Volume 9, Issue 33 (12-2018)
NCMBJ 2018, 9(33): 87-98 |
Back to browse issues page
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
yavari K, koshesh L, Movahedi M. The effect of deuterium depleted water on cell growth and antioxidant systems of breast cancer cells. NCMBJ 2018; 9 (33) :87-98
URL: http://ncmbjpiau.ir/article-1-1155-en.html
URL: http://ncmbjpiau.ir/article-1-1155-en.html
The effect of deuterium depleted water on cell growth and antioxidant systems of breast cancer cells
, kyavari@aeoi.org.ir
Abstract: (6066 Views)
Aim and Background:
Recent studies show that the depletion of naturally occurring deuterium can result in tumor regression in both in vitro and in vivo models. The purpose of this study was to investigate the effect of deuterium depleted water (DDW) discretely and in combination with 5-FU on cell growth and anti-oxidant system of breast cancer cells.
Mateial and Methods:
The cellular cytotoxicity test was performed using MTT assay. The MCF-7 cells were treated with decreasing deuterium concentrations of DDW alone, 5-FU alone and both. The malondialdehyde (MDA) level and the catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) enzyme activities were identified spectrophometrically. One way analysis of variance (ANOVA) and t- test were used for statistical analysis. P ≤ 0.05 was considered significant.
Results: Treatment the cells with different concentrations of DDW alone especially in concentrations of 100 and 125ppm imposed growth inhibitory effect on MCF-7 cells. Also, 5-FU alone significantly decreased the survival fractions of MCF-7 cells and DDW in combination with 5-FU augmented 5-FU inhibitory effects on the cells. Compared to the control group (150 ppm), it was observed that in the cells treated with Lower concentrations of DDW, the activities of catalase and superoxide dismutase enzymes increased, but the level of malonyldialdehyde decreased.
Conclusion: Deuterium depleted water can be considered as an adjuvant in anticancer drugs.
Recent studies show that the depletion of naturally occurring deuterium can result in tumor regression in both in vitro and in vivo models. The purpose of this study was to investigate the effect of deuterium depleted water (DDW) discretely and in combination with 5-FU on cell growth and anti-oxidant system of breast cancer cells.
Mateial and Methods:
The cellular cytotoxicity test was performed using MTT assay. The MCF-7 cells were treated with decreasing deuterium concentrations of DDW alone, 5-FU alone and both. The malondialdehyde (MDA) level and the catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) enzyme activities were identified spectrophometrically. One way analysis of variance (ANOVA) and t- test were used for statistical analysis. P ≤ 0.05 was considered significant.
Results: Treatment the cells with different concentrations of DDW alone especially in concentrations of 100 and 125ppm imposed growth inhibitory effect on MCF-7 cells. Also, 5-FU alone significantly decreased the survival fractions of MCF-7 cells and DDW in combination with 5-FU augmented 5-FU inhibitory effects on the cells. Compared to the control group (150 ppm), it was observed that in the cells treated with Lower concentrations of DDW, the activities of catalase and superoxide dismutase enzymes increased, but the level of malonyldialdehyde decreased.
Conclusion: Deuterium depleted water can be considered as an adjuvant in anticancer drugs.
Keywords: Deuterium Depleted Water, Breast Cancer, Anti-Oxidants Enzymes, Cell Growth Inhibition, MTT
Full-Text [PDF 893 kb]
(2761 Downloads)
اثر آب تهی شده از دوتریم بر روی رشد سلولی و سیستم آنتی اکسیدانی سلول های سرطان سینه
کمال یاوری*1 ، لیدا کوشش 2 ، منیره موحدی 2
1- پژوهشگاه علوم و فنون هسته ای، تهران، ایران
2- دانشکده علوم زیستی، واحد تهران شمال ، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران ،ایران
نویسنده مسئول: پژوهشگاه علوم وفنون هسته ای E-mail:
kyavari@aeoi.org.ir
چکیده
سابقه و هدف: مطالعههای اخیر نشان میدهد که کاهش طبیعی میزان دوتریم میتواند منجر به مهار رشد تومور در هر دو مدل in vitro و in vivo شود. هدف از این مطالعه بررسی اثر آب تهی شده از دوتریوم (DDW) تنها و در ترکیب با 5-FU بر روی رشد و سیستم آنتی اکسیدانی سلولهای سرطان سینه است.
مواد و روشها: آزمایش سمیت سلولی با استفاده از روش MTT انجام شد. سلولهای MCF-7 با غلظت های مختلفی از DDW تنها، 5-FU تنها و هر دو تیمار شدند. سطح مالون دی الدئید و فعالیت آنزیمهای کاتالاز و سوپر اکسید دیسموتاز به روش اسپکتروفتومتری انجام گردید. آنالیز واریانس یکطرفه (ANOVA)و t-Test برای تجزیه و تحلیل آماری استفاده شدند. P ≤ 0.05 سطح معنیداری در نظر گرفته شد.
یافتهها: تیمار سلولها با غلظتهای مختلف DDW تنها بهویژه در غلظتهای 100 و ppm 125 باعث مهار رشد سلولهایMCF-7 گردید. 5-FU تنها نیز بهطور قابل توجهی میزان بقاء سلولهای MCF-7 را کاهش داد و استفاده از DDW به همراه 5-FU اثر مهاری 5-FU بر روی سلولها را افزایش داد. در مقایسه با گروه کنترل (ppm 150)، مشاهده گردید که در سلولهای تیمار شده با غلظتهای پایینتر DDW، فعالیت آنزیمهای کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز افزایش ولی سطح مالونیل دی آلدهید کاهش یافته است.
نتیجهگیری: آب تهی شده از دوتریوم میتواند به عنوان یک کمک کننده در داروهای ضد سرطان در نظر گرفته شود.
واژههای کلیدی: آب تهی شده از دوتریوم، سرطان سینه، آنزیمهای آنتی اکسیدان، مهار رشد سلولی، MTT
شکل1: مهار رشد سلولی پس از 24 ساعت
شکل2: مهار رشد سلولی پس از 48 ساعت
شکل3: مهار رشد سلولی پس از 72 ساعت
شکل 4: فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در سلول های MCF-7 پس از 48 ساعت تیمار با غلظت های مختلف دوتریوم و غلظت های 8 وµg/ml32 از داروی5-FU
شکل 5: فعالیت آنزیم کاتالاز در سلول های MCF-7 پس از 48 ساعت تیمار با غلظت های مختلف دوتریوم و غلظت های 8 وµg/ml32 از داروی5-FU
ج: نتایج میزان فاکتور مالونیل دی آلدهید
بررسی میزان فاکتور مالونیل دی آلدهید نشان داد که هر چه غلظت دوتریوم در محیط کشت زیاد می شود، سطح مالونیل دی آلدهید نیز روند افزایشی پیدا می کند (شکل 6).
شکل 6: میزان فاکتور مالونیل دی آلدهید در سلول های MCF-7 پس از 48 ساعت تیمار با غلظت های مختلف دوتریوم و غلظت های 8 وµg/ml32 از داروی5-FU
منابع
1. Abei H. Catalase in vitro. Methods enzymol, 1984; 105:121-6.
2. Chen KS, Katz J. Zonation of glycogen and glucose syntheses, but not glycolysis, in rat liver. Biochem J, 1988; 255: 99-104.
3. Cong FS, Zhang YR, Sheng HC, Ao ZH, Zhang SY, Wang JY. Deuterium-depleted water inhibits human lung carcinoma cell growth by apoptosis. Exp Ther Med, 2010; 2(1) 227-83.
4.Criss RE. Principles of stable isotope distribution. 1st ed. (NY): Oxford University Press; 1999.
5. Del Rio D, Stewart AJ, Pellegrini N. A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress. Nutr Metab Card Dis, 2005; 15 (4): 316–28.
6. Duffy MG. CA15-3 and related mucins as circulating markers in breast cancer. Ann Clin Biochem, 1999; 5:579 - 586.
7. Farmer EE, Davoine C .Reactive electrophile species. Curr Opin Plant Biol, 2007; 10 (4): 380–6.
8. Harris AL. Hypoxia-a key regulatory factor in tumour growth. Nat Rev Cancer, 2002; 2(1):38-47.
9. Hartman PE, Putative mutagens and carcinogens in foods. IV. Malonaldehyde (malondialdehyde). Environ Mutagen, 1983; 5(4):603-7.
10. Heidelberger C, Chaudhuri NK, Danneberg P, Mooren D, Griesbach L, Duschinsky R, Schnitzer RJ, Pleven E, Scheiner J. Fluorinated pyrimidines, a new class of tumour-inhibitory compounds. Nature, 1957; 179(4561):663-6.
11. Howell A, Sims AH, Ong KR, Harvie MN, Evans DGR, Clarke RB. Mechanisms of disease: prediction and prevention of breast cancer-cellular and molecular interactions. Nat Rev Clin Oncol, 2005; 2(12):635-46.
14. Katz JJ, Crespi HL, Czajka DM, Finkel AJ. Course of deuteriation and some physiological effects of deuterium in mice. Am J Physiol, 1962; 203(5):907-13.
15. Kim JY, Van Cott EM, Lewandrowski KB. The use of decision analysis tools for the selection of clinical laboratory tests: Developing diagnostic and forecasting models using laboratory evidence. Arch Pathol Lab Med, 2011: 305-322.
16. Kirshenbaum I. Physical properties and analysis of heavy water. London (NY): McGraw-Hill; 1979.
17. Krempels K, Somlyai I, Somlyai G. A retrospective evaluation of the effects of deuterium depleted water consumption on 4 patients with brain metastases from lung cancer. Integer Cancer Ther, 2008; 7(3):172-81.
18. Longley DB, Harkin DP, Johnston PG. 5-Fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer, 2003; 3(5):330-8.
19. Marnett LJ .Lipid peroxidation-DNA damage by malondialdehyde. Mutat Res, 1999; 424 (1–2): 83–95.
20. McCord JM, Fridovich I. Superoxide dismutase an enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein). J Biol Chem, 1969; 244(22):6049-55.
21. Murry RK, Ganner DK, Maybs PA, Rodwel VW. Harper’s Illustrated Biochemistry. 28th ed. New Delhi( India): McGraw-Hill;2009.
22. Nair V, O'Neil CL, Wang PG. Malondialdehyde. In: Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis. Nair V, ONeil CL, Wang PG. Ltd. New York: John Wiley & Sons; 2008.
23. Olariu L, Petcu M, Tulcan C, Chis-Buiga I, Pup M, Florin M, et al. Deuterium depleted water-Antioxidant or Prooxidant. Lucr St Med Vet Timisoara, 2007:265-9.
24. Pryor WA, Stanley JP .Letter: A suggested mechanism for the production of malondialdehyde during the autoxidation of polyunsaturated fatty acids. Nonenzymatic production of prostaglandin endoperoxides during autoxidation. J Org Chem , 1975; 40 (24): 3615–7.
25. Soleyman-Jahi S, Zendehdel K, Akbarzadeh K, Haddadi M, Amanpour S, Muhammadnejad S. In vitro assessment of antineoplastic effects of deuterium depleted water. Asian Pac J Cancer Prev, 2014; 15:2179-83.
26. Somlyai G, Jancso G, Jakli G, Vass K, Barna B, Lakics V, et al. Naturally occurring deuterium is essential for the normal growth rate of cells. FEBS Lett, 1993; 317(1):1-4.
27. Somlyai G, Molnar M, Laskay G, Szabo M, Berkenyi T, Guller I, et al. Biological significance of naturally occurring deuterium: the antitumor effect of deuterium depletion. Orv Hetil, 2010; 151(36):1455-60.
28. Spitz DR, Sim JE, Ridnour LA, Galoforo SS, Lee YJ. Glucose Deprivation Induced Oxidative Stress in Human Tumor Cells: A Fundamental Defect in Metabolism?. Ann N Y Acad Sci. 2000; 899(1):349-62.
29.Twentyman P, Luscombe M. A study of some variables in a tetrazolium dye (MTT) based assay for cell growth and chemosensitivity. Br J Cancer, 1987; 56(3):279.
30. Varangot M, Barrios E, Sonora C, Aizen B, Pressa C, Estrugo R, et al. Clinical evaluation of a panel of mRNA markers in the detection of disseminated tumor cells in patients with operable breast cancer. Oncol Rep, 2005; 14(2):537-46.
31. Valko M, Rhodes C, Moncol J, Izakovic M, Mazur M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chem Biol Interact, 2006; 160(1):1-40.
32. Wang H, Zhu B, He Z, Fu H, Dai Z, Huang G, et al. Deuterium-depleted water (DDW) inhibits the proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma cells in vitro. Biomed Pharmacother, 2013; 67(6):489-96.
33. Xu Y, Xin Y, Diao Y, Lu C, Fu J, Luo L, et al. Synergistic effects of apigenin and paclitaxel on apoptosis of cancer cells. PloS one, 2011; 6(12):e29169.
34. Yavari K, GholamaliM, Yazdian F. Decreasing of Deuterium Concentration of Water: A Possible Tool in Diabetes Therapy. Electron J Boil, 2017; 13(4): 314-319.
The effect of deuterium depleted water on cell growth and antioxidant systems of breast cancer cells
Kamal yavari
Aim and Background:
Recent studies show that the depletion of naturally occurring deuterium can result in tumor regression in both in vitro and in vivo models. The purpose of this study was to investigate the effect of deuterium depleted water (DDW) discretely and in combination with 5-FU on cell growth and anti-oxidant system of breast cancer cells.
Mateial and Methods:
The cellular cytotoxicity test was performed using MTT assay. The MCF-7 cells were treated with decreasing deuterium concentrations of DDW alone, 5-FU alone and both. The malondialdehyde (MDA) level and the catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) enzyme activities were identified spectrophometrically. One way analysis of variance (ANOVA) and t- test were used for statistical analysis. P ≤ 0.05 was considered significant.
Results: Treatment the cells with different concentrations of DDW alone especially in concentrations of 100 and 125ppm imposed growth inhibitory effect on MCF-7 cells. Also, 5-FU alone significantly decreased the survival fractions of MCF-7 cells and DDW in combination with 5-FU augmented 5-FU inhibitory effects on the cells. Compared to the control group (150 ppm), it was observed that in the cells treated with Lower concentrations of DDW, the activities of catalase and superoxide dismutase enzymes increased, but the level of malonyldialdehyde decreased.
Conclusion: Deuterium depleted water can be considered as an adjuvant in anticancer drugs.
Key Words: Deuterium Depleted Water, Breast Cancer, Anti-Oxidants Enzymes, Cell Growth Inhibition, MTT
اثر آب تهی شده از دوتریم بر روی رشد سلولی و سیستم آنتی اکسیدانی سلول های سرطان سینه
کمال یاوری*1 ، لیدا کوشش 2 ، منیره موحدی 2
1- پژوهشگاه علوم و فنون هسته ای، تهران، ایران
2- دانشکده علوم زیستی، واحد تهران شمال ، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران ،ایران
نویسنده مسئول: پژوهشگاه علوم وفنون هسته ای E-mail:
kyavari@aeoi.org.ir
چکیده
سابقه و هدف: مطالعههای اخیر نشان میدهد که کاهش طبیعی میزان دوتریم میتواند منجر به مهار رشد تومور در هر دو مدل in vitro و in vivo شود. هدف از این مطالعه بررسی اثر آب تهی شده از دوتریوم (DDW) تنها و در ترکیب با 5-FU بر روی رشد و سیستم آنتی اکسیدانی سلولهای سرطان سینه است.
مواد و روشها: آزمایش سمیت سلولی با استفاده از روش MTT انجام شد. سلولهای MCF-7 با غلظت های مختلفی از DDW تنها، 5-FU تنها و هر دو تیمار شدند. سطح مالون دی الدئید و فعالیت آنزیمهای کاتالاز و سوپر اکسید دیسموتاز به روش اسپکتروفتومتری انجام گردید. آنالیز واریانس یکطرفه (ANOVA)و t-Test برای تجزیه و تحلیل آماری استفاده شدند. P ≤ 0.05 سطح معنیداری در نظر گرفته شد.
یافتهها: تیمار سلولها با غلظتهای مختلف DDW تنها بهویژه در غلظتهای 100 و ppm 125 باعث مهار رشد سلولهایMCF-7 گردید. 5-FU تنها نیز بهطور قابل توجهی میزان بقاء سلولهای MCF-7 را کاهش داد و استفاده از DDW به همراه 5-FU اثر مهاری 5-FU بر روی سلولها را افزایش داد. در مقایسه با گروه کنترل (ppm 150)، مشاهده گردید که در سلولهای تیمار شده با غلظتهای پایینتر DDW، فعالیت آنزیمهای کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز افزایش ولی سطح مالونیل دی آلدهید کاهش یافته است.
نتیجهگیری: آب تهی شده از دوتریوم میتواند به عنوان یک کمک کننده در داروهای ضد سرطان در نظر گرفته شود.
واژههای کلیدی: آب تهی شده از دوتریوم، سرطان سینه، آنزیمهای آنتی اکسیدان، مهار رشد سلولی، MTT
مقدمه
سرطان سینه یکی از شایعترین انواع سرطان در بین زنان است. امروزه پیشرفت های علمی باعث تشخیص زود هنگام و درمان بهتر سرطان سینه شده است، با این حال این بیماری همچنان به عنوان مهمترین عامل مرگ و میر در بین زنان به شمار می رود (30، 11). فاکتورهای متعددی در افزایش خطر ابتلا به سرطان سینه دخیل می باشند که از جمله این عوامل می توان به افزایش سن، سابقۀ خانوادگی، چاقی پس از یائسگی، مصرف الکل، فعالیت کم جسمانی، قاعدگی زودرس، یائسگی دیر هنگام، تغذیه بد، تماس با میدان های الکترومغناطیسی، تماس با انواع حشره کش ها یا مواد شیمیایی و غیره اشاره کرد(6،12). درمان اول سرطان سینه جراحی است ولی در صورت متاستاز، از شیمی درمانی، هورمون درمانی و رادیوتراپی نیز استفاده می شود (15). استفاده از ایمونوتراپی به همراه سایر روش های درمانی از جمله ژن درمانی، نور درمانی، واکسن ها و آنتی سنس ها نیز به منظور تکمیل درمان مورد توجه محققین می باشند (21). از داروهای رایج ضد سرطانی ترکیب 5 فلورویوراسیل (5-FU) است که آنالوگ پیریمیدین بوده و برای اولین بار در سال 1957 توسط Charles Heidelberger سنتز گردید. اثر ضد سرطانی این دارو بر سرطان های کولون، سینه، سیستم لنفاوی، سر و گردن و پوست تایید شده است (8،7). مشکلی که در استفاده از این نوع داروها وجود دارد این است که این ترکیبات به تنهایی اثر قابل توجهی در مهار رشد سلول های سرطانی ندارند و بنابراین محققین به طور مداوم در صدد افزایش توان مهار رشد سلولی این عوامل درمانی از طریق همراهی با روش ها و ترکیبات جدید می باشند (18،10).
مطالعه های اخیر حاکی از اثر ضد سرطانی آب تهی شده از دوتریم دارد.
مطالعه های جدید نشان داده اند که آب تهی شده از دوتریوم(DDW[1]) در کنترل و درمان انواع سرطان ها از طریق مهار تکثیر سلولی و القای آپوپتوز نقش مهمی ایفا می کند (17). هیدروژن سنگین یا دوتریوم (Deuterium) ایزوتوپ پایدار هیدروژن است که به نسبت یک به 6600 از اتم های هیدروژن در طبیعت حضور دارد (4). اگر یکی از اتم های هیدروژن با دوتریوم جایگزین شود، آب نیمه سنگین یا همان [2]HDO تولید خواهد شد. دوتریوم در آب های سطحی به دو فرم HDO وD2O با غلظت 8/16 mmol/L یا ppm150 وجود دارد (13). DDW که به عنوان آب سبک یا آب بدون دوتریوم نیز شناخته می شود، از جدا کردن دوتریوم طی پروسهی بهرهبرداری از آب سنگین به دست میآید (16). فناوری تولید آب سنگین محدود به چند کشور است که با تلاش محققان ارجمند علوم هستهای، ایران نیز از جملهی این کشورهای تولید کننده D2Oو DDW میباشد. مطالعه های اخیر نشان میدهند که آب تهی شده از دوتریوم کاربردهای مهمی در پزشکی و سلامت ایفا میکند. با توجه به اینکه تاکنون اثر DDW بر روی سرطان سینه مورد مطالعه قرار نگرفته است، بنابراین هدف از پژوهش حاضر ابتدا بررسی اثر سیتوتوکسیک DDW به تنهایی و همراه با داروی 5-FU بر روی رشد سلول های سرطان سینه و سپس بررسی تاثیر آن بر فعالیت آنتی اکسیدانی سلول ها از طریق سنجش فعالیت آنزیم های کاتالاز، سوپراکسید دیسموتاز و فاکتور مالون دی آلدهید است.
مواد و روش ها:
الف: کشت سلولی
سلول های MCF-7 (Michigan Cancer Foundation-7) از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران خریداری شد. سلول ها درمحیط کشت RPMI با 20 درصد سرم جنین گاوی (FBS) و 1 درصد آنتی بیوتیک جنتمایسین نگهداری و پاساژ داده شدند و در دمای 37 درجه سیلسیوس، CO2 5درصد و رطوبت 90 درصد تا زمانی که سلول ها حداقل به 70 درصد رشد برسند، نگهداری شدند. آب تهی شده از دوتریم با غلظت های 30، 50، 75، 100، 125 و ppm150 از شرکت مصباح انرژی تهیه گردید.
ب: بررسی مهار رشد سلولی به روش MTT
آزمون سیتوتوکسیک سلولی بر اساس روش MTT انجام شد. تعداد 5000 سلول به هر چاهک پلیت 96 خانه ای با 4 بار تکرار اضافه گردید. سلول ها در محیط RPMI کشت داده شدند و روز بعد هریک از چاهک ها با محیط کشت تهیه شده از DDW با غلظت های مختلف (30، 50، 75، 100، 125 و ppm150) به تنهایی و یا همراه با داروی 5-FU با غلظت های (2، 4، 8، 16 وµg/ml 32) تعویض گردید. سلول ها به مدت 24، 48 و72 ساعت انکوبه شدند و سپس آزمون MTT طبق پروتکل بر روی آن ها انجام گردید (29).
پ:سنجش سوپراکسید دیسموتاز
محلول واکنش جهت سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز از تریتون100x یک درصد، محلول Pyrogallol mM/L9/0، محلولmM/L NBT 98/0، مهارکننده آنزیمی mM/L1و بافر Tris- Cacodylic ساخته شد و سپس میزان فعالیت آنزیم مورد نظر به روش رنگ سنجی در طول موج nm۵۶۰ اندازه گیری گردید(20).
ت: سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز
محلول واکنش جهت سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز از ترکیب تریتون100x یک درصد، mM/L1 EDTA، بافر فسفات سدیم mM/L100، مهارکننده آنزیمی mM/L1 و µL50 محلول آب اکسیژنه تهیه گردید و میزان فعالیت آنزیم کاتالاز به روش رنگ سنجی در طول موج nm240 سنجیده شد(1).
ث: سنجش مالون دی آلدهید
به منظور اندازه گیری میزان MDA،103×500 سلول را شمارش کرده و در یک میکروتیوپ 2 میلی لیتر ریخته و با دور rpm3000 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. محلول رویی به آرامی با سمپلر خالی شده و روی رسوب سلولی ml 1.5 تری کلرواستیک اسید 10% اضافه گردید. سلول ها را با دستگاه سونیکاتور به مدت2 دقیقه با تعداد 60 سیکل در ثانیه سونیکه کرده و بعد از شفاف شدن محلول حاوی سلول و همگن سازی، آن را با دور rpm10000به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ کرده تا سلول ته نشین گردند. بهml5/0 ازمحلول رویی حاوی MDA، ml5/0 تیوباربیتوریک اسید 5/0% اضافه کرده و به مدت 5/0 ساعت در بن ماریC °100 قرار داده شد. میزان محصول صورتی رنگ با روش رنگ سنجی در طول موج nm540-530 اندازه گیری اندازه گردید.
ج:آنالیز آماری
تجزیه و تحلیل آماری داده ها با استفاده از نرم افزار Graphpad Prism 5.01 و روش واریانس یکطرفه(ANOVA) وt-Test مورد بررسی قرار گرفت. P ≤ 0.05 به عنوان سطح معنی داری در نظر گرفته شد.
یافته ها:
نتایج مهار رشد سلولی
با توجه به تغییرات کل منحنی ها درصد زنده ماندن سلول های تیمار شده با دارو و بدون دارو نشان داده شده است. الف:نتایج آزمون 24 ساعت MTT
در تیمار ۲۴ ساعت سلول ها به تنهایی و یا همراه با 5-FU، افزایش غلظت دارو با 0154/0P value < و کاهش غلظت دوتریوم موجود در آب با 001/0 P value < به صورت معنی داری بر درصد بقای سلولی تاثیر گذاشت. کمترین درصد بقای سلولی مربوط به غلظت های100 و ppm 125 از DDW و غلظت های 8، 16 و µg/ml32 از داروی 5-FU بود. در غلظتهای بالای دارو (16 و µM32) اختلاف درصد بقا میان نمونههای تیمار شده و نمونههای کنترل به بیشترین مقدار خود رسید (شکل 1).
سرطان سینه یکی از شایعترین انواع سرطان در بین زنان است. امروزه پیشرفت های علمی باعث تشخیص زود هنگام و درمان بهتر سرطان سینه شده است، با این حال این بیماری همچنان به عنوان مهمترین عامل مرگ و میر در بین زنان به شمار می رود (30، 11). فاکتورهای متعددی در افزایش خطر ابتلا به سرطان سینه دخیل می باشند که از جمله این عوامل می توان به افزایش سن، سابقۀ خانوادگی، چاقی پس از یائسگی، مصرف الکل، فعالیت کم جسمانی، قاعدگی زودرس، یائسگی دیر هنگام، تغذیه بد، تماس با میدان های الکترومغناطیسی، تماس با انواع حشره کش ها یا مواد شیمیایی و غیره اشاره کرد(6،12). درمان اول سرطان سینه جراحی است ولی در صورت متاستاز، از شیمی درمانی، هورمون درمانی و رادیوتراپی نیز استفاده می شود (15). استفاده از ایمونوتراپی به همراه سایر روش های درمانی از جمله ژن درمانی، نور درمانی، واکسن ها و آنتی سنس ها نیز به منظور تکمیل درمان مورد توجه محققین می باشند (21). از داروهای رایج ضد سرطانی ترکیب 5 فلورویوراسیل (5-FU) است که آنالوگ پیریمیدین بوده و برای اولین بار در سال 1957 توسط Charles Heidelberger سنتز گردید. اثر ضد سرطانی این دارو بر سرطان های کولون، سینه، سیستم لنفاوی، سر و گردن و پوست تایید شده است (8،7). مشکلی که در استفاده از این نوع داروها وجود دارد این است که این ترکیبات به تنهایی اثر قابل توجهی در مهار رشد سلول های سرطانی ندارند و بنابراین محققین به طور مداوم در صدد افزایش توان مهار رشد سلولی این عوامل درمانی از طریق همراهی با روش ها و ترکیبات جدید می باشند (18،10).
مطالعه های اخیر حاکی از اثر ضد سرطانی آب تهی شده از دوتریم دارد.
مطالعه های جدید نشان داده اند که آب تهی شده از دوتریوم(DDW[1]) در کنترل و درمان انواع سرطان ها از طریق مهار تکثیر سلولی و القای آپوپتوز نقش مهمی ایفا می کند (17). هیدروژن سنگین یا دوتریوم (Deuterium) ایزوتوپ پایدار هیدروژن است که به نسبت یک به 6600 از اتم های هیدروژن در طبیعت حضور دارد (4). اگر یکی از اتم های هیدروژن با دوتریوم جایگزین شود، آب نیمه سنگین یا همان [2]HDO تولید خواهد شد. دوتریوم در آب های سطحی به دو فرم HDO وD2O با غلظت 8/16 mmol/L یا ppm150 وجود دارد (13). DDW که به عنوان آب سبک یا آب بدون دوتریوم نیز شناخته می شود، از جدا کردن دوتریوم طی پروسهی بهرهبرداری از آب سنگین به دست میآید (16). فناوری تولید آب سنگین محدود به چند کشور است که با تلاش محققان ارجمند علوم هستهای، ایران نیز از جملهی این کشورهای تولید کننده D2Oو DDW میباشد. مطالعه های اخیر نشان میدهند که آب تهی شده از دوتریوم کاربردهای مهمی در پزشکی و سلامت ایفا میکند. با توجه به اینکه تاکنون اثر DDW بر روی سرطان سینه مورد مطالعه قرار نگرفته است، بنابراین هدف از پژوهش حاضر ابتدا بررسی اثر سیتوتوکسیک DDW به تنهایی و همراه با داروی 5-FU بر روی رشد سلول های سرطان سینه و سپس بررسی تاثیر آن بر فعالیت آنتی اکسیدانی سلول ها از طریق سنجش فعالیت آنزیم های کاتالاز، سوپراکسید دیسموتاز و فاکتور مالون دی آلدهید است.
مواد و روش ها:
الف: کشت سلولی
سلول های MCF-7 (Michigan Cancer Foundation-7) از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران خریداری شد. سلول ها درمحیط کشت RPMI با 20 درصد سرم جنین گاوی (FBS) و 1 درصد آنتی بیوتیک جنتمایسین نگهداری و پاساژ داده شدند و در دمای 37 درجه سیلسیوس، CO2 5درصد و رطوبت 90 درصد تا زمانی که سلول ها حداقل به 70 درصد رشد برسند، نگهداری شدند. آب تهی شده از دوتریم با غلظت های 30، 50، 75، 100، 125 و ppm150 از شرکت مصباح انرژی تهیه گردید.
ب: بررسی مهار رشد سلولی به روش MTT
آزمون سیتوتوکسیک سلولی بر اساس روش MTT انجام شد. تعداد 5000 سلول به هر چاهک پلیت 96 خانه ای با 4 بار تکرار اضافه گردید. سلول ها در محیط RPMI کشت داده شدند و روز بعد هریک از چاهک ها با محیط کشت تهیه شده از DDW با غلظت های مختلف (30، 50، 75، 100، 125 و ppm150) به تنهایی و یا همراه با داروی 5-FU با غلظت های (2، 4، 8، 16 وµg/ml 32) تعویض گردید. سلول ها به مدت 24، 48 و72 ساعت انکوبه شدند و سپس آزمون MTT طبق پروتکل بر روی آن ها انجام گردید (29).
پ:سنجش سوپراکسید دیسموتاز
محلول واکنش جهت سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز از تریتون100x یک درصد، محلول Pyrogallol mM/L9/0، محلولmM/L NBT 98/0، مهارکننده آنزیمی mM/L1و بافر Tris- Cacodylic ساخته شد و سپس میزان فعالیت آنزیم مورد نظر به روش رنگ سنجی در طول موج nm۵۶۰ اندازه گیری گردید(20).
ت: سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز
محلول واکنش جهت سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز از ترکیب تریتون100x یک درصد، mM/L1 EDTA، بافر فسفات سدیم mM/L100، مهارکننده آنزیمی mM/L1 و µL50 محلول آب اکسیژنه تهیه گردید و میزان فعالیت آنزیم کاتالاز به روش رنگ سنجی در طول موج nm240 سنجیده شد(1).
ث: سنجش مالون دی آلدهید
به منظور اندازه گیری میزان MDA،103×500 سلول را شمارش کرده و در یک میکروتیوپ 2 میلی لیتر ریخته و با دور rpm3000 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. محلول رویی به آرامی با سمپلر خالی شده و روی رسوب سلولی ml 1.5 تری کلرواستیک اسید 10% اضافه گردید. سلول ها را با دستگاه سونیکاتور به مدت2 دقیقه با تعداد 60 سیکل در ثانیه سونیکه کرده و بعد از شفاف شدن محلول حاوی سلول و همگن سازی، آن را با دور rpm10000به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ کرده تا سلول ته نشین گردند. بهml5/0 ازمحلول رویی حاوی MDA، ml5/0 تیوباربیتوریک اسید 5/0% اضافه کرده و به مدت 5/0 ساعت در بن ماریC °100 قرار داده شد. میزان محصول صورتی رنگ با روش رنگ سنجی در طول موج nm540-530 اندازه گیری اندازه گردید.
ج:آنالیز آماری
تجزیه و تحلیل آماری داده ها با استفاده از نرم افزار Graphpad Prism 5.01 و روش واریانس یکطرفه(ANOVA) وt-Test مورد بررسی قرار گرفت. P ≤ 0.05 به عنوان سطح معنی داری در نظر گرفته شد.
یافته ها:
نتایج مهار رشد سلولی
با توجه به تغییرات کل منحنی ها درصد زنده ماندن سلول های تیمار شده با دارو و بدون دارو نشان داده شده است. الف:نتایج آزمون 24 ساعت MTT
در تیمار ۲۴ ساعت سلول ها به تنهایی و یا همراه با 5-FU، افزایش غلظت دارو با 0154/0P value < و کاهش غلظت دوتریوم موجود در آب با 001/0 P value < به صورت معنی داری بر درصد بقای سلولی تاثیر گذاشت. کمترین درصد بقای سلولی مربوط به غلظت های100 و ppm 125 از DDW و غلظت های 8، 16 و µg/ml32 از داروی 5-FU بود. در غلظتهای بالای دارو (16 و µM32) اختلاف درصد بقا میان نمونههای تیمار شده و نمونههای کنترل به بیشترین مقدار خود رسید (شکل 1).
شکل1: مهار رشد سلولی پس از 24 ساعت
ب:نتایج آزمون 48 ساعت MTT
در تیمار 48 ساعت سلول ها با DDW به تنهایی و یا همراه با 5-FU، تاثیر غلظت دارو، غلظت دوتریوم و اثر سینرژیک این دو عامل با 0001/0 P value < بر روی درصد بقا سلولی از نظر آماری معنیدار بود. کمترین درصد بقای سلولی مربوط به غلظت ppm100DDW بوده، در میان سایر غلظت ها، کمترین درصد بقا سلولی به غلظتppm 50 DDW تعلق داشت (شکل 2).
در تیمار 48 ساعت سلول ها با DDW به تنهایی و یا همراه با 5-FU، تاثیر غلظت دارو، غلظت دوتریوم و اثر سینرژیک این دو عامل با 0001/0 P value < بر روی درصد بقا سلولی از نظر آماری معنیدار بود. کمترین درصد بقای سلولی مربوط به غلظت ppm100DDW بوده، در میان سایر غلظت ها، کمترین درصد بقا سلولی به غلظتppm 50 DDW تعلق داشت (شکل 2).
شکل2: مهار رشد سلولی پس از 48 ساعت
پ:نتایج آزمون 72 ساعت MTT
در مطالعه 72 ساعت آزمایش مهار رشد سلولی، بیشترین و کمترین درصد بقای سلولی به ترتیب در گروه های سلولی تیمارشده باppm 30DDW به همراه 5-FU با غلظت µg/ml32 و ppm150 DDW به همراه 5-FU با غلظت های 2 و µg/ml4 دیده شد. غلظت های مختلف DDW بدون 5-FU نیز بر روی مهار رشد سلولی اثر متفاوتی را نشان دادند. بیشترین کاهش رشد سلولی در غلظت ppm30 و کمترین کاهش رشد سلولی در غلظت ppm150 DDW مشاهده گردید (شکل 3).
در مطالعه 72 ساعت آزمایش مهار رشد سلولی، بیشترین و کمترین درصد بقای سلولی به ترتیب در گروه های سلولی تیمارشده باppm 30DDW به همراه 5-FU با غلظت µg/ml32 و ppm150 DDW به همراه 5-FU با غلظت های 2 و µg/ml4 دیده شد. غلظت های مختلف DDW بدون 5-FU نیز بر روی مهار رشد سلولی اثر متفاوتی را نشان دادند. بیشترین کاهش رشد سلولی در غلظت ppm30 و کمترین کاهش رشد سلولی در غلظت ppm150 DDW مشاهده گردید (شکل 3).
شکل3: مهار رشد سلولی پس از 72 ساعت
ت: نتایج بررسی فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز
مطالعه ما نشان داد که اثر سینرژیک آب تهی شده از دوتریم و داروی 5-FU از نظر آماری معنیدار است. DDW در غلظتهای پایین دوتریم از جمله در غلظت های30 و ppm50 اثر معنیداری بر افزایش فعالیت سوپراکسید دیسموتاز داشت. کمترین فعالیت معنی دار آنزیم در غلظت های 8 و µg/ml32 از داروی 5-FU و DDW با غلظت بالای دوتریوم به ویژه در ppm125
و ppm150مشاهده گردید (شکل 4).
مطالعه ما نشان داد که اثر سینرژیک آب تهی شده از دوتریم و داروی 5-FU از نظر آماری معنیدار است. DDW در غلظتهای پایین دوتریم از جمله در غلظت های30 و ppm50 اثر معنیداری بر افزایش فعالیت سوپراکسید دیسموتاز داشت. کمترین فعالیت معنی دار آنزیم در غلظت های 8 و µg/ml32 از داروی 5-FU و DDW با غلظت بالای دوتریوم به ویژه در ppm125
و ppm150مشاهده گردید (شکل 4).
شکل 4: فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در سلول های MCF-7 پس از 48 ساعت تیمار با غلظت های مختلف دوتریوم و غلظت های 8 وµg/ml32 از داروی5-FU
ث: نتایج بررسی فعالیت آنزیم کاتالاز
در مطالعه فعالیت آنزیم کاتالاز مشاهده گردید که هر چه غلظت دوتریوم کمتر شود، فعالیت کاتالاز روند افزایشی را نشان می دهد. بیشترین فعالیت آنزیم در غلظت ppm50 DDW مشاهده گردید و کمترین فعالیت نیز متعلق به سلول های تیمار شده با ترکیب ppm 150 از DDW و داروی 5-FU با غلظت µg/ml32 بود (شکل5).
در مطالعه فعالیت آنزیم کاتالاز مشاهده گردید که هر چه غلظت دوتریوم کمتر شود، فعالیت کاتالاز روند افزایشی را نشان می دهد. بیشترین فعالیت آنزیم در غلظت ppm50 DDW مشاهده گردید و کمترین فعالیت نیز متعلق به سلول های تیمار شده با ترکیب ppm 150 از DDW و داروی 5-FU با غلظت µg/ml32 بود (شکل5).
شکل 5: فعالیت آنزیم کاتالاز در سلول های MCF-7 پس از 48 ساعت تیمار با غلظت های مختلف دوتریوم و غلظت های 8 وµg/ml32 از داروی5-FU
ج: نتایج میزان فاکتور مالونیل دی آلدهید
بررسی میزان فاکتور مالونیل دی آلدهید نشان داد که هر چه غلظت دوتریوم در محیط کشت زیاد می شود، سطح مالونیل دی آلدهید نیز روند افزایشی پیدا می کند (شکل 6).
شکل 6: میزان فاکتور مالونیل دی آلدهید در سلول های MCF-7 پس از 48 ساعت تیمار با غلظت های مختلف دوتریوم و غلظت های 8 وµg/ml32 از داروی5-FU
بحث
هدف از این مطالعه بررسی خواص ضد سرطانی آب تهی شده از دوتریم بر روی رده های سلولی سرطان سینه بود. مطالعه ما نشان داد که DDW به طور موثری رشد سلول های سرطانی MCF-7 را مهار می کند و تخلیه دوتریم آب باعث افزایش خاصیت توکسیسیتی وابسته به زمان و غلظت 5-FU می گردد. مطالعه های قبلی نشان داده DDW می تواند در سیستم های درون تنی و برون تنی اثر مهار رشد سلول سرطانی داشته باشد. در اولین مطالعهی انجام شده در این رابطه، اثر آب تهی شده از دوتریوم بر رشد رده ی سلولی فیبروبلاستی L929 در سال 1990 توسط Somlyai و همکاران مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این مطالعه بیانگر مهار رشد این ردهی سلولی در غلظتهای پایین دوتریوم بود. در ادامه، اثر جایگزینی آب نوشیدنی با DDW با غلظت ppm 30 دوتریوم بر روی موشهای ترانسپلنت شده با سلولهای سرطانی MCF-7 و MDA-MB-231 مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این بررسی حاکی از افزایش مدت زمان زنده ماندن موشهای توموری و ناپدید شدن تومور در %59 از آنها بود (26). مطالعه های بعدی شواهدی را مبنی بر اثر مهاری DDW بر رشد سلولهای سرطانی PC-3 (سلول سرطانی پروستات)، MDA (سلول سرطانی سینه)، HT-29 (سلول سرطانی کولون) و M14 (ملانوما) از طریق به تعویق انداختن پیشرفت چرخهی سلولی ارائه دادند؛ بدین معنا که سلولها نیازمند زمان طولانیتری برای تکثیر میباشند (27). براساس مطالعه های انجام شده غلظت های بالای دوتریوم می تواند رشد سلول ها را مهار کند و آن ها را در برابر پرتوها محافظت کند، اما در بلند مدت اثر منفی دارد. در یک مطالعه نشان داده شد که تیمار کوتاه مدت موش ها با DDW باعث کاهش طول عمر و حتی مرگ موش ها می شود (14،3). مکانیسمی که برای این اثرات ضد سرطانی آب ارائه گردیده نشان می دهد که جایگزینی هیدروژن با دوتریوم به دلیل وجود تفاوت جرمی میان هیدروژن و دوتریوم منجر به بروز تغییراتی در رفتار فیزیکی و شیمیایی سلول شده که در سیستم های بیولوژیکی از اهمیت ویژهای برخوردار است(33).
مطالعه های قبلی نیاز به بررسی بیشتری داشت و به منظور تکمیل پژوهش های انجام شده پیرامون اثر آب تهی شده از دوتریوم، در این تحقیق به بررسی اثر آب تهیشده از دوتریوم به تنهایی و همراه با داروی 5-FU بر روی رشد سلولی و ارتباط آن با فعالیت آنزیمهای سیستم آنتی اکسیدانی پرداخته شد. برای این منظور رشد ردهی سلولی MCF7 در محیط کشت دارای غلظتهای مختلف DDW به تنهایی و همراه با غلظتهای مختلف از داروی 5-FU مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل نشان دادند که DDW به تنهایی در غلظتهای پایین دوتریوم (پایینتر از ppm 125) بهخصوص در غلظت های ppm 30-125، منجر به مهار رشد سلولهای سرطانی میشود. همچنین مشاهده گردید که به کارگیری DDW در ترکیب با 5-FU، رشد سلولی را به طور چشمگیرتری مهار می کند. این تفاوت در تمام غلظتهای دارو نسبت به کنترل صفر دارو قابل مشاهده بود.
در مطالعه ای که توسط Feng- Song Cong و همکاران در سال 2010 بر ردهی سلولی A549 صورت گرفت، مشخص شد که بیشترین مهار رشد سلولی در غلظت ppm 50 از DDW رخ داده است (3). در مطالعه انجام شده توسط Wang و همکاران در سال 2012، مهار رشد سلولهای NPC توسط آزمون MTT و سنجش تشکیل کلونی (plate colony formation assay) مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این مطالعه بیانگر مهار رشد سلولی در غلظتهای 50،75 و ppm100 از دوتریوم و کاهش توانایی تشکیل کلونی بود (33،29). در مطالعهی دیگری که توسط Soleyman-Jahi و همکاران انجام شد، اثر سینرژیک داروی پاکلیتاکسل با غلظت µM5/0و غلظتهای40، 62، 84، 106 و ppm 128 ازDDW بر روی ردههای سلولی سرطانی سینه (MDA-MB-231)، پروستات (PC-3)، روده(HCT-116) و گلیوبلاستوما (U-87MG) مورد بررسی قرار گرفت. در تحقیق آن ها مشخص گردید که کاهش غلظت دوتریوم آب در محیط کشت سبب افزایش سمیت داروی پاکلیتاکسل بر ردههای سلولی MDA-MB-231، PC-3، U-87MG می گردد ولی اثر سینرژیکی مهار رشد سلولی توسط DDW بر روی ردهی سلولی HCT-116 معنیدار نبود (25). مهم ترین مکانیسمی که تا به حال برای DDW جهت مهار رشد سلولی مطرح گردیده است اثر مهاری DDW بر سیکل چرخه ی سلول های سرطانی و القاء آپپتوز است به طوری که ازدیاد و تکثیر آن ها را مهار می کند و به دنبال آن مانع ازدیاد سلول های جهش یافته می شود (34،33،14).
نتایج تحقیق ما تا حدودی با یافته های این محققین همخوانی دارد با این تفاوت که در مطالعه ما بر عکس یافته های Soleyman-Jahi ولی در متطابقت با یافته های Wang، مشاهده گردید که خود DDW به تنهایی اثر مهار رشد سلولی دارد (25و33).
بررسی سیستم آنتی اکسیدانی سلول آزمایش دیگری است که در انواع تحقیق ها مورد بررسی قرار گرفته است. لازم به توضیح است که رادیکالهای سوپراکسید و پراکسید هیدروژن از جمله گونههای فعال اکسیژن هستند که به عنوان محصولات جانبی متابولیسم نرمال اکسیژن در سلولها و بافتها تولید میشوند. به علت فعالیت ذاتی بالای ROS، این ترکیبات بهصورت ناخواسته وارد واکنشهایی میشوند که درنهایت سبب وارد آمدن آسیب به سلولها میگردد. اکثر سلولهای سرطانی به دلیل تحریکات انکوژنیک، فعالیت متابولیک افزایش یافته و بدعملکردی میتوکندریایی، تحت استرس اکسیداتیو میباشند (31). در سلولهای سرطانی، میزان واکنش های گلیکولیز و تنفس به ترتیب بیشتر وکم تر از سلولهای نرمال میباشد و این تفاوت منجر به افزایش استرس اکسیداتیو میشود (28). وضعیت اکسایشی بالا در سلول، شکلگیری تومور را از طریق رشد سلولی تحریک کرده و با سرکوب فعالیتهای ضدتوموری منجر به آسیب ساختمان DNA میشود (8). اثر آنتی اکسیدانی آب تهی شده از دوتریوم از دلایل مهم دیگر به کارگیری DDW در زمینه پزشکی است. طی مطالعه ای که در سال2007 توسط Olariumو همکاران انجام گرفت، مشخص گردید که آب تهی شده از دوتریوم در کوتاه مدت اثر پراکسیدانی دارد ولی در طولانی مدت اثرات آنتی اکسیدانی خود را از طریق تحریک سیستم دفاع آنتی اکسیدانی اعمال می کند (23). چندین فرضیه در مورد مکانیسم اثر DDW بر روی سیستم آنتی اکسیدانی مطرح است. مطالعه های قبلی نشان داده اند که تغییر نسبت هیدروژن به دوتریم در سلول باعث تغییر پتانسیل غشاء سلول ها گردیده و فعالیت های فیزیکوشیمایی سلول از جمله برخی پمپ ها و آنزیم ها را تحت تاثیر قرار می دهد. آنزیم های آنتی اکسیدان از جمله گروه های فعال شده توسط DDW در این راستا است. مکانیسم دیگر برای نقش احتمالی DDW در سیستم دفاعی، کاهش میزان استرس اکسیداتیو از طریق کاهش فعالیت مسیر گلیکولیز سلول سرطانی و در نتیجه تغییر شرایط پراکسیداتیو سلول به نفع شرایط آنتی اکسیداتیو است (33،2).
فاکتور دیگری که در سیستم آنتی اکسیدانی و پراکسیدانی مهم است، فاکتور MDA است. مالون دی آلدئید محصول پراکسیداسیون لیپید اسیدهای چرب غیر اشباع است و یکی از چند محصول عمده در سنتز ترومبوکسان A2 است، جایی که در آن سیکلواکسیژناز1یا سیکلواکسیژناز2 در سلول ها اسید آراشیدونیک را به پروستاگلاندین H2 متابولیزه می کند. این محصول نیز بیشتر متابولیزه می گردد تا اینکه توسط ترومبوکسان سنتاز به ترومبوکسان A2، هیدروکسی هپتادکاتری انوئیک اسید و مالون دی آلدئید تبدیل می گردد. علاوه بر این ممکن است به صورت غیر آنزیمی به مخلوطی از ایزومرهای 8-سیس و 8- ترانس 12- هیدروکسی ایکازوهپتاانوئیک اسید و مانونیل دی آلدئید تبدیل شود (22).
گونه های واکنش پذیر اکسیژن (ROS) لیپید های غیر اشباع را تجزیه می کنند و مانونیل دی آلدئید را تشکیل می دهند. این ترکیب یک آلدهید از گونه های الکتروفیل واکنشی است که باعث ایجاد استرس سمی در سلول ها می شود و به عنوان بیومارکر برای اندازه گیری سطح استرس اکسیداتیو در سلول مورد استفاده قرار می گیرد (24،7،5).
در مورد مکانیزم اثر MDA گزارش شده که مالون دی آلدئید با دزوکسی آدنوزین و دزوکسی گوآنوین در DNA واکنش می دهد و قطعه های DNA را تشکیل می دهد که M1G اولیه یکی از آن ها بوده و موتاژن است (19،9،5). در انسان آلدئید دهیدروژناز قادر به اکسیداسیون مالون دی آلدئید است. مشاهده گردیده است که DDW بخصوص در غلظت های پایین میزان MDA را کاهش می دهد (19،9). دلیل این کار زیاد مشخص نیست ولی احتمال داده می شود که بنا بر دلایلی همچون تغییر پتانسیل غشاء سلولی توسط تغییر نسبت دوتریم و هیدروژن و کاهش میزان دوتریم، بسته شدن یا کوتاه شدن مسیرهای چرخه سلولی از جمله فازS و G1/M و مهار شرایط استرس سلولی توسط کاهش میزان دوتریم درDDW عواملی باشند که باعث مهار سنتز آنزیم های اشاره شده در مسیر سنتز مالون دی آلدئید می گردند (23،2).
در پژوهش حاضر نیز فاکتورهای موثر در سیستم آنتی اکسیدانی در سطح سلول مورد بررسی قرار گرفت و مشاهده شد که با کاهش غلظت دوتریم در DDW فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدان سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز روند افزایشی پیدا می کند و بنابراین میتوان چنین استنباط کرد که کاهش رشد سلولی و افزایش فعالیت آنزیمهای سیستم آنتی اکسیدانی با هم ارتباط معنی داری داشته و در نهایت به صورت هماهنگ مهار رشد سلولهای سرطانی را القا میکنند. از طرف دیگر مشاهده گردید که با افزایش غلظت DDW، سطح مالون دی آلدهید (فاکتور شرایط پراکسیداتیو) نیز افزایش می یابد. نتایج این پژوهش نشان داد که DDW بر عکس آب شهری (DDW150ppm) در القاء سیستم آنتی اکسیدانی و مهار شرایط پراکسیداتیو نقش مهمی را ایفا می کند.
نتیجه گیری:
مطالعه های ما نشان داد که آب تهی شده از دوتریم در غلظت های پایین دوتریم به ویژه در غلظت های زیر 125ppm به صورت سینرژیک با داروی شیمی درمانی 5-FU ، باعث کاهش رشد سلول های سرطانی سینه و القاء سیستم آنتی اکسیدانی سلول می گردد.
هدف از این مطالعه بررسی خواص ضد سرطانی آب تهی شده از دوتریم بر روی رده های سلولی سرطان سینه بود. مطالعه ما نشان داد که DDW به طور موثری رشد سلول های سرطانی MCF-7 را مهار می کند و تخلیه دوتریم آب باعث افزایش خاصیت توکسیسیتی وابسته به زمان و غلظت 5-FU می گردد. مطالعه های قبلی نشان داده DDW می تواند در سیستم های درون تنی و برون تنی اثر مهار رشد سلول سرطانی داشته باشد. در اولین مطالعهی انجام شده در این رابطه، اثر آب تهی شده از دوتریوم بر رشد رده ی سلولی فیبروبلاستی L929 در سال 1990 توسط Somlyai و همکاران مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این مطالعه بیانگر مهار رشد این ردهی سلولی در غلظتهای پایین دوتریوم بود. در ادامه، اثر جایگزینی آب نوشیدنی با DDW با غلظت ppm 30 دوتریوم بر روی موشهای ترانسپلنت شده با سلولهای سرطانی MCF-7 و MDA-MB-231 مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این بررسی حاکی از افزایش مدت زمان زنده ماندن موشهای توموری و ناپدید شدن تومور در %59 از آنها بود (26). مطالعه های بعدی شواهدی را مبنی بر اثر مهاری DDW بر رشد سلولهای سرطانی PC-3 (سلول سرطانی پروستات)، MDA (سلول سرطانی سینه)، HT-29 (سلول سرطانی کولون) و M14 (ملانوما) از طریق به تعویق انداختن پیشرفت چرخهی سلولی ارائه دادند؛ بدین معنا که سلولها نیازمند زمان طولانیتری برای تکثیر میباشند (27). براساس مطالعه های انجام شده غلظت های بالای دوتریوم می تواند رشد سلول ها را مهار کند و آن ها را در برابر پرتوها محافظت کند، اما در بلند مدت اثر منفی دارد. در یک مطالعه نشان داده شد که تیمار کوتاه مدت موش ها با DDW باعث کاهش طول عمر و حتی مرگ موش ها می شود (14،3). مکانیسمی که برای این اثرات ضد سرطانی آب ارائه گردیده نشان می دهد که جایگزینی هیدروژن با دوتریوم به دلیل وجود تفاوت جرمی میان هیدروژن و دوتریوم منجر به بروز تغییراتی در رفتار فیزیکی و شیمیایی سلول شده که در سیستم های بیولوژیکی از اهمیت ویژهای برخوردار است(33).
مطالعه های قبلی نیاز به بررسی بیشتری داشت و به منظور تکمیل پژوهش های انجام شده پیرامون اثر آب تهی شده از دوتریوم، در این تحقیق به بررسی اثر آب تهیشده از دوتریوم به تنهایی و همراه با داروی 5-FU بر روی رشد سلولی و ارتباط آن با فعالیت آنزیمهای سیستم آنتی اکسیدانی پرداخته شد. برای این منظور رشد ردهی سلولی MCF7 در محیط کشت دارای غلظتهای مختلف DDW به تنهایی و همراه با غلظتهای مختلف از داروی 5-FU مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل نشان دادند که DDW به تنهایی در غلظتهای پایین دوتریوم (پایینتر از ppm 125) بهخصوص در غلظت های ppm 30-125، منجر به مهار رشد سلولهای سرطانی میشود. همچنین مشاهده گردید که به کارگیری DDW در ترکیب با 5-FU، رشد سلولی را به طور چشمگیرتری مهار می کند. این تفاوت در تمام غلظتهای دارو نسبت به کنترل صفر دارو قابل مشاهده بود.
در مطالعه ای که توسط Feng- Song Cong و همکاران در سال 2010 بر ردهی سلولی A549 صورت گرفت، مشخص شد که بیشترین مهار رشد سلولی در غلظت ppm 50 از DDW رخ داده است (3). در مطالعه انجام شده توسط Wang و همکاران در سال 2012، مهار رشد سلولهای NPC توسط آزمون MTT و سنجش تشکیل کلونی (plate colony formation assay) مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این مطالعه بیانگر مهار رشد سلولی در غلظتهای 50،75 و ppm100 از دوتریوم و کاهش توانایی تشکیل کلونی بود (33،29). در مطالعهی دیگری که توسط Soleyman-Jahi و همکاران انجام شد، اثر سینرژیک داروی پاکلیتاکسل با غلظت µM5/0و غلظتهای40، 62، 84، 106 و ppm 128 ازDDW بر روی ردههای سلولی سرطانی سینه (MDA-MB-231)، پروستات (PC-3)، روده(HCT-116) و گلیوبلاستوما (U-87MG) مورد بررسی قرار گرفت. در تحقیق آن ها مشخص گردید که کاهش غلظت دوتریوم آب در محیط کشت سبب افزایش سمیت داروی پاکلیتاکسل بر ردههای سلولی MDA-MB-231، PC-3، U-87MG می گردد ولی اثر سینرژیکی مهار رشد سلولی توسط DDW بر روی ردهی سلولی HCT-116 معنیدار نبود (25). مهم ترین مکانیسمی که تا به حال برای DDW جهت مهار رشد سلولی مطرح گردیده است اثر مهاری DDW بر سیکل چرخه ی سلول های سرطانی و القاء آپپتوز است به طوری که ازدیاد و تکثیر آن ها را مهار می کند و به دنبال آن مانع ازدیاد سلول های جهش یافته می شود (34،33،14).
نتایج تحقیق ما تا حدودی با یافته های این محققین همخوانی دارد با این تفاوت که در مطالعه ما بر عکس یافته های Soleyman-Jahi ولی در متطابقت با یافته های Wang، مشاهده گردید که خود DDW به تنهایی اثر مهار رشد سلولی دارد (25و33).
بررسی سیستم آنتی اکسیدانی سلول آزمایش دیگری است که در انواع تحقیق ها مورد بررسی قرار گرفته است. لازم به توضیح است که رادیکالهای سوپراکسید و پراکسید هیدروژن از جمله گونههای فعال اکسیژن هستند که به عنوان محصولات جانبی متابولیسم نرمال اکسیژن در سلولها و بافتها تولید میشوند. به علت فعالیت ذاتی بالای ROS، این ترکیبات بهصورت ناخواسته وارد واکنشهایی میشوند که درنهایت سبب وارد آمدن آسیب به سلولها میگردد. اکثر سلولهای سرطانی به دلیل تحریکات انکوژنیک، فعالیت متابولیک افزایش یافته و بدعملکردی میتوکندریایی، تحت استرس اکسیداتیو میباشند (31). در سلولهای سرطانی، میزان واکنش های گلیکولیز و تنفس به ترتیب بیشتر وکم تر از سلولهای نرمال میباشد و این تفاوت منجر به افزایش استرس اکسیداتیو میشود (28). وضعیت اکسایشی بالا در سلول، شکلگیری تومور را از طریق رشد سلولی تحریک کرده و با سرکوب فعالیتهای ضدتوموری منجر به آسیب ساختمان DNA میشود (8). اثر آنتی اکسیدانی آب تهی شده از دوتریوم از دلایل مهم دیگر به کارگیری DDW در زمینه پزشکی است. طی مطالعه ای که در سال2007 توسط Olariumو همکاران انجام گرفت، مشخص گردید که آب تهی شده از دوتریوم در کوتاه مدت اثر پراکسیدانی دارد ولی در طولانی مدت اثرات آنتی اکسیدانی خود را از طریق تحریک سیستم دفاع آنتی اکسیدانی اعمال می کند (23). چندین فرضیه در مورد مکانیسم اثر DDW بر روی سیستم آنتی اکسیدانی مطرح است. مطالعه های قبلی نشان داده اند که تغییر نسبت هیدروژن به دوتریم در سلول باعث تغییر پتانسیل غشاء سلول ها گردیده و فعالیت های فیزیکوشیمایی سلول از جمله برخی پمپ ها و آنزیم ها را تحت تاثیر قرار می دهد. آنزیم های آنتی اکسیدان از جمله گروه های فعال شده توسط DDW در این راستا است. مکانیسم دیگر برای نقش احتمالی DDW در سیستم دفاعی، کاهش میزان استرس اکسیداتیو از طریق کاهش فعالیت مسیر گلیکولیز سلول سرطانی و در نتیجه تغییر شرایط پراکسیداتیو سلول به نفع شرایط آنتی اکسیداتیو است (33،2).
فاکتور دیگری که در سیستم آنتی اکسیدانی و پراکسیدانی مهم است، فاکتور MDA است. مالون دی آلدئید محصول پراکسیداسیون لیپید اسیدهای چرب غیر اشباع است و یکی از چند محصول عمده در سنتز ترومبوکسان A2 است، جایی که در آن سیکلواکسیژناز1یا سیکلواکسیژناز2 در سلول ها اسید آراشیدونیک را به پروستاگلاندین H2 متابولیزه می کند. این محصول نیز بیشتر متابولیزه می گردد تا اینکه توسط ترومبوکسان سنتاز به ترومبوکسان A2، هیدروکسی هپتادکاتری انوئیک اسید و مالون دی آلدئید تبدیل می گردد. علاوه بر این ممکن است به صورت غیر آنزیمی به مخلوطی از ایزومرهای 8-سیس و 8- ترانس 12- هیدروکسی ایکازوهپتاانوئیک اسید و مانونیل دی آلدئید تبدیل شود (22).
گونه های واکنش پذیر اکسیژن (ROS) لیپید های غیر اشباع را تجزیه می کنند و مانونیل دی آلدئید را تشکیل می دهند. این ترکیب یک آلدهید از گونه های الکتروفیل واکنشی است که باعث ایجاد استرس سمی در سلول ها می شود و به عنوان بیومارکر برای اندازه گیری سطح استرس اکسیداتیو در سلول مورد استفاده قرار می گیرد (24،7،5).
در مورد مکانیزم اثر MDA گزارش شده که مالون دی آلدئید با دزوکسی آدنوزین و دزوکسی گوآنوین در DNA واکنش می دهد و قطعه های DNA را تشکیل می دهد که M1G اولیه یکی از آن ها بوده و موتاژن است (19،9،5). در انسان آلدئید دهیدروژناز قادر به اکسیداسیون مالون دی آلدئید است. مشاهده گردیده است که DDW بخصوص در غلظت های پایین میزان MDA را کاهش می دهد (19،9). دلیل این کار زیاد مشخص نیست ولی احتمال داده می شود که بنا بر دلایلی همچون تغییر پتانسیل غشاء سلولی توسط تغییر نسبت دوتریم و هیدروژن و کاهش میزان دوتریم، بسته شدن یا کوتاه شدن مسیرهای چرخه سلولی از جمله فازS و G1/M و مهار شرایط استرس سلولی توسط کاهش میزان دوتریم درDDW عواملی باشند که باعث مهار سنتز آنزیم های اشاره شده در مسیر سنتز مالون دی آلدئید می گردند (23،2).
در پژوهش حاضر نیز فاکتورهای موثر در سیستم آنتی اکسیدانی در سطح سلول مورد بررسی قرار گرفت و مشاهده شد که با کاهش غلظت دوتریم در DDW فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدان سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز روند افزایشی پیدا می کند و بنابراین میتوان چنین استنباط کرد که کاهش رشد سلولی و افزایش فعالیت آنزیمهای سیستم آنتی اکسیدانی با هم ارتباط معنی داری داشته و در نهایت به صورت هماهنگ مهار رشد سلولهای سرطانی را القا میکنند. از طرف دیگر مشاهده گردید که با افزایش غلظت DDW، سطح مالون دی آلدهید (فاکتور شرایط پراکسیداتیو) نیز افزایش می یابد. نتایج این پژوهش نشان داد که DDW بر عکس آب شهری (DDW150ppm) در القاء سیستم آنتی اکسیدانی و مهار شرایط پراکسیداتیو نقش مهمی را ایفا می کند.
نتیجه گیری:
مطالعه های ما نشان داد که آب تهی شده از دوتریم در غلظت های پایین دوتریم به ویژه در غلظت های زیر 125ppm به صورت سینرژیک با داروی شیمی درمانی 5-FU ، باعث کاهش رشد سلول های سرطانی سینه و القاء سیستم آنتی اکسیدانی سلول می گردد.
منابع
1. Abei H. Catalase in vitro. Methods enzymol, 1984; 105:121-6.
2. Chen KS, Katz J. Zonation of glycogen and glucose syntheses, but not glycolysis, in rat liver. Biochem J, 1988; 255: 99-104.
3. Cong FS, Zhang YR, Sheng HC, Ao ZH, Zhang SY, Wang JY. Deuterium-depleted water inhibits human lung carcinoma cell growth by apoptosis. Exp Ther Med, 2010; 2(1) 227-83.
4.Criss RE. Principles of stable isotope distribution. 1st ed. (NY): Oxford University Press; 1999.
5. Del Rio D, Stewart AJ, Pellegrini N. A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress. Nutr Metab Card Dis, 2005; 15 (4): 316–28.
6. Duffy MG. CA15-3 and related mucins as circulating markers in breast cancer. Ann Clin Biochem, 1999; 5:579 - 586.
7. Farmer EE, Davoine C .Reactive electrophile species. Curr Opin Plant Biol, 2007; 10 (4): 380–6.
8. Harris AL. Hypoxia-a key regulatory factor in tumour growth. Nat Rev Cancer, 2002; 2(1):38-47.
9. Hartman PE, Putative mutagens and carcinogens in foods. IV. Malonaldehyde (malondialdehyde). Environ Mutagen, 1983; 5(4):603-7.
10. Heidelberger C, Chaudhuri NK, Danneberg P, Mooren D, Griesbach L, Duschinsky R, Schnitzer RJ, Pleven E, Scheiner J. Fluorinated pyrimidines, a new class of tumour-inhibitory compounds. Nature, 1957; 179(4561):663-6.
11. Howell A, Sims AH, Ong KR, Harvie MN, Evans DGR, Clarke RB. Mechanisms of disease: prediction and prevention of breast cancer-cellular and molecular interactions. Nat Rev Clin Oncol, 2005; 2(12):635-46.
12. Kabel AM. Tumor markers of breast cancer: New prospective. J Oncol Sci, 2017; 3(1):5-11.
13. Katz JJ, Crespi HL. Isotope effects in biological system. New York (NY): Van Nostrand Reinhold; 1970.14. Katz JJ, Crespi HL, Czajka DM, Finkel AJ. Course of deuteriation and some physiological effects of deuterium in mice. Am J Physiol, 1962; 203(5):907-13.
15. Kim JY, Van Cott EM, Lewandrowski KB. The use of decision analysis tools for the selection of clinical laboratory tests: Developing diagnostic and forecasting models using laboratory evidence. Arch Pathol Lab Med, 2011: 305-322.
16. Kirshenbaum I. Physical properties and analysis of heavy water. London (NY): McGraw-Hill; 1979.
17. Krempels K, Somlyai I, Somlyai G. A retrospective evaluation of the effects of deuterium depleted water consumption on 4 patients with brain metastases from lung cancer. Integer Cancer Ther, 2008; 7(3):172-81.
18. Longley DB, Harkin DP, Johnston PG. 5-Fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer, 2003; 3(5):330-8.
19. Marnett LJ .Lipid peroxidation-DNA damage by malondialdehyde. Mutat Res, 1999; 424 (1–2): 83–95.
20. McCord JM, Fridovich I. Superoxide dismutase an enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein). J Biol Chem, 1969; 244(22):6049-55.
21. Murry RK, Ganner DK, Maybs PA, Rodwel VW. Harper’s Illustrated Biochemistry. 28th ed. New Delhi( India): McGraw-Hill;2009.
22. Nair V, O'Neil CL, Wang PG. Malondialdehyde. In: Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis. Nair V, ONeil CL, Wang PG. Ltd. New York: John Wiley & Sons; 2008.
23. Olariu L, Petcu M, Tulcan C, Chis-Buiga I, Pup M, Florin M, et al. Deuterium depleted water-Antioxidant or Prooxidant. Lucr St Med Vet Timisoara, 2007:265-9.
24. Pryor WA, Stanley JP .Letter: A suggested mechanism for the production of malondialdehyde during the autoxidation of polyunsaturated fatty acids. Nonenzymatic production of prostaglandin endoperoxides during autoxidation. J Org Chem , 1975; 40 (24): 3615–7.
25. Soleyman-Jahi S, Zendehdel K, Akbarzadeh K, Haddadi M, Amanpour S, Muhammadnejad S. In vitro assessment of antineoplastic effects of deuterium depleted water. Asian Pac J Cancer Prev, 2014; 15:2179-83.
26. Somlyai G, Jancso G, Jakli G, Vass K, Barna B, Lakics V, et al. Naturally occurring deuterium is essential for the normal growth rate of cells. FEBS Lett, 1993; 317(1):1-4.
27. Somlyai G, Molnar M, Laskay G, Szabo M, Berkenyi T, Guller I, et al. Biological significance of naturally occurring deuterium: the antitumor effect of deuterium depletion. Orv Hetil, 2010; 151(36):1455-60.
28. Spitz DR, Sim JE, Ridnour LA, Galoforo SS, Lee YJ. Glucose Deprivation Induced Oxidative Stress in Human Tumor Cells: A Fundamental Defect in Metabolism?. Ann N Y Acad Sci. 2000; 899(1):349-62.
29.Twentyman P, Luscombe M. A study of some variables in a tetrazolium dye (MTT) based assay for cell growth and chemosensitivity. Br J Cancer, 1987; 56(3):279.
30. Varangot M, Barrios E, Sonora C, Aizen B, Pressa C, Estrugo R, et al. Clinical evaluation of a panel of mRNA markers in the detection of disseminated tumor cells in patients with operable breast cancer. Oncol Rep, 2005; 14(2):537-46.
31. Valko M, Rhodes C, Moncol J, Izakovic M, Mazur M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chem Biol Interact, 2006; 160(1):1-40.
32. Wang H, Zhu B, He Z, Fu H, Dai Z, Huang G, et al. Deuterium-depleted water (DDW) inhibits the proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma cells in vitro. Biomed Pharmacother, 2013; 67(6):489-96.
33. Xu Y, Xin Y, Diao Y, Lu C, Fu J, Luo L, et al. Synergistic effects of apigenin and paclitaxel on apoptosis of cancer cells. PloS one, 2011; 6(12):e29169.
34. Yavari K, GholamaliM, Yazdian F. Decreasing of Deuterium Concentration of Water: A Possible Tool in Diabetes Therapy. Electron J Boil, 2017; 13(4): 314-319.
The effect of deuterium depleted water on cell growth and antioxidant systems of breast cancer cells
Kamal yavari
Aim and Background:
Recent studies show that the depletion of naturally occurring deuterium can result in tumor regression in both in vitro and in vivo models. The purpose of this study was to investigate the effect of deuterium depleted water (DDW) discretely and in combination with 5-FU on cell growth and anti-oxidant system of breast cancer cells.
Mateial and Methods:
The cellular cytotoxicity test was performed using MTT assay. The MCF-7 cells were treated with decreasing deuterium concentrations of DDW alone, 5-FU alone and both. The malondialdehyde (MDA) level and the catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) enzyme activities were identified spectrophometrically. One way analysis of variance (ANOVA) and t- test were used for statistical analysis. P ≤ 0.05 was considered significant.
Results: Treatment the cells with different concentrations of DDW alone especially in concentrations of 100 and 125ppm imposed growth inhibitory effect on MCF-7 cells. Also, 5-FU alone significantly decreased the survival fractions of MCF-7 cells and DDW in combination with 5-FU augmented 5-FU inhibitory effects on the cells. Compared to the control group (150 ppm), it was observed that in the cells treated with Lower concentrations of DDW, the activities of catalase and superoxide dismutase enzymes increased, but the level of malonyldialdehyde decreased.
Conclusion: Deuterium depleted water can be considered as an adjuvant in anticancer drugs.
Key Words: Deuterium Depleted Water, Breast Cancer, Anti-Oxidants Enzymes, Cell Growth Inhibition, MTT
Type of Study: Research Article |
Subject:
Cellular and molecular
Received: 2018/12/17 | Accepted: 2018/12/17 | Published: 2018/12/17
Received: 2018/12/17 | Accepted: 2018/12/17 | Published: 2018/12/17
Send email to the article author
| Rights and permissions | |
 |
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License. |
