptide will be purified to use as a vaccine candidate.  ویروس پاپیلومای انسانی 16 و 18 , پروتئین های کپسید, پروتئین انکوژن E7, سیستم بیانی باکتری, Iau Science Human papillomavirus 16/18, Capsid proteins, oncogene protein E7, Bacterial expression system , Iau Science 73 82 http://ncmbjpiau.ir/browse.php?a_code=A-10-1679-2&slc_lang=fa&sid=1 Matin Kayyal متین کیال 100319475328460011986 100319475328460011986 No Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran گروه زیست شناسی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران Azam Bolhassani اعظم بوالحسنی A_bolhasani@pasteur.ac.ir 100319475328460011987 100319475328460011987 No Department of Hepatitis and AIDS, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran بخش هپاتیت و ایدز، انیستیتو پاستور ایران، تهران، ایران Zahra Noormohammadi زهرا نورمحمدی 100319475328460011988 100319475328460011988 Yes Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran گروه زیست شناسی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران Majid Sadeghizadeh مجید صادقی زاده 100319475328460011989 100319475328460011989 No Department of Genetics, Faculty of Biological Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran گروه ژنتیک، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس ، تهران، ایران