باتوجه­به افزایش دانش بشری در مورد تنوع بیماری دیابت و به­دلیل این که این بیماری یکی از مهم­ترین مشکلات بهداشتی، درمانی، اجتماعی و اقتصادی در جامعه بشری محسوب می­شود، نیاز برای به­دست آوردن  ترکیب­های مؤثر در درمان دیابت با عوارض جانبی کم­تر، احساس می­شود. بیماری دیابت ششمین علت مرگ ومیر درایالات متحده است. و حدود 18 درصد موارد کل مرگ ­و میر بالای 26 سالگی را تشکیل می­دهد. بیماری­های قلبی عروقی علت اصلی مرگ­های مربوط به دیابت است و شیوع آن در مبتلایان به دیابت نسبت­به جمعیت عمومی 3 برابر بیش­تر است. از طرفی دیگر خطر بروز سکته مغزی، نیز افزایش می­یابد. شیوع بیماری دیابت در بزرگسالان و کودکان درقسمت­های زیادی از دنیا به­دلیل چاقی بیش از و شیوه زندگی بدون تحرک است (8-6).

ﻓﺎﻛﺘﻮرﻫﺎی ﻣﺨﺘﻠﻔﻲ ﺑﺮ ﺗﻤﺎﻳﺰ سلول­‌ها به سلول­های بتا در پانکراس اثر می­گذارند ازجمله این فاکتورها عبارت‌اند از: Pax4،Pax6 ، MafA، Pdx-1، Neuro-D1، Hnf-1α و Hnf-3β  هستند (11-9).

تحقیقات نشان داده است که Hnf-1α (Hepatocyte nuclear factor 1 alpha) در بافت­های مختلف شامل روده، کبد، پانکراس و کلیه بیان می­شود. شکل عملکردی پروتئین Hnf-1α همودایمر است و در ابتدا به­عنوان فاکتوری که در رونویسی از ژن­های مختلف کبد شامل آلبومین، بتا آلدوز، آلفا آنتی­تریپسین، پیروات و بتا فیبرینوژن نقش دارد تعریف شد. اما بعدها مشخص شد که این ژن محدود به کبد نیست. اکنون مشخص شده است که بیش­تر از 150 ژن توسط Hnf-1α تنظیم می­شود که این ژن­ها در کبد، کلیه، سلول­های بتا پانکراس، روده و معده قرار گرفته اند. دسته بزرگی از ژن­ها در پانکراس از قبیل انسولین، انتقال دهنده گلوکز 2، 3 هیدروکسیل 3 متیل گلوتاریل کوآروکتاز، پیروات کیناز و 2 گزوگلوتارات دهیدروژناز تحت تاثیر نقص در Hnf-1α هستند. برخی مطالعه­ها نشان داد که با وجود جهش در ژن Hnf-1α سطح mRNA ژن­هایی مانند پیروات کیناز و انتقال دهنده گلوکوز 2 در کبد، کلیه و روده تغییر نمی­کنند. تحقیقات نشان داده است که اغلب ژن­های هدف Hnf-1α در هپاتوسیت­ها به­صورت ضعیفی تحت تأثیر جهش­های Hnf-1α هستند. Hnf-1α دارای سه دمین فعال با نام­های 1) دمین­دایمر شدن، 2) دمین اتصال به DNA و دمین فعال کننده رونویسی تشکیل شده است. لازم­به ذکر است که Hnf-1α از 631 اسید آمینه تشکیل شده است. ژن Hnf-1α تولید سه ایزوفرم HNF1A (C)  (Hepatic Nuclear Factor Homeobox A)، HNF1A(B) و HNF1A(A) را می­کند که این سه ایزوفرم در اثر پردازش و پلی­آدنیلاسیون متفاوت به­وجود می­آیند. HNF1A (A) دارای 10 اگزون بوده اما HNF1A(C)  و  HNF1A(B) به­ترتیب 6 و 7 اگزون دارند. تمام این ایزوفرم­ها دارای فعالیت هستند اما فعالیت ایزوفرم­های B و C در حدود 5 برابر بیش­تر از HNF1A است. به­تازگی نشان داده شده است که سن شروع دیابت ممکن است تحت تأثیر موقعیت جهش­های وابسته­به ایزوفرم­های Hnf-1α باشد. جهش­های Missense که در اگزون 8 تا 10 قرار دارند و خاص ایزوفرم HNF1A است باعث می­شود دیابت دیرتر شروع شود و مشخص شده است افرادی که جهش­های Missense آن­ها در اگزون 7 یا در اگزون­های 8 تا 10 قرار گرفته است نسبت­به افرادی که دارای جهش در اگزون­های 1 تا 6 است 10 سال دیرتر تشخیص داده می­شود (14-12).

استفاده از گیاهان دارویی از اولین درمان­های دیابت بوده است. داورهای گیاهی نسبت­به داورهای شیمیایی دارای سمیت کم­تر و اثرهای جانبی کم­تر هستند و اقبال عمومی برای مصرف آن‌ها بیش­تر است (15).

تاکنون بیش از 2100 گیاه دارویی در کاهش میزان قند خون و یا کاهش عوارض ناشی از آن شناخته شده است. از جمله این گیاهان می­توان به خار مریم، خیار تلخ، شنبلیله، سیاه­گیله  و هندوانه ابوجهل اشاره کرد. گیاه خار مریم (Silybum marianum (L.) Gaertn) یک گیاه یک یا دو ساله از خانواده کاسنیان است که در درمان اختلال­ها و بیماری­های کبد استفاده می­شود. این گیاه بومی جنوب اروپا و شمال آفریقا است و در مناطق مختلف ایران به­خصوص البرز مرکزی، خوزستان و آذربایجان رویش دارد. عصاره بذر گیاه خار مریم حاوی ترکیب­های فلاونوئیدی به­نام سیلی‌مارین است. فلاونوئیدها از ﺗﺮکیب­های ﺑﺴﻴﺎر ﻣﻬﻢ اﻛﺜﺮ ﮔﻴﺎﻫﺎن داروﻳﻲ، ﺳﺒﺰﻳﺠﺎت و ﻣﻴﻮه­ﻫﺎ هستند، فلاونوئیدها از ﻗﺒﻴﻞ ﻛﻮﺋﺮﺳﺘﻴﻦ ﻣﻮﺟﺐ ﺗﺮﺷﺢ اﻧﺴﻮﻟﻴﻦ و ﻣﻬﺎرﻛﻨﻨﺪه ﻗﻮی ﺗﺠﻤﻊ ﺳﻮرﺑﻴﺘﻮل در بافت­های ﺑﺪن است. سیلی‌مارین دارای خواص آنتی­اکسیدان و افزایش میزان گلوتاتیون سلولی و ثبات غشای سلولی در طب سنتی جهت بهبود اختلال­های کبد تجویز می­شود. تجویز این دارو برای افراد مبتلا به بیماری­های کبدی موجب افزایش حساسیت سلولی به انسولین و درنتیجه کاهش میزان قند خون شده است. سیلی‌مارین خواص مختلفی ازجمله: محافظت از کبد، فعالیت آنتی­اکسیدانی، ضد التهابی و ضد سرطان و هم­چنین ضد دیابت دارد. دیابت باعث کاهش سلول­های بتا و اختلال در عملکرد آن ‌ها می­شود سیلی‌­مارین این اختلال و کاهش را بهبود می­بخشد و هم­چنین به­طور قابل ‌توجهی باعث افزایش بیان انسولین می­شود. سیلی‌مارین شامل مخلوطی از چند ترکیب فنولی است که ایزومراز هم هستند که این ترکیب­ها سلی­بین، ایزوسیلی­بین، سیلی­کریستین و سیلی­دیانین نامیده می­شوند (16،17).

داروی ضد دیابت متفورمین که یک داروی خوراکی متعلق­به دسته بی­گوانیدها است، آنالوگ (GLP-1) (Glucagon-Like Peptide-1) است. GLP- پپتید آزاد کننده انسولین معدی-روده ای است که موجب افزایش رها شدن انسولین وابسته­به گلوکز می­شود. علاوه­بر آن سبب مهار ترشح گلوکاگون، تحریک بیوسنتز انسولین، توسعه توده سلول­های بتا و افزایش فنوتیپ سلول­های بتا از طریق مسیر وابسته­به PDX-1 می­شود (18). با توجه­به عوارض جانبی کم­تر گیاهان دارویی نسبت­به داورهای صنعتی و شیمیایی در این مطالعه به بررسی تأثیر سیلی‌مارین بر قند خون و بیان ژن Hnf1a در رت­های نر ویستار دیابتی شده با استرپتوزوتوسین پرداخته شده است.

مواد و روش­ها

جامعه مورد مطالعه و گروه بندی

بر مبنای مطالعه­های کتابخانه­ای و بررسی پژوهش­های گذشته، در این مطالعه تعداد 42 سر رت نر[1] به وزن 220-180 از شرکت دانته شهرکرد خریداری گردید و به اتاق حیوانات واقع در دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد انتقال داده شد. حیوانات در قفسه‌ای مخصوص خود نگهداری شدند و آب و غذا به اندازه کافی در اختیارشان قرار داده شد. برای تغذیه حیوانات از غذای مخصوص موش از شرکت خوراک دام کابیله اصفهان تهیه شده بود استفاده گردید و آب لوله‌کشی توسط شیشه‌های آبخوری در اختیارشان قرار می‌گرفت (19).

موش‌ها در 7 گروه 6 تایی دسته‌بندی شدند که شامل گروه A (شاهد)، گروه B بیمار دیابتی (شاهد دیابتی)، گروه C (بیمار دیابتی و تیمار با سیلی­مارین دوز 50 میلی­گرم بر کیلوگرم)، گروه D (بیمار دیابتی و تیمار با سیلی­مارین دوز 100 میلی­گرم بر کیلوگرم)، گروه E (بیمار دیابتی و تیمار با سیلی­مارین دوز 150 میلی­گرم بر کیلوگرم)، گروه F (بیمار دیابتی و تیمار با متفورمین دوز 150 میلی­گرم بر کیلوگرم) و گروه G که گروه سالم و دریافت کننده سیلی­مارین 150 میلی­گرم بر کیلوگرم بودند. موش­ها در قفس‌های مجزا نگهداری شدند آب و غذا برای همه یکسان بود و هم­چنین شرایط اتاق حیوانات در تمام طول دوره مطالعه در دمای 25-22 و رطوبت نسبی 50 درصد و سیکل روشنایی- تاریکی 12 ساعت در شبانه روز حفظ شد (19).

گروه‌های مورد آزمایش که در جدول شماره (1) نشان داده شده است، هر گروه شامل شش سر رت نژاد ویستار بود که همه گروه‌ها به‌جز گروه شاهد سالم (A) و گروه شاهد دیابتی (B)، هر سه روز یک‌بار طی یک ماه (10 نوبت در ماه) دوزهای مختلف داروهای سیلی‌مارین (150، 100، 50) و متفورمین (با استفاده از نتایج پژوهش­های گذشته دوز 150میلی­گرم برکیلوگرم متفورمین (20) برای گروه بیمار دریافت کننده متفورمین انتخاب شد) و به­صورت جداگانه در آب مقطر حل شد و به‌صورت خوراکی (گاواژ) به موش­ها داده شد.

قبل از انجام آزمایش تمامی موش‌ها با استفاده از دستگاه گلوکومتر BIONAM ساخت کشور تایوان و با اخذ یک قطره خون از طریق دم، گلوکز خون آن‌ها اندازه­گیری شد.

 برای ایجاد دیابت از داوری استرپتوزتوزسین (STZ) (خریداری شده از شرکت مرک آلمان) با دوز 50 میلی‌گرم بر هر کیلوگرم وزن رت (mg/kg 50) محلول در بافر سیترات 1/0 مولار با اسیدیته 5/4 با یک‌بار تزریق درون صفاقی دیابتی شدند. اثبات دیابتی بودن قند خون رت­ها 72 ﺳﺎﻋﺖ از زﻣﺎن ﺗﺰریﻖ (STZ) در ﻣﺤﺪوده بالاتر از 240 میلی­ﮔﺮم بر دﺳﯽ­ﻟﯿﺘﺮ بود (29،30). سنجش قند خون همه گروه‌ها هر ده روز یک‌مرتبه با رعایت 8 ساعت محرومیت از غذا انجام و گلوکز خون ثبت گردید. پس از پایان دوره آزمایش در روز سی­ام حیوانات به­مدت 12 ساعت ناشتا نگه داشته شدند و سپس با استفاده از کلروفرم بی‌هوش شده پس از تشریح، مقداری از بافت پانکراس به نسبت 1 به 4 در مایع حاوی RNAlater جهت اندازه‌گیری بیان ژن Hnf-1α ذخیره شد. برای اندازه‌گیری بیان ژن مورد بر بررسی در پژوهش حاضر از روش Real Time RT PCR (RT –qPCR) استفاده شد. باید این نکته را ذکر نمود که RNA پس از استخراج دستخوش تغییر خواهد شد و برای رفع این مشکل بلافاصله پس از برداشت باید در مجاورت محلول ثبیت کننده (RNA later) قرار گیرد و هم­چنین به­دلیل حساسیت بالا تمام لوازم مورد نیار با محلول DEPC 1 درصد تیمار شدند (21).

انجام تکنیک           Real Time RT-PCR

استخراج RNA به‌وسیله هاون و ازت مایع و ترایزول ساخت شرکت کیان مطابق پروتکل استاندارد شرکت­های سازنده انجام شد و Total RNA استخراج شد و سپس برای حذف آلودگی ژنومی از کیت آنزیم DNase (شرکتThermo ) مطابق دستورالعمل این شرکت استفاده شد.

پس از استخراج RNA برای اطمینان از کافی بودن آن و هم­چنین میزان خلوص و عدم آلودگی ژنومی آن، از نظر کیفی به‌واسطه لود کردن روی ژل آگارز 2 درصد (شکل 1) و هم از نظر کمی به‌وسیله دستگاه نانودراپ میزان خلوص (OD) آن اندازه‌گیری شد که غلظت همه غلظت RNAها بیش­تر از ng/µl 9000 بود.

شکل 1- حضور سه باند s 28، s 18و s 8/5 ریبوزومی در RNA تام

سپس مقداری از RNA برای ساخت cDNA استفاده شد. به این منظور از کیت سنتز cDNA شرکت تاکارا طبق دستورالعمل شرکت سازنده این کیت استفاده شد. برای تعیین میزان بیان ژن Hnf-1α از ژن GAPDH به‌عنوان ژن کنترل داخلی (رفرنس) استفاده شد. پرایمرهای انتخابی این ژن‌ها ساخت شرکت ماکروژن کشور کره جنوبی بودند. (الگوی پرایمرهای مورد استفاده در پژوهش در جدول شماره (1) آمده است).

در مرحله بعد به‌وسیله سیستم روتورژن 6000 و با استفاده از کیت سایبر مستر ریل­تایم ساخت شرکت تاکارا کشور ژاپن مطابق دستورالعمل آن استفاده شد پروتکل دمایی مورد استفاده در دستگاه روتورژن در روش Real Time RT-PCR در جدول شماره (2) آورده شده است.

جدول 1- پرایمرهای طراحی‌شده برای ژن Hnf-1α و GAPDH

جدول 2- پروتکل دمایی مورداستفاده برای ژن Hnf-1α در دستگاه روتورژن

در انتها CTهای مربوط به واکنش‌ها توسط نرم‌افزار سیستم Real Time RT- PCR استخراج و ثبت گردید.

بعد از اتمام واکنش Real Time RT- PCR سیکل آستانه هر نمونه به‌صورت جداگانه به­دست آمد؛ که با مقایسه سیکل آستانه ژن Hnf-1α با ژن مرجع (GAPDH)، می­توان میزان بیان ژن موردنظر را به‌صورت کمی از فرمول شماره 1 به­دست آورد و میزان بیان ژن Hnf-1α در هفت گروه مختلف اندازه­گیری شد.

fold change =2^-∆∆ct فرمول شماره 1                            

آنالیز آماری

برای محاسبه آماری و آنالیز آماری از نتایج به­دست آمده از دستگاه Real time RT-PCR مقدار Fold change محاسبه شد. آنالیز آماری با استفاده از نرم­افزار spss نسخه 22 انجام شد.آنالیز آماری داده‌ها، از آنجا که داده‌ها از توزیع نرمال برخوردار بودند، داده­ها بر اساس میانگین ± انحراف معیار (Mean ± STD)  بیان شده است. نرمالیته دادها با استفاده از تست کولموگروف- اسمیروف بررسی شد و پس از اطمینان از نرمال بودن داده­ها، اختلاف بیان ژن بین نمونه­های شاهد سالم (کنترل مثبت) و گروه شاهد دیابتی (کنترل منفی) و هم­چنین گروه­های سالم شاهد و سالم دریافت کننده سیلی­مارین با استفاده از آزمون تی (T test) استفاده شد، میزان بیان ژن در سایر گروه­ها (گروه­های دیابتی دریافت کننده داروی سیلی­مارین و متفورین) بر اساس میزان بیان ژن در گروه شاهد دیابتی با استفاده از آنالیز واریانس یک­طرفه (ANOVA) و با آزمون پشتیبان post test LSD ارزیابی شدند و تفاوت بین گروه‌های مختلف با 05/0>P معنی‌دار تلقی شد (22).

یافته ­ها

تغییرهای قند خون رت‌ها

در ابتدا تغییرهای قند خون در گروه‌های مورد مطالعه بررسی شد. برای اندازه­گیری قند خون هر 10 روز یک‌بار قند خون ناشتای رت­ها (14 ساعت گرسنگی) با خون‌گیری از ناحیه دم و با استفاده از دستگاه گلکومتر اندازه‌گیری شد و نتایج گروه‌های تیمار و شاهد در نمودار (1) آمده است.

نتایج Real Time RT-PCR

نتایج حاکی از میزان تکثیر در ژن­های GAPDH و Hnf-1α را نشان داد که بیان ژن رفرنس (GAPDH) در همه نمونه‌ها یکسان بوده است و بیش­ترین بیان ژن Hnf-1α مربوط­به گروه سالم دریافت‌کننده دوز mg/kg 150 سیلی­مارین (G)و بعد از آن به گروه­های سالم شاهد(A)، دریافت‌کننده دوز mg/kg 100 سیلی­مارین (D)، دریافت‌کننده دوز mg/kg 150 سیلی­مارین (E)، دریافت‌کننده دوز mg/kg 150 متفورمین (F)، دریافت‌کننده دوز mg/kg 50 سیلی­مارین (C) و شاهد دیابتی (B) است.

نتایج گروه سالم شاهد و کنترل منفی (شاهد دیابتی)

در این دو گروه مشخص شد که بیان ژن در گروه شاهد سالم بالا بوده و در گروه شاهد دیابتی  افت شدیدی داشت و دارای اختلاف معنی­دار است. (05/0P-Value< ). در جدول (3) میانگین و انحراف معیار دو گروه سالم و شاهد دیابتی آورده شده است.

جدول 3- میانگین و انحراف معیار دو گروه سالم و شاهد دیابتی

بررسی دو گروه شاهد دیابتی و سالم نشان داد که اختلاف بین این دو گروه معنی­دار است 002/0 P-Value= که در نمودار 2 نشان داده شده است.