New Cellularand Molecular Biotechnology Journal

other استفاده دومنظوره از دنباله هیدروکسی آپاتیت در پپتید کایمریک PDGF:برای تخلیص و رهایش پپتید Dual application of hydroxyapatite tag in engineered PDGF peptide: purification and drug delivery سلولی و مولکولی Cellular and molecular مقاله پژوهشی Research Article سابقه و هدف: استفاده از دنبالههای تمایلی از روشهای مرسوم برای تخلیص پروتئینهای نوترکیب به شمار میآید. با این حال حذف آن‌ها در مراحل بعدی از الزامات پپتیدها یا پروتئینهای دارویی است که این امر علاوه بر طولانی کردن مسیر تخلیص، هزینههای زیادی را به تولیدکننده تحمیل میکند. توالی پپتیدی دارای تمایل اتصال به هیدروکسی آپاتیت، علاوه بر امکان تخلیص پپتید یا پروتئین نوترکیب، موجب اتصال پپتید یا پروتئینها به ساختارهای حاوی هیدروکسی آپاتیت مانند دندان، استخوان و حتی گرافت‌های استخوانی میشود که در بایومتریال، مهندسی بافت،جراحی‌ها و ایمپلنت‌های دندان می‌تواند نقش بسزایی ایفا نماید. هدف از انجام این تحقیق استفاده مناسب از دنباله‌ هایی است که علاوه بر تخلیص پروتئین مورد نظر توسط ستونهای کروماتوگرافی تمایلی، نیازی به حذف دنباله وجود نداشته باشد که از اولویت‌های بیوتکنولوژی و درمان خواهد بود. مواد و روش‌ها: در این پروژه، یک فیوژن پپتید مشتق شده از فاکتور رشد پلاکتیPDGF-BB طراحی شد که دارای یک توالی متصل شونده به هیدروکسی آپاتیت و His6x میباشد. به منظور حذف توالی هیستیدینی، توالی مورد نظر توسط دو پرایمر حاوی توالی‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های برشی XhoI و NdeI طراحی و در پایان در وکتور pET21a(+) کلون شد. سپس، واکنش زنجیره پلیمرازی و هضم دوتایی آنزیمی صورت گرفت. فیوژن پپتید مورد نظر در باکتری اشریشیا کلی بیان شد و به روش الکتروفورز SDS-PAGE باند پپتید ملاحظه و در نهایت با وسترن بلات اثبات گردید. برای تخلیص فیوژن پپتید نوترکیب از رزین هیدروکسی آپاتیت استفاده شد. جهت بررسی اتصال پپتید به داربست از تست رهایش استفاده شد که با استفاده از آزمون سنجش پروتئین به روش برادفورد و رسم منحنی ارزیابی گردید. برای بررسی زنده مانی، تکثیر و رشد سلولی تست سمیت سلولی(MTT ASSAY)  انجام شد. یافته ها: بیان فیوژن پپتید مورد نظر در باکتری اشریشیا کلی بهینه سازی شد. کلونینگ باکتری اشریشیا کلی در وکتور pET21a(+) بعد از PCR و هضم دوتایی آنزیمی با انجام توالی‌یابی ژنی، مورد نظر تایید واقع شد. تایید بیان توسط SDS-PAGE و وسترن بلات اثبات گردید. باند پپتید در محدوده وزنی حدود 17 کیلو دالتون مشاهده شد . در آزمون رهایش پپتید مشاهده شد که فیوژن پپتید PDGF-BB قابلیت اتصال پایدار به داربست هیدروکسی آپاتیت را دارد که مانع از آزادسازی کامل پپتید در روز اول در محیطSBF  می‌شود. در ادامه در روز دوم حدود 40 درصد پپتید رهایش دارد و سپس به پلاتو می‌رسد . بررسی زنده مانی سلولی با انجام تست MTT نشان داد که سلول‌ها در طول 24 ساعت تکثیر پیدا کرده و بیشترین رشد سلولی را طی 24 ساعت در غلظت9/2میکروگرم بر میلی لیتر نسبت به گروه کنترل داشتند. نتیجه گیری: در این پژوهش یک پپتید جدید مشتق شده از PDGF-BB  با عملکرد پایدار طراحی، بیان و با کمک رزین هیدروکسی آپاتیت خالص شد. استفاده دو منظوره از دنباله تمایلی به هیدروکسی آپاتیت می‌تواند علاوه بر کارایی آن در روند تخلیص با ستون‌های افینیتی سرامیکی بر پایه هیدروکسی آپاتیت، به عنوان یک فاکتور تمایلی به داربست‌های استخوانی در مهندسی بافت مورد استفاده قرار گیرد. واژگان کلیدی: هیدروکسی آپاتیت، تخلیص پروتئین، فاکتور رشد پلاکتی، مهندسی بافت ، ترمیم زخم.   Aim and Background: The use of affinity tags is a conventional method for purifying recombinant proteins. However, their removal in later stages is mandatory for therapeutic peptides or proteins, which not only prolongs the purification process but also imposes significant costs on the producer. A peptide sequence with an affinity for hydroxyapatite allows for the purification of recombinant peptides or proteins while enabling their binding to hydroxyapatite-containing structures such as teeth, bones, and even bone grafts. This can play a significant role in biomaterials, tissue engineering, surgery, and dental implants. The goal of this study is to utilize affinity sequences that eliminate the need for removal after purifying the desired protein using affinity chromatography columns, which is a priority in biotechnology and therapeutics. Material and Methods: In this study, a fusion peptide derived from platelet-derived growth factor (PDGF-BB) was designed, containing a hydroxyapatite-binding sequence and His6x tag. To remove the histidine tag, the sequence was designed with primers containing XhoI and NdeI restriction sites and was subsequently cloned into the pET21a (+) vector. Polymerase chain reaction (PCR) and double enzymatic digestion were performed. The designed fusion peptide was expressed in Escherichia coli, confirmed through SDS-PAGE electrophoresis, and verified using Western blotting. The recombinant fusion peptide was purified using hydroxyapatite resin. To evaluate peptide binding to the scaffold, a release test was conducted, which was assessed using the Bradford protein assay and curve analysis. Cellular viability, proliferation, and growth were examined via the MTT assay. Results: Expression of the designed fusion peptide in Escherichia coli was optimized. Cloning in the pET21a(+) vector was confirmed after PCR and double enzymatic digestion through gene sequencing. The expression was validated by SDS-PAGE and Western blotting, showing a peptide band at approximately 17 kDa. The peptide release assay demonstrated that the PDGF-BB fusion peptide binds stably to the hydroxyapatite scaffold, preventing complete peptide release on the first day in SBF (Simulated Body Fluid). On the second day, approximately 40% of the peptide was released, followed by stabilization (plateau). The MTT assay revealed cell viability and proliferation over 24 hours, with maximum growth observed at a concentration of 2.9 µg/mL compared to the control group. Conclusion: In this study, a novel peptide derived from PDGF-BB with stable performance was designed, expressed, and purified using hydroxyapatite resin. The dual-purpose use of the hydroxyapatite-binding affinity tag not only enhances its efficiency in purification processes using hydroxyapatite-based ceramic affinity columns but also serves as an affinity factor for bone scaffolds in tissue engineering.   1.Wood DW. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current opinion in structural biology. 2014 Jun 1,26:54-61. doi.org/10.1016/j.sbi.2014.04.006 2.Kimple ME, Brill AL, Pasker RL. Overview of affinity tags for protein purification. Current protocols in protein science. 2013 Aug,73(1):9-.doi.org/10.1002/0471140864.ps0909s73 3.Lee JS, Wagoner Johnson AJ, Murphy WL. A modular, hydroxyapatite-binding version of vascular endothelial growth factor. Adv Mater. 2010 Dec 21,22(48):5494-8.doi.org/10.1002/adma.201002970. 4.Weiger MC, Park JJ, Roy MD, Stafford CM, Karim A, Becker ML. Quantification of the binding affinity of a specific hydroxyapatite binding peptide.Biomaterials.2010 Apr1,31(11):2955-63.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2010.01.012 5.Segvich SJ, Smith HC, Kohn DH. The adsorption of preferential binding peptides to apatite-based materials. Biomaterials. 2009 Mar 1,30(7):1287-98.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2008.11.008 6.Roy MD, Stanley SK, Amis EJ, Becker ML. Identification of a highly specific hydroxyapatite‐binding peptide using phage display. Advanced Materials. 2008 May 19,20(10):1830-6.doi.org/10.1002/adma.200702322 7.Mao J, Shi X, Wu YB, Gong SQ. Identification of specific hydroxyapatite {001} binding heptapeptide by phage display and its nucleation effect. Materials. 2016 Aug 17,9(8):700.doi.org/10.3390/ma9080700 8.Cummings LJ, Snyder MA, Brisack K. Protein chromatography on hydroxyapatite columns. Methods in enzymology. 2009 Jan 1,463:387-404.doi.org/10.1016/S0076-6879(09)63024-X 9.Snyder MA. Working with a powerful and robust mixed-mode resin for protein purification. BioProcess Int. 2011 May,9(5):50-3. 10.Duanis-Assaf T, Hu T, Lavie M, Zhang Z, Reches M. Understanding the adhesion mechanism of hydroxyapatite-binding peptide. Langmuir. 2022 Jan 7,38(3):968-78.doi.org/10.1021/acs.langmuir.1c02293 11.Tang W, Becker M. A Hydroxyapatite (HA)-Binding Peptide Functionalized Dendron: Design, Synthesis and application as a Growth Factor Carrier. 12.Bang J, Park H, Yoo J, Lee D, Choi WI, Lee JH, et al. Selection and identification of a novel bone-targeting peptide for biomedical imaging of bone. Scientific reports. 2020 Jun 29,10(1):10576. doi.org/10.1038/s41598-020-67522-4. 13.Huang ZB, Shi X, Mao J, Gong SQ. Design of a hydroxyapatite-binding antimicrobial peptide with improved retention and antibacterial efficacy for oral pathogen control. Scientific Reports. 2016 Dec 2,6(1):1-1. doi.org/10.1038/srep38410 14.Yuca E, Xie SX, Song L, Boone K, Kamathewatta N, Woolfolk SK, et al. Reconfigurable dual peptide tethered polymer system offers a synergistic solution for next generation dental adhesives. International Journal of Molecular Sciences. 2021 Jun 18,22(12):6552.. doi.org/10.3390/ijms22126552 15.Spencer P, Ye Q, Song L, Parthasarathy R, Boone K, Misra A, et al. Threats to adhesive/dentin interfacial integrity and next generation bio‐enabled multifunctional adhesives. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 2019 Nov,107(8):2673-83.. https://doi.org/10.1002/jbm.b.34358 16.Hardan L, Lukomska-Szymanska M, Zarow M, Cuevas-Suárez CE, Bourgi R, Jakubowicz N, Sokolowski K, et al. One-Year Clinical Aging of Low Stress Bulk-Fill Flowable Composite in Class II Restorations: A Case Report and Literature Review. Coatings. 2021 Apr 25,11(5):504.doi.org/10.3390/coatings11050504. 17.Hardan L, Bourgi R, Cuevas-Suárez CE, Zarow M, Kharouf N, Mancino D, et al. The bond strength and antibacterial activity of the universal dentin bonding system: A systematic review and meta-analysis. Microorganisms. 2021 Jun 6,9(6):1230.doi.org/10.3390/microorganisms9061230. 18.Bourgi R, Daood U, Bijle MN, Fawzy A, Ghaleb M, Hardan L. Reinforced universal adhesive by ribose crosslinker: A novel strategy in adhesive dentistry. Polymers. 2021 Feb 26,13(5):704.doi.org/10.3390/polym13050704 19.Xie SX, Boone K, VanOosten SK, Yuca E, Song L, et al. Peptide mediated antimicrobial dental adhesive system. Applied Sciences. 2019 Feb 8,9(3):557. doi.org /10.3390/app9030557. 20.Su M, Yao S, Gu L, Huang Z, Mai S. Antibacterial effect and bond strength of a modified dental adhesive containing the peptide nisin. Peptides. 2018 Jan 1,99:189-94.doi.org/10.1016/j.peptides.2017.10.003. 21.Zhao M, Qu Y, Liu J, Mai S, Gu L. A universal adhesive incorporating antimicrobial peptide nisin: Effects on Streptococcus mutans and saliva-derived multispecies biofilms. Odontology. 2020 Jul,108:376-85.doi.org/10.1007/s10266-019-00478-8. 22.Wieman TJ, Smiell JM, Su Y. Efficacy and safely of a topical gel formulation of recombinant human platelet-derived growth factor-BB (becaplermin) in patients with chronic neuropathic diabetic ulcers: a phase III randomized placebo-controlled double-blind study. Diabetes care. 1998 May 1,21(5):822-7.doi.org/10.2337/diacare.21.5.822. 23.Engström U, Engström A, Ernlund A, Westermark B, Heldin CH. Identification of a peptide antagonist for platelet-derived growth factor. Journal of Biological Chemistry. 1992 Aug 15,267(23):16581-7. doi.org/10.1016/S0021-9258(18)42042-X. 24.Lin X, Takahashi K, Liu Y, Derrien A, Zamora PO. A synthetic, bioactive PDGF mimetic with binding to both α-PDGF and β-PDGF receptors. Growth Factors. 2007 Jan 1,25(2):87-93.doi.org/10.1080/08977190701553449. 25.Deptuła M, Karpowicz P, Wardowska A, Sass P, Sosnowski P, Mieczkowska A, et al. Development of a peptide derived from platelet-derived growth factor (PDGF-BB) into a potential drug candidate for the treatment of wounds. Advances in Wound Care. 2020 Dec 1,9(12):657-75.doi.org/10.1089/wound.2019.1051. 26.Zhang P, Zhang G, Wang W. Ultrasonic treatment of biological sludge: floc disintegration, cell lysis and inactivation. Bioresource technology. 2007 Jan 1,98(1):207-10.doi.org/10.1016/j.biortech.2005.12.002. 27.Doonan S. Chromatography on hydroxyapatite. Protein purification protocols. 2004:191-4.doi.org/10.1385/1-59259-655-X:191. 28.Haan C, Behrmann I. A cost effective non-commercial ECL-solution for Western blot detections yielding strong signals and low background. Journal of immunological methods. 2007 Jan 10,318(1-2):11-9. doi.org/10.1016/j.jim.2006.07.027. 29.Implants for Surgery: In Vitro Evaluation for Apatite-forming Ability of Implant Materials: ISO Copyright Office.2012.International Organization for S. 30.Hwang YE, Im S, Cho JH, Lee W, Cho BK, Sung BH, et al. Semi-biosynthetic production of surface-binding adhesive antimicrobial peptides using intein-mediated protein ligation. International Journal of Molecular Sciences. 2022 Dec 2,23(23):15202.doi.org/10.3390/ijms232315202. 31.Bahri M, Hasannia S, Dabirmanesh B, Zadeh HH. Purification of Recombinant Fusion Peptide Containing Hydroxyapatite Affinity Tag Using Ceramic Chromatography Column. Modares Journal of Biotechnology. 2019 Dec 10,10(4):655-64. 32.Werner S, Grose R. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines. Physiological reviews. 2003 Jul,83(3):835-70.doi.org/10.1152/physrev.2003.83.3.835. 33.Park JW, Hwang SR, Yoon IS. Advanced growth factor delivery systems in wound management and skin regeneration. Molecules. 2017 Jul 27,22(8):1259.doi.org/10.3390/molecules22081259. 34.Guo SA, DiPietro LA. Factors affecting wound healing. Journal of dental research. 2010 Mar,89(3):219-29.doi/abs/10.1177/0022034509359125. 35.Ghasemi Y, Ghoshoon MB, Taheri M, Negahdaripour M, Nouri F. Cloning, expression and purification of human PDGF-BB gene in Escherichia coli: New approach in PDGF-BB protein production. Gene Reports. 2020 Jun 1,19:100653.. doi.org/10.1016/j.genrep.2020.100653. 36.Dyson MR, Shadbolt SP, Vincent KJ, Perera RL, McCafferty J. Production of soluble mammalian proteins in Escherichia coli: identification of protein features that correlate with successful expression. BMC biotechnology. 2004 Dec,4:1-8.doi.org/10.1186/1472-6750-4-32. 37.Fateme R, Fatemeh G, Sima S, Moshaverinia A, Hasannia S. New engineered fusion peptide with dual functionality: antibacterial and strong binding to hydroxyapatite. International Journal of Peptide Research and Therapeutics. 2020 Sep,26:1629-39.doi.org/10.1007/s10989-019-09963-8. 38.Vij N, Sharma A, Thakkar M, Sinha S, Mohan RR. PDGF-driven proliferation, migration, and IL8 chemokine secretion in human corneal fibroblasts involve JAK2-STAT3 signaling pathway. Molecular vision. 2008,14:1020. 39.Izumi K, Zheng Y, Li Y, Zaengle J, Miyamoto H. Epidermal growth factor induces bladder cancer cell proliferation through activation of the androgen receptor. International journal of oncology. 2012 Nov 1,41(5):1587-92.doi.org/10.3892/ijo.2012.1593. 40. Xiao L, Du Y, Shen Y, He Y, Zhao H, Li Z. TGF-beta 1 induced fibroblast proliferation is mediated by the FGF-2/ERK pathway. Front Biosci (Landmark Ed). 2012 Jun 1,17(7):2667-74.doi:10.2741/4077. Hydroxyl apatite, Protein purification, PDGF-BB, Platelet- derived growth factor, Tissue engineering, Wound healing 57 69 http://ncmbjpiau.ir/browse.php?a_code=A-10-1987-2&slc_lang=other&sid=1 Maryam Sadeghi-Ardebili مریم صادقی اردبیلی 100319475328460015154 100319475328460015154 No Department of Cognitive Sciences, Faculty of Converging Sciences and Technologies, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran گروه علوم شناختی، دانشکده علوم و فناوری های همگرا، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران Sadegh Hasannia صادق حسن نیا hasannia@modares.ac.ir 100319475328460015155 100319475328460015155 Yes Department of Biochemistry, Faculty of Biological Science, Tarbiat Modares University, Tehran,Iran گروه بیوشیمی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران Bahareh Dabirmanesh بهاره دبیرمش 100319475328460015156 100319475328460015156 No Department of Biochemistry, Faculty of Biological Science, Tarbiat Modares University, Tehran,Iran گروه بیوشیمی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران Ramazan Ali Khavari-Nejad رمضانعلی خاوری نژاد 100319475328460015157 100319475328460015157 No Department of Cognitive Sciences, Faculty of Converging Sciences and Technologies, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran گروه علوم شناختی، دانشکده علوم و فناوری های همگرا، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران