طراحی و ساخت سازه شبیه­ساز جهت تشخیص

 باکتری بورخولدریا مالئی و سودومالئی

محمدجواد دهقان عصمت آبادی^1*،محمود براتی²، محمدعلی یعقوبی مقدم¹

1- مجتمع دانشگاهی شیمی و مهندسی شیمی، دانشگاه صنعتی مالک اشتر، تهران،ایران

2- گروه بیوتکنولوژی پزشکی، دانشکده پیراپزشکی، دانشگاه علوم پزشکی ایران، تهران، ایران

چکیده

سابقه و هدف: باکتری­های بورخولدریا مالئی و سودومالئی (Burkholderia mallei and pseudomallei species) جزء عوامل بیماری­زای خطرناک انسانی محسوب می­شوند. تشخیص برپایه کشت برای این باکتری، هزینه­بر و زمان­بر و از طرف دیگر کار با این باکتری بسیار خطرناک بوده و هم­چنین امکان دسترسی به این باکتری و حتی ژنوم آن بسیار مشکل است. هدف از انجام این مطالعه طراحی و سنتز کنترل مثبتی ایمن و کارآمد برای تشخیص باکتری بورخولدریا است.

مواد و روش­ها: در ابتدا، یک سازه شبیه­ساز که، حاوی ژن­های مرجع و اختصاصی باکتری بورخولدریا مالئی و سودومالئی است و در دیگر گونه­های خانواده مشاهده نمی­شود ساخته شد و سپس کارایی عملیاتی سازه طراحی شده، با استفاده از روشPCR Real-Time کمی (با استفاده از رنگ SYBER Green) و کیفی (با استفاده از پروب TaqMan)، مورد ارزیابی قرار گرفت. درنهایت محصول­های تکثیری PCR Real-Time با استفاده از منحنی ذوب و الکتروفورز مورد بررسی قرار گرفتند.

یافته­ها: میزان حداقل و حداکثر حساسیت به­ترتیب 1/0پیکوگرم و 10 نانوگرم بر روی سازه طراحی شده در مطالعه حاضر، حاصل شد.

نتیجه­گیری: این سازه شبیه­ساز می­تواند به­عنوان کنترل مثبت مناسبی، جهت تشخیص عامل بورخولدریا مورد استفاده قرار گیرد و هم­چنین می­تواند در آینده باعث پیشرفت هرچه بیش­تر کیت­های تشخیصی جدید در این حوزه بشود.

واژه­های کلیدی: پاتوژن­ها، بورخولدریا، Real Time PCR، کلونینگ، SYBER Green

مقدمه

شکل1- تصویر شماتیک طراحی شده از سازه که نشان دهنده توالی برش برای آنزیم­های محدود کننده است.

جدول 1- فهرست پرایمرها و پروب­هایی که به­صورت مشترک بین هر 2 گونه طراحی شده است تا با یک جفت پرایمر و پروب بتوان هر 2 گونه را یکجا، شناسایی کرد.

2- انجام آزمون Real-Time PCR

2-1- استفاده از روش کیفی با استفاده از رنگ SYBR Green

با استفاده از Real-Time PCR کمی موارد زیر مورد بررسی قرار گرفت الف: بررسی این­که آیا این واکنش صورت می­پذیرد و یا خیر (که در صورت تکثیر قطعه موردنظر،به­طور قطع منحنی مربوط به آن در دستگاه Real-Time PCR قابل مشاهده است) و ب: این­که آیا پیک منحنی ذوب هر محصول تکثیری به­صورت منفرد است و یا خیر (که در صورت تکثیر اختصاصی قطعه موردنظر، تنها یک پیک مشاهده می­شود) و در نتیجه، بعد از این بررسی­ها می­توان صحت واکنش را تأیید کرد. انجام واکنش Real-Time PCR  در دستگاه Corbett  Rotorgen 6000 صورت گرفت. تهیه مخلوط با اضافه کردن 5 میکرولیتر SYBR Green، 5/0 میکرولیتر مخلوط پرایمر پیشرو و پیرو (pM 5)، مقدار متغیر (به­صورت سریالی از غلظت­های 100 و 10 و 1 نانوگرم بر میکرولیتر و 100 و 10 و 1 پیکوگرم بر میکرولیتر و 100 و 10 و 1 فمتوگرم بر میکرولیتر) پلاسمید pUC57، تا حجم10 میکرولیتر آب تزریقی به ازای هر نمونه در یک میکروتیوب استریل است. پس از اضافه نمودن میکس مربوط به چاهک­-های استریپ، رقت­های مختلف پلاسمید pUC57 اضافه گردید و استریپ­ها با کپ مخصوص پوشانده شد. سپس با سرعت 1000 دور بر دقیقه دستگاه، سانتریوفیوژ شد و درون دستگاهCorbett Rotorgen 6000 قرار داده شد. سپس برای PCR برنامه Predenaturation: 15 دقیقه، در دمای 95 درجه سانتی­گراد به تعداد یک سیکل، Denaturation: 5 ثانیه، در دمای 95 درجه سانتی­گراد به تعداد 40 سیکل، Annealing: 25 ثانیه، در دمای 62 درجه سانتی­گراد به تعداد 40 سیکل، Extension: 30 ثانیه، در دمای 72 درجه سانتی­گراد به تعداد 40 سیکل طراحی شد. کنترل مثبت واکنش خود سازه طراحی شده و کنترل منفی فاقد سازه بوده است.

2-2- استفاده از روش کیفی با استفاده از پروب TaqMan

با استفاده از Real-Time PCR کیفی موارد زیر مورد بررسی قرار گرفت. الف: بررسی این­که آیا این واکنش صورت می­پذیرد و یا خیر (که در صورت تکثیر قطعه موردنظر، به­طور قطع منحنی مربوط به آن در دستگاه Real-Time PCR قابل مشاهده است). ب: این­که آیا باند تکثیری با طول مشخص مربوط به آن عامل بر روی ژل مشاهده می­شود یا خیر. در نتیجه بعد از این بررسی­ها می­توان صحت واکنش را تأیید کرد. انجام واکنش Real-Time PCR در دستگاه Corbett Rotorgen 6000 صورت گرفت. تهیه مخلوط با اضافه کردن 5 میکرولیتر مستر میکس TaqMan، 5/0میکرولیتر مخلوط پرایمر پیشرو و پیرو (pM 5)، 5/0 میکرولیتر پروب، مقدار متغیر (به­صورت سریالی از غلظت­های 100 و 10 و 1 نانوگرم بر میکرولیتر و 100 و 10 و 1 پیکوگرم بر میکرولیتر و 100 و 10 و 1 فمتوگرم بر میکرولیتر) پلاسمید pUC57، تا حجم10 میکرولیتر آب تزریقی به ازای هر نمونه در یک میکروتیوب استریل. پس از اضافه نمودن میکس مربوط به چاهک­های استریپ، رقت­های مختلف پلاسمید pUC57 اضافه گردید و استریپ­ها با کپ مخصوص پوشانده شد. سپس در 1000 دور بر دقیقه دستگاه، گریزانه شد و درون دستگاه Corbett Rotorgen 6000 قرار داده شد. سپس برای PCR برنامه Predenaturation: 10 دقیقه، در دمای 95 درجه سانتی­گراد به تعداد یک سیکل، denaturation: 5 ثانیه، در دمای 95 درجه سانتی­گراد به تعداد 40 سیکل، Annealing/Extension: 30 ثانیه، در دمای 62 درجه سانتی­گراد به تعداد 40 سیکل طراحی شد. در نهایت محصولات تکثیری بر روز ژل آگارز 1 درصد برده شده (که در صورت تکثیر اختصاصی قطعه موردنظر، تنها یک باند تکثیری بر روی ژل مشاهده می­شود) و تصاویر حاصل از آن­ها ذخیره شد. کنترل مثبت واکنش خود سازه طراحی شده و کنترل منفی فاقد سازه بوده است.

2-3-تحلیل آماری داده­ها

آنالیز آماری داده­های به­دست آمده در این مطالعه براساس حداقل سه بار تکرار استوار است که، با گرفتن میانگین و محاسبه انحراف معیار، میزان تغییرها محاسبه شد. برای آزمون مقایسه­ای بین میانگین گروه­ها روش نان پارامتریک wilcoxon مورد استفاده قرار گرفت.

3- نتایج

الف: آزمون Real-Time PCR با استفاده از رنگ SYBR Green در رقت­های مختلف 100 پیکوگرم، 10 پیکوگرم، 1 پیکوگرم و 1/0پیکوگرم از پلاسمید مذکور (با 2 تکرار)، صورت پذیرفت. منحنی­های تکثیر و سریال غلظتی حاصله، نشان دادند که، با افزایش نسبت رقت پلاسمید مربوطه، به همان نسبت، اعداد سیکل آستانه­ای (Ct) مشاهده شده نیز کاهش می­یابد. هم­چنین با مشاهده تک پیک بودن نتیجه حاصل از بررسی منحنی ذوب، تکثیر اختصاصی و انفرادی محصول مربوطه بر روی سازه اثبات گردید. تصاویر آزمون Real-Time PCR با استفاده از رنگ SYBR Green و منحنی سریال غلظتی و منحنی ذوب در شکل 3 آورده شده است.

شکل 3- روش Real-Time PCRبا استفاده از رنگ SYBR Green در عامل بورخولدریا، نتیجه Real-Time PCR با دستگاه  Corbett Rotorgen 6000 با استفاده از رنگ SYBR Green مربوط به واکنش پرایمر پیشرو و پیرو توالی بورخولدریا در غلطت و رقت­های مختلف 100 پیکوگرم، 10 پیکونانوگرم، 1 پیکوگرم و 1/0 پیکوگرم پلاسمید همراه نمودارstandard curve  و نمودار منحنی ذوب مربوطه نکته: هر واکنش به­صورت دوگانه انجام شده است و هم­چنین دارای نمونه کنترل منفی نیز است.

ب: آزمون Real-Time PCR با استفاده از پروب TaqMan در رقت­های مختلف 100 نانوگرم، 1 نانوگرم، 100 پیکوگرم، 10 پیکوگرم و 1 پیکو گرم از پلاسمید مذکور (با 2 تکرار)، صورت پذیرفت. منحنی­های  تکثیر و سریال غلظتی حاصله نشان دادند که، با افزایش نسبت رقت پلاسمید مربوطه، به­همان نسبت، اعداد سیکل آستانه­ای (Ct) مشاهده شده نیز کاهش می­یابد. هم­چنین با مشاهده تک باند بودن محصول حاصل از واکنش مربوطه بر روی ژل، تکثیر اختصاصی و انفرادی محصول مربوطه بر روی سازه اثبات گردید. تصاویر به­ترتیب روش Real-Time PCR TaqMan و منحنی سریال غلظتی و ژل مربوطه در شکل 4 و 5 آورده شده است.

شکل 4-  نتیجه Real-Time PCR با دستگاه  Corbett Rotorgen 6000 با استفاده از روش TaqMan مربوط به واکنش پرایمر پیشرو و پیرو و پروب توالی بورخولدریا در غلطت و رقت­های مختلف 100 نانوگرم، 1 نانوگرم، 100 پیکوگرم، 10 پیکوگرم و 1 پیکو گرم پلاسمید 1 همراه نمودارstandard curve نکته: هر واکنش به­صورت دوگانه انجام شده است و هم­چنین دارای نمونه کنترل منفی نیز است

شکل5. ژل الکتروفورز آگارز 5/1 درصد توالی بورخولدریا در سایز قطعه 197 جفت باز

1)NTC 2)10ng 3)1ng 4)100pg 5)10pg 6)1pg

       همان­طور که مشاهده می­شود تک باند در ناحیه 200 جفت بازی قابل مشاهده هستند. سایز قطعه 197 جفت باز است.

بحث

هدف از انجام این تحقیق، طراحی تولید سازه حامل مصنوعی جهت رسیدن به روشی جدید و مطمئن برای شناسایی سریع­تر و دقیق­تر عامل بورخولدریا و ایجاد کنترل مثبت مناسب و ایمن برای تشخیص این عامل بیماری­زای خطرناک است. به­دلیل این­که مطالعه­های مشابه­ای بر روی سازه­های این چنینی به­ندرت انجام شده است و بیش­تر مطالعه­ها بر روی خود باکتری هدف و یا ژنوم آن و نه سازه مصنوعی، صورت گرفته است در نتیجه، امکان مقایسه مشابه و برابر برای ما وجود ندارد. بر این اساس، تنها به ذکر حداقل و حداکثر حساسیت در مطالعه­های پیشین و مطالعه خودمان بسنده می­کنیم. حداقل و حداکثر حساسیت در مطالعه­های پیشین که بر روی خود باکتری بورخولدریا صورت گرفته است، به­ترتیب 1 پیکوگرم و 1 میکروگرم است (36-26). از سوی دیگر قابل ذکر است که، میزان حداقل و حداکثر حساسیت به­دست آمده در مطالعه حاضر، به­ترتیب 1/0 پیکوگرم و 10 نانوگرم بر روی سازه طراحی شده است که به­نظر می­رسد مقدار مطلوبی است. از مطالعه­های مشابه با پژوهش حاضر می­توان به مطالعه­ای در سال 2004، در کشور فرانسه با استفاده از روش PCR مشاهده پیوسته واکنش تک گانه (با استفاده از پروب) برای ارزیابی پلاسمید کنترل مثبت و عامل بیماری­زا و مطالعه آقای Erin P. Price و همکارانش در کشور آمریکا در سال 2012 اشاره کرد (3،36). در این مطالعه نیز مشابه تحقیق حاضر، فقط یک ناحیه خاصی حفاظت شده را که در تمامی جنس بورخولدریا وجود داشت، هدف قرار دادند؛ اما نکته مهم در نظر گفته شده در این پژوهش نسبت­به تحقیق حاضر این است که، به­منظور تفکیک گونه بورخولدریا مالئی از سایرین، حضور یک پلی­مورفیسم در یک ناحیه خاص که در گونه مالئی بسیار حائز اهمیت است را مدنظر قرار دادند و در نتیجه پروب­های مورد استفاده به­منظور تفکیک مالئی در همین ناحیه نسبت­ به سایر پروب های تشخیص دهنده سایر گونه­های بورخولدریا، متفاوت هستند. نتیجه بسیار قابل قبول و رضایت­بخش بود که نه تنها بورخولدریا مالئی را از سایر باکتری­ها تفکیک می­کند بلکه در خود جنس بورخولدریا نیز تمایز قائل شده و گونه مالئی را از سایرین تفکیک می­کند (36). نتیجه و روش­های استفاده شده در این پروژه، تا حدود زیادی مشابه به دو تحقیق اصلی ذکر شده است که، خود نشان دهنده عملکرد صحیح ما در این پروژه است. همان­طور که ذکر شد، تحقیقاتی زیادی در این زمینه و تولید این گونه سازه­های شبیه­ساز انجام نگرفته و امیدواریم این پژوهش، نوید بخش تحقیقات بیش­تر در زمینه تولید کیت­های تشخیصی این عامل و ایجاد روش­های جدید برای تشخیص باشد.

نتیجه­گیری

باتوجه­به نتایج حاصل شده در مطالعه و همین­طور بررسی مطالعه­های پیشین در بخش بحث می­تواند به این نتیجه رسید که، طراحی و ساخت سازه شبیه­ساز و استفاده از آن در کیت­های تشخیصی به­عنوان یک کنترل مثبت می­تواند، خطرناک ناشی از آلودگی به باکتری بیماری­زا، نبود ژنوم عامل بیماری­زا، حذف تجهیزات پیشرفته برای کار با عامل بیماری­زا و.... را سبب شده و به این ترتیب کمک شایانی به تحقیقات در این زمینه و همین­طور در تشخیص این عوامل بیماری­زا کند.

سپاسگزاری

بدین­وسیله از همکاری مؤثر کارکنان و دانشجویان پژوهشکده علوم و فناوری­های زیستی دانشگاه صنعتی مالک اشتر، بابت تمامی تلاش­ها و کمک­هایشان در حین انجام این پروژه، کمال تشکر و قدردانی می­گردد. این مطالعه با حمایت­های دانشگاه صنعتی مالک اشتر صورت پذیرفته است.

منابع

1. Brown TA. Gene cloning and DNA analysis: an introduction: John Wiley & Sons; 2016.

2. Kostylev M, Otwell AE, Richardson RE, Suzuki Y. Cloning Should Be Simple: Escherichia coli DH5alpha-Mediated Assembly of Multiple DNA Fragments with Short End Homologies. PloS one. 2015;10(9):e0137466. PubMed PMID: 26348330. Pubmed Central PMCID: 4562628.

3. Charrel RN, La Scola B, Raoult D. Multi-pathogens sequence containing plasmids as positive controls for universal detection of potential agents of bioterrorism. BMC Microbiol. 2004 May 17;4:21. PubMed PMID: 15147587. Pubmed Central PMCID: 425577.

4. Carrera M, Sagripanti JL. Non-infectious plasmid engineered to simulate multiple viral threat agents. J Virol Methods. 2009 Jul;159(1):29-33. PubMed PMID: 19442841.

5. Carrera M, Sagripanti JL. Artificial plasmid engineered to simulate multiple biological threat agents. Appl Microbiol Biotechnol. 2009 Jan;81(6):1129-39. PubMed PMID: 18923830.

6. Saxena A, Pal V, Tripathi NK, Goel AK. Development of a rapid and sensitive recombinase polymerase amplification-lateral flow assay for detection of Burkholderia mallei. Transboundary and emerging diseases. 2019 Mar;66(2):1016-22. PubMed PMID: 30650261.

7. Saxena A, Pal V, Tripathi NK, Goel AK. A real-time loop mediated isothermal amplification assay for molecular detection of Burkholderia mallei, the aetiological agent of a zoonotic and re-emerging disease glanders. Acta tropica. 2019 Jun;194:189-94. PubMed PMID: 30958991.

8. Shi L, Chen J, Yi G. Burkholderia pseudomallei was Identified in a Melioidosis Aneurysm using Polymerase Chain Reaction Targeting 23S rRNA. Annals of vascular surgery. 2020 Oct;68:569 e13- e20. PubMed PMID: 32339680.

9. Peng Y, Zheng X, Kan B, Li W, Zhang W, Jiang T, et al. Rapid detection of Burkholderia pseudomallei with a lateral flow recombinase polymerase amplification assay. PloS one. 2019;14(7):e0213416. PubMed PMID: 31283772. Pubmed Central PMCID: 6613700.

10. Estrada-de los Santos P, Vinuesa P, Martinez-Aguilar L, Hirsch AM, Caballero-Mellado J. Phylogenetic analysis of burkholderia species by multilocus sequence analysis. Current microbiology. 2013 Jul;67(1):51-60. PubMed PMID: 23404651.

11. Torres AG, Hall CM, Jaramillo S, Jimenez R, Stone NE, Centner H, et al. Burkholderia pseudomallei, the causative agent of melioidosis, is rare but ecologically established and widely dispersed in the environment in Puerto Rico. PLOS Neglected Tropical Diseases. 2019;13(9):e0007727.

12. Khakhum N, Chapartegui-Gonzalez I, Torres AG. Combating the great mimicker: latest progress in the development of Burkholderia pseudomallei vaccines. Expert review of vaccines. 2020 Jul;19(7):653-60. PubMed PMID: 32669008.

13. Saiprom N, Sangsri T, Tandhavanant S, Sengyee S, Phunpang R, Preechanukul A, et al. Genomic loss in environmental and isogenic morphotype isolates of Burkholderia pseudomallei is associated with intracellular survival and plaque-forming efficiency. PLoS Negl Trop Dis. 2020 Sep 29;14(9):e0008590. PubMed PMID: 32991584.

14. Whitlock GC, Estes DM, Torres AG. Glanders: off to the races with Burkholderia mallei. FEMS Microbiol Lett. 2007 Dec;277(2):115-22. PubMed PMID: 18031330.

15. Losada L, Ronning CM, DeShazer D, Woods D, Fedorova N, Kim HS, et al. Continuing evolution of Burkholderia mallei through genome reduction and large-scale rearrangements. Genome Biol Evol. 2010 Jan 22;2:102-16. PubMed PMID: 20333227. Pubmed Central PMCID: 2839346.

16. Bondi SK, Goldberg JB. Strategies toward vaccines againstBurkholderia malleiandBurkholderia pseudomallei. Expert review of vaccines. 2014;7(9):1357-65.

17. Moawad AA, Silge A, Bocklitz T, Fischer K, Rosch P, Roesler U, et al. A Machine Learning-Based Raman Spectroscopic Assay for the Identification of Burkholderia mallei and Related Species. Molecules. 2019 Dec 10;24 (24)). PubMed PMID: 31835527. Pubmed Central PMCID: 6943587.

18. Khakhum N, Tapia D, Torres AG. Burkholderia mallei and Glanders. In: Singh SK, Kuhn JH, editors. Defense Against Biological Attacks: Volume II. Cham: Springer International Publishing; 2019. p. 161-83.

19. Cheng AC, Currie BJ. Melioidosis: epidemiology, pathophysiology, and management. Clin Microbiol Rev. 2005 Apr;18(2):383-416. PubMed PMID: 15831829. Pubmed Central PMCID: 1082802.

20. Bauernfeind A, Roller C, Meyer D, Jungwirth R, Schneider I. Molecular Procedure for Rapid Detection ofBurkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei. Journal of clinical microbiology. 1998;36(9):2737-41.

21. Larson DT, Schully KL, Spall A, Lawler JV, Maves RC. Indirect Detection of Burkholderia pseudomallei Infection in a US Marine After Training in Australia. Open forum infectious diseases. 2020 May;7(5):ofaa103. PubMed PMID: 32391401. Pubmed Central PMCID: 7200084.

22. Chua KH, Tan EW, Chai HC, Puthucheary SD, Lee PC, Puah SM. Rapid identification of melioidosis agent by an insulated isothermal PCR on a field-deployable device. PeerJ. 2020;8:e9238. PubMed PMID: 32518734. Pubmed Central PMCID: 7261116.

23. Ulrich MP, Norwood DA, Christensen DR, Ulrich RL. Using real-time PCR to specifically detect Burkholderia mallei. J Med Microbiol. 2006 May;55(Pt 5):551-9. PubMed PMID: 16585642.

24. Logan J, Logan JM, Edwards KJ, Saunders NA. Real-time PCR: current technology and applications: Horizon Scientific Press; 2009.

25. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009 Apr;55(4):611-22. PubMed PMID: 19246619.

26. Hodgson K, Engler C, Govan B, Ketheesan N, Norton R. Comparison of routine bench and molecular diagnostic methods in identification of Burkholderia pseudomallei. Am Soc Microbiol; 2009. p. 1578-80.

27. Kaestli M, Mayo M, Harrington G, Watt F, Hill J, Gal D, et al. Sensitive and specific molecular detection of Burkholderia pseudomallei, the causative agent of melioidosis, in the soil of tropical northern Australia. Am Soc Microbiol; 2007. p. 6891-7.

28. Lee M-A, Wang D, Yap EH. Detection and differentiation of Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei and Burkholderia thailandensis by multiplex PCR. Blackwell Publishing Ltd Oxford, UK; 2005. p. 413-7.

29. Merritt A, Inglis TJJ, Chidlow G, Harnett G. PCR-based identification of Burkholderia pseudomallei. SciELO Brasil; 2006. p. 239-44.

30. Novak RT, Glass MB, Gee JE, Gal D, Mayo MJ, Currie BJ, et al. Development and evaluation of a real-time PCR assay targeting the type III secretion system of Burkholderia pseudomallei. Am Soc Microbiol; 2006. p. 85-90.

31. Supaprom C, Wang D, Leelayuwat C, Thaewpia W, Susaengrat W, Koh V, et al. Development of real-time PCR assays and evaluation of their potential use for rapid detection of Burkholderia pseudomallei in clinical blood specimens. Am Soc Microbiol; 2007. p. 2894-901.

32. Thibault FM, Valade E, Vidal DR. Identification and discrimination of Burkholderia pseudomallei, B. mallei, and B. thailandensis by real-time PCR targeting type III secretion system genes. Am Soc Microbiol; 2004. p. 5871-4.

33. Bowers JR, Engelthaler DM, Ginther JL, Pearson T, Peacock SJ, Tuanyok A, et al. BurkDiff: A Real-Time PCR Allelic Discrimination Assay for Burkholderia Pseudomallei and B. mallei. PloS one. 2010;5(11):e15413.

34. Podnecky NL, Elrod MG, Newton BR, Dauphin LA, Shi J, Chawalchitiporn S, et al. Comparison of DNA Extraction Kits for Detection of Burkholderia pseudomallei in Spiked Human Whole Blood Using Real-Time PCR. PloS one. 2013;8(2):e58032.

35. Suppiah J, Thimma JS, Cheah SH, Vadivelu J. Development and evaluation of polymerase chain reaction assay to detect Burkholderia genus and to differentiate the species in clinical specimens. FEMS Microbiology Letters. 2010;306(1):9-14.

36. Price EP, Dale JL, Cook JM, Sarovich DS, Seymour ML, Ginther JL, et al. Development and Validation of Burkholderia pseudomallei-Specific Real-Time PCR Assays for Clinical, Environmental or Forensic Detection Applications. PloS one. 2012;7(5):e37723.