هلیکوباکترپیلوری یک باکتری گرم منفی، میکروآئروفیل (Microaerophile) و کند رشد است که اصولا مارپیچی شکل است و می­­ تواند به­صورت کروی هم تغییر شکل یابد. این باکتری دارای فلاژل یا تاژک است و حالت باکتریمی (bacteraemia) ندارد، یعنی قادر به ­ورود به سیستم گردش خون انسان نیست. هلیکوباکترپیلوری دارای مشخصات نیایی به­صورت، شاخه پروتئوباکتریا، رده اپسیلون پروتئوباکتریا، راسته کامپیلوباکتریا و خانواده هلیکوباکتر است (7-9). این باکتری به­دلیل ویژگی­های خاص از جمله تولید آنزیم اوره­آز قادر به زیستن در بافت پوششی معده انسان است، چرا که با آنزیم اوره­آز خود، اوره را به آمونیاک و دی اکسید­کربن هیدرولیز می­کند. آمونیاک از طرفی با خنثی کردن اسید معده زمینه رشد و بقاء باکتری را فراهم می­کند و از طرف دیگر با تخریب مخاط معده موجبات التهاب و زخم معده را فراهم سازد (10). در تحقیقات انجام شده ارتباط بین آلودگی با هلیکوباکترپیلوری و بیماری خود ایمنی تیروئید در جمعیت آسیایی و به­خصوص کره ای­ها به اثبات رسیده است که این ارتباط بیش­تر در سنین بالای 16 سال دیده می­شود (13-11). از طرفی هلیکوباکترپیلوری علاوه­ بر التهاب مزمن و زخم معده و اثنی­عشر، در مواردی منجربه سرطان بافت موکوزی معده به­همراه لنفومای آن می­شود (14). ژن tagD در هلیکوباکترپیلوری یک آنزیم به نام تیول پراکسیداز را رمز­گذاری می­کند که دارای 166 اسیدآمینه است. تیول پراکسیداز یکی از ادهسین­های مهم هلیکوباکترپیلوری است و در تجمع این باکتری در مخاط معده انسان نقش اساسی دارد. این ژن نقش مؤثر و فعالی را در زنده ماندن هلیکوباکترپیلوری در شرایط استرس اکسیداتیو معده بازی می­کند. تیول پراکسیداز یکی از اعضای خانواده  پروتئین­های پراکسی­ریدوکسین بوده و از فراوان­ترین آنزیم­های آنتی­اکسیدانی در باکتری­ها محسوب می­شود. (17-15).

ژن GPR83 (G protein–coupled receptor) یا گیرنده­های جفت شونده با پروتئین G گروه بزرگی از گیرنده­های پروتئینی هستند که در سطح خارجی غشای سلول­ها قرار دارند و پس از اتصال با لیگاند خود (مانند آدنوزین، اپیوم یا آدرنالین) تغییر شکل داده و فعال می­شوند. ژن GPR83 در انسان در موقعیت 11q21 قرار گرفته و از 11 اگزون تشکیل شده است (18). در حضور هلیکوباکتر پیلوری، سلول ‌های اپی­تلیوم معده تغییر رفتار نشان می­دهند و در بیان تعداد زیادی از ژن‌های خود، افزایش یا کاهش بیان نشان می­دهند. به­طور مثل وقتی محققان سلول­های رده سرطان معده AGS را با هلیکوباکترپیلوری آلوده نمودند، متوجه شدند که ژن­های CA1، GPR83، VPR2، TNF، IL1B و IL8 افزایش بیان دارند و از طرف دیگر ژن­‌های WTAP، AWP1، DDB2، M17S2 و ARF3 کاهش بیان دارند (19).

با توجه­به این که بیان ژن­ GPR83 در سرطان از اهمیت بالایی برخوردار هستند در این پژوهش به بررسی بیان ژن­ ذکر شده در سلول­های رده سرطان معده AGS ترانسفکت شده با وکتور نوترکیب pFLAG-CMV-3-tagD پرداخته شد.

روش کار

مدت زمان اجرا، رده سلولی AGS و کشت

تحقیق حاضر در مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد انجام شد. مدت زمان اجرای تحقیق از دی ماه 1397 تا خرداد ماه 1398 به­طول انجامید. در این تحقیق از سلول­های سرطانی معده رده AGS استفاده شد (20) که از مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی دانشگاه آزاد واحد شهرکرد تهیه شد.

در مرحله اول محیط کشت پایه RPMI 1640 به محیط کشت کامل تبدیل شد که به این منظور، 10 درصـد سـرم جنین گوسـاله (FBS)، پنـی­سـیلین 100 میکروگرم بـر میلـی­لیتـر و استرپتومایسین 100 میکروگرم (Pen-strep) بر میلی­لیتر به محیط پایه اضافه شد. سپس برای انجام شمارش سلولی، 10 میکرولیتر از محیط کشت حاوی سلول و 10 میکرولیتر از رنگ تریپان بلو مخلوط شد و روی لام نئوبار قرار گرفت و توسط لامل سنگین لامل­گذاری شد. لام زیر میکروسکوپ و با عدسی 10× مشاهده شد. تعداد سلول­ها در چهار مربع بزرگ واقع در چهار گوشه صفحه مدرج شمارش و میانگین گرفته شد. بعد از مرحله رشد نمودن سلول­ها و پوشاندن 80 تا 90 درصد کف فلاسک، اقدام به برداشت سلول­ها به منظور فریز شد.

تکثیر پلاسمید­  pFLAG-CMV-3-tagD

در پژوهش حاضر برای بررسی میزان بیان ژن GPR83  سلول های AGS ترانسفکت شده با وکتور نوترکیب pFLAG-CMV-3-tagD از پلاسمید pFLAG-CMV-3-tagD استفاده شد (15). پلاسمید نوترکیب pFLAG-CMV-3 حامل ژن tagD باکتری هلیکوباکترپیلوری و هم­چنین پلاسمید  pFLAG-CMV-3 بدون ژن خارجی است که همان­طور که اشاره شد از مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد تهیه شد. تکثیر پلاسمید با انتقال آن به میزبان باکتریایی که به­طور عمده شامل سویه­های مناسب از باکتری اشریشیاکلی است، انجام شد. لازم­به ذکر است که جهت انجام ترانسفورماسیون باکتری E.coli با پلاسمید، در سلول مستعد ساخته شد و پس از رشد کلنی­های باکتریایی، تعداد 10 عدد از آن­ها به­صورت کامل تصادفی انتخاب شده و روی پلیت حاوی آنتی­ بیوتیک به­صورت ماتریکس کشت داده شدند. پلیت ماتریکس به­منظور رشد باکتری­ها به­مدت 18 ساعت در 37 درجه سانتی­گراد قرار گرفت و سپس استخراج پلاسمید با استفاده از کیت استخراج پلاسمید (Favorgene ساخت کشور تایوان) انجام شد. در مرحله نهایی برای تأیید صحت پلاسمید استخراج شده و بررسی حضور ژن کلون شده (tagD) در آن از تکنیک PCR استفاده شد. از سوی دیگر پرایمرهای اختصاصی مورد استفاده در این تحقیق (سیناکلون ساخت شرکت دانش بنیان) برای ژن tagD در این مرحله برای پرایمرForward ،5ˈ- GTTTTCAGGTTGTTAGCACGCTTC -3ˈ و برای پرایمر Reverse، 5ˈ-CCAACAGCACACCGTAATTTTCC -3ˈ بود که سایز باند آن bp 537 بود. لازم­به ذکر است که بعد از انجام تکنیک PCR (Biorad ساخت کشور آلمان) تأیید پلاسمید نوترکیب به­روش هضم آنزیمی صورت گرفت. برای تأیید حضور ژن tagD در پلاسمید pFLAG-CMV-3، از هضم آنزیمی دوگانه استفاده شد و آنزیم محدودالاثر BglII و EcoRV مورد استفاده قرار گرفت.

روش انتقال پلاسمید به سلول

در پژوهش حاضر برای انتقال پلاسمید به سلول، سلول­های AGS درون فلاسک T25 کشت داده شدند و زمانی­که سلول­ها به تراکم 70% رسیدند از آن­ها رسوب سلولی تهیه شد. هم­چنین سوسپانسیون­ سلولی در 1 میلی لیتر از محیط کشت تهیه شد. 10 میکرولیتر از سوسپانسیون همراه با 10 میکرولیتر رنگ تریپان­بلو روی لام نئوبار قرار گرفت و لامل­گذاری شمارش شد. سپس تعداد سلول­ها در 1 میلی­لیتر محیط کشت محاسبه شد و از سلول­های گروه­های تیمار و شاهد رسوب­گیری صورت گرفت.

تشخیص آپوپتوز

در تحقیق حاضر برای تعیین درصد سلول­های آپوپتوز شده از کیت انکسین V (زیست­فرآورد ساخت کشور آلمان) برای تجزیه و تحلیل سریع مراحل مختلف آپوپتوز استفاده شد. انکسین V به فسفاتیدیل سرین (PS) متصل می شود که در قسمت داخلی غشای سیتوپلاسمی در سلول­های سالم قرار دارد. اما پس از شروع آپوپتوز،PS  به­سرعت در قسمت بیرونی غشای سیتوپلاسمی جابه­جا می­شود که تصور می­شود در تشخیص ماکروفاژ نقش مهمی را ایفا می­کند، بنابراین سلول­های آپوپتوز را می­توان به­سرعت فاگوسیتوز کرد. اتصال انکسین V به PS وابسته­به Ca₂ است و یک بافر واکنش حاوی Ca₂  خاص در طول فرآیند اتصال مورد نیاز است. کیت تشخیص آپوپتوزMabTag  شامل propidium  یدید است که باعث شناسایی سلول­ها از یکدیگر می­شود. لازم­به ذکر است که برای استخراج RNA از محلول RNX-Plus (شرکت سیناکلون) استفاده شد و روش DNase treatment و سنتز cDNA با استفاده از کیت (یکتا تجهیز آزما) صورت گرفت. هم­چنین برای اثبات درستی cDNA سنتز شده ابتدا PCR با پرایمرهای ژن GAPDH انجام شد. از طرفی جهت تعیین دمای دقیق Anneling پرایمرها ابتدا PCR با پرایمرهای مناسب انجام گرفت که توالی پرایمرهای مورد استفاده در این تحقیق در جدول 1 آمده است. در نهایت محصول­های PCR روی ژل آگارز 1% الکتروفورز شدند. سپس با نور UV مشاهده و تصویر تهیه شد.

تکنیک Real time RT-PCR

برای بررسی میزان تغییر بیان در ژن موردنظر در سلول­های رده سلولی AGS در دو سلول ترانسفکت شده و کنترل، از جفت پرایمرهای رفت و برگشت طراحی شده برای انجام Real Time PCR (Corbett ساخت کشور استرالیا) استفاده

جدول 1- اطلاعات و مشخصات پرایمرها

شد (21). لازم­به ذکر است که برای بررسی میزان تغییر بیان، ژن خانه­دار GAPDH به­عنوان ژن رفرنس استفاده شد. مواد به­نسبت­های 4/0 میکرولیتر پرایمر رفت و برگشت، cDNA ng/µL))25) 2 میکرولیتر،SYBR Green master mix (2X) 5/7 میکرولیتر و ddH2O 7/4 مخلوط گردید و سپس درون دستگاه قرار داده شد. برنامه دمایی و زمانی تأیید شده در این مرحله به این صورت بود که برای Primary Denaturasion 3 دقیقه و دمای 95 درجه سانتی­گراد، Denaturation20  ثانیه و دمای 95 درجه سانتی­گراد، Annealing 25 ثانیه و 64 درجه سانتی­گراد و Extension 20 ثانیه و دمای 72 درجه سانتی­گراد در نظر گرفته شد و تعداد چرخه­های این تکنیک 45 در نظر گرفته شد.

روش تجزیه و تحلیل داده­ها

با استفاده از نرم افزار  SPSSورژن 22 و آزمون­های آماری t-test Indepent  بیان ژن مورد نظر بررسی و مقایسه شد که اگر05/0 p-Value ≤ باشد، تفاوت داده­ها از لحاظ آماری معنی­دار محسوب می­گردد.

نتایج

تأیید صحت پلاسمیدها به­ روش PCR و هضم آنزیمی

با انجام PCR به­وسیله پرایمرهای اختصاصی ژن TagD، باند 537 جفت بازی مربوط به این ژن روی ژل آگارز دیده شد. نتیجه این آزمایش در شکل 1 دیده می­شود.

شکل 1 نتایج PCR بر روی پلاسمید استخراج شده که حضور باند 537 جفت بازی مربوط به ژن tagD صحت استخراج پلاسمید را تأیید کرد. چاهک شماره 4 مارکر 100 جفت بازی و چاهک شماره 1 کنترل منفی است.

در این تحقیق انجام برش آنزیمی با دو آنزیم BglII و EcoRV روی پلاسمید نوترکیب pFLAG-CMV-3-tagD سبب تشکیل دو باند 6331 جفت بازی مربوط به پلاسمید و باند 537 جفت بازی مربوط به ژن tagD شد که در شکل 2 نشان داده شده است.

شکل 2-  هضم آنزمی وکتور حاوی ژن tagD.  قطعه نگین 6331 جفت بازی مربوط به وکتور و قطعه 537جفت بازی مربوط به ژن tagD است که چاهک سه مارکر است و دو چاهک دیگر سایز باند مورد نظر را نشان می­دهند.

نتایج بررسی آپوپتوز با استفاده از کیت انکسین

همان­طور که اشاره شد در طی فرآیند آپوپتوز فسفاتیدیل سرین از سطح داخلی به سطح خارجی غشا منتقل می­شود که آنکسین V به فسفاتیدیل سرین موجود در سطح خارج سلولی متصل شده و توسط دستگاه فلوسایتومتری تشخیص داده می­شود.  PI نیز به DNA قطعه قطعه شده هسته سلول­های مرده متصل شده و قابل تشخیص توسط دستگاه فلوسایتومتری است. نتایج حاصل از آن در شکل­های 3 و 4 نشان داده شده است.  در شکل­ 3 درصد سلول­های زنده مشاهده می­شود و در ناحیه Q3 95 درصد بیش­تر از سایر گروه­ها است. در شکل 4 درصد سلول­های آپاپتوز شده جوان در ناحیه Q4 یعنی سلول­هایی که در مراحل اولیه آپاپتوز به 68/61 درصد رسیده است. به­علاوه درصد سلول­های آپاپتوز شده دیررس یا نکروزی در ناحیه Q2 16/12 درصد بود.

شکل 3- نتایج بررسی آپوپتوز به روش فلوسایتومتری در گروه کنترل

شکل 4- نتایج بررسی آپوپتوز به روش فلوسایتومتری در گروه تیمار

بررسی آماری

نتایج آنالیز آماری مربوط به ژن GPR83 به­وسیله نرم­افزار SPSS انجام شد. برای انجام این آنالیز، Ct هر نمونه یا به­عبارتی نمونه ژن موردنظر و نمونه ژن کنترل داخلی، به­صورت جداگانه برای انجام آنالیز و به­دست آوردن تغییر بیان یادداشت گردید که نتایج حاصل از آن در شکل 7 آورده شده است. در این آنالیز تغییر بیان ژن GPR83 نسبت­به گروه PFLAG-CMV-3 و AGS افزایش داشت که این افزایش از نظر آماری معنا دار نبود.

شکل 7- آنالیز آماری بیان ژن GPR83 . بیان ژن GPR83 در گروه مورد آزمایش (دریافت کننده ژن tagD) نسبت­به گروه کنترل افزای

بحث

هلیکوباکترپیلوری یک باکتری باسیلی شکل کوچک گرم منفی با تحرک بسیار زیاد است که در لایه مخاطی معده انسان، عفونت ایجاد می­نماید. عفونت این باکتری می­تواند در کودکی ایجاد شود اما میزان شیوع آن با افزایش سن رابطه مستقیم دارد و بیش­تر موارد آن بدون علامت است لیکن در صورت ادامه روند عفونت، 10 تا 15 درصد افراد دچار زخم معده یا سرطان معده خواهند شد (22،23). در حضور هلیکوباکترپیلوری سلول­های اپی­تلیوم معده تغییر رفتار نشان می­دهند و در بیان تعداد زیادی از ژن­های خود، افزایش یا کاهش بیان نشان می­دهند که در این راستا مطالعه­هایی صورت گرفته است به­عنوان مثال در سال 2017، گروهی از محققان به سرپرستی Safarpour مطالعه­هایی را روی ژن tagD هلیکوباکترپیلوری انجام دادند. این محققان ژن tagD هلیکوباکترپیلوری را که به­طول 537 جفت باز است را با روش واکنش PCR تکثیر نموده و محصول­های PCR را در وکتور بیان شونده یوکاریوتی PFLAG-CMV-3 کلون نمودند. سپس وکتور نوترکیب حامل ژن tagD به رده سلول­های CHO منتقل گردید و بیان آن با روش­های RT-PCR و SDS-PAGE بررسی شد و نتایج نشان داد که بیان این ژن موفقیت آمیز بود (15). نتایج حاصل از تحقیق حاضر نیز حاکی از آن بود که بیان ژن­ GPR83 در سلول­های تحت تیمار با ژن tagD هلیکوباکترپیلوری، تغییر می­یابد و با توجه­به نتایج ما، به­نظر می­رسد، ژن GPR83 هلیکوباکترپیلوری در ایجاد این تغییر بیان نقش داشته­باشد.

در سال 2007، Kim و همکاران نشان دادند که در اثر کشت سلول­های رده سرطان معده AGS و سپس افزودن هلیکوباکتر زنده به محیط کشت این گونه سلول­ها، بیان تعداد زیادی از ژن­ها در سلول­های سرطانی تحت تأثیر قرار می­گیرد. به­طوری­که در ژن­هایCA1 ، GPR83، VPR2، TNF، IL1B و IL8 افزایش بیان و در ژن­های WTAP، AWP1، DDB2، M17S2 و ARF3 کاهش بیان دیده می­شود (19). نتایج این بررسی حاضر نیز حاکی از آن بود که در حضور هلیکوباکترپیلوری، سلول­های اپی­تلیوم معده تغییر رفتار نشان می­دهند و در بیان تعداد زیادی از ژن­های خود، افزایش یا کاهش بیان نشان می­دهند. در سال 2007 Majidi و گروهی از محققانش در مورد ارتباط هلیکوباکترپیلوری با پیدایش سرطان سلول سنگفرشی حنجره و هیپوفارکس تحقیق کردند. نتایج تحقیقات آن­ها نشان داد که در افراد مبتلا به سرطان نسبت­به افراد سالم (گروه شاهد)، عفونت هلیکوباکتر شیوع بالاتری دارد (24). در تحقیق حاضر مشاهده شد در حضور هلیکوباکترپیلوری، سلول­های اپی­تلیوم معده تغییر رفتار نشان می­دهند و در بیان تعداد زیادی از ژن­های خود، افزایش یا کاهش بیان نشان می­دهند. در سال 2008 گروهی از محققان به سرپرستی Matsuda تأثیر هلیکوباکترپیلوری بر بیان ژن­های متعددی از سلول­های سرطانی دستگاه گوارش را در سطح mRNA بررسی نمودند که نتایج نشان داد در سلول­های MKN45 بیان ژن­های MUC2، MUC5AC و MUC6 افزایش یافت اما بیان ژن CDX2 مهار شد (25). نتایج این بررسی حاکی از آن بود که در حضور هلیکوباکترپیلوری، سلول­های اپی­تلیوم معده تغییر رفتار نشان می­دهند و در بیان تعداد زیادی از ژن­های خود، افزایش یا کاهش بیان نشان می­دهند. مثلا وقتی محققان سلول­های رده سرطان معده AGS را با هلیکوباکترپیلوری آلوده نمودند، متوجه شدند که ژن­های CA1، GPR83، VPR2، TNF، IL1B و IL8 افزایش بیان دارند و از طرف دیگر ژن­های WTAP، AWP1، DDB2، M17S2 و ARF3 کاهش بیان دارند.

نتیجه­گیری

در حضور هلیکوباکترپیلوری، سلول ‌های اپی­تلیوم معده تغییر رفتار نشان می­دهند و در بیان تعداد زیادی از ژن­‌های خود، افزایش یا کاهش بیان نشان می­دهند به­عنوان مثال طی تحقیقی دانشمندان سلول­های رده سرطان معده AGS را با هلیکوباکترپیلوری آلوده نمودند، متوجه شدند که ژن­های CA1، GPR83، VPR2، TNF، IL1B و IL8 افزایش بیان دارند و از طرف دیگر ژن­‌های WTAP، AWP1، DDB2، M17S2 و ARF3 کاهش بیان دارند. به­طور کلی، نتایج حاصل از تحقیق حاضر نشان داد که بیان ژن­ GPR83 در سلول­های تحت تیمار با ژن tagD هلیکوباکترپیلوری، تغییر می­یابد و با توجه­به نتایج ما، به­نظر می­رسد، ژن GPR83 هلیکوباکترپیلوری در ایجاد این تغییر بیان نقش داشته­باشد.

سپاسگزاری

تحقیق حاضر برگرفته از پایان نامه کارشناسی ارشد و تحت حمایت معاونت پژوهشی دانشگاه آزاد واحد شهرکرد است و بدین­وسیله از تمام افرادی که در این پژوهش یاری رساندند کمال تشکر و قدردانی را دارد.