جداسازی و شناسایی گونه­‌های نوکاردیا از نمونه­های

 شست وشوی برونش و خلط بیماران مشکوک به

نوکاردیازیس با استفاده از روش مولکولی مبتنی­بر توالی

 PCR در استان خوزستان

محمد هاشم زاده^1،2، آرام عصاره زادگان دزفولی^1*، سارا افضل زاده³

1- گروه میکروب شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اهواز، اهواز، ایران

2- دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز، کمیته تحقیقات دانشجویی، دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز، اهواز، ایران

3- گروه بیماری­های عفونی، بیمارستان آموزشی رازی، دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز ، ایران.

چکیده

سابقه‌ و هدف: نوکاردیا عضوی از خانواده نوکاردیاسه است که54 گونه برای انسان بیماری­زا هستند. با توجه­به اینکه مطالعه­های کمی در خصوص شیوع نوکاریازیس در استان خوزستان انجام گرفته است هدف از انجام این مطالعه جداسازی و شناسایی گونه­‌های نوکاردیا از نمونه­های شست­وشوی برونش و خلط بیماران مشکوک به نوکاردیازیس با استفاده از روش مولکولی PCR در استان خوزستان است.

مواد و روش‌ها: در این بررسـی تعـداد 178 نمونه شست­وشوی برونش و 100 نمونه خلط از بیماران مشکوک به نوکاردیازیس در طی مدت 1سال جمع­آوری گردیده و به آزمایشگاه میکروب­شناسی شهر اهواز جهت شناسایی دقیق فرستاده شدند سپس از شناسایی از طریق PCR  ردیابی ژن­های 16 S rRNA، NG  و Betانجام گرفت و محصولات PCR  تعیین توالی گردید. 

یافته‌ها: در این مطالعه 278 نمونه شامل 178 نمونه شست­وشوی برونش و 100 نمونه خلط اخذ شده از بیماران مشکوک به نوکاردیوزیس مورد بررسی قرار گرفتند.. نتایج تعیین توالی نـشان داد که 27 مورد از نمونه­ها از نظر گونه­های نوکاردیا مثبت بود .از 7 نمونه شست­و شوی برونش، 6 مورد متعلـق­بـه گونـهN . Nova  و 1 مورد متعلق­به گونه farcinica..N  است. 20 نمونه مربوط به خلط و8 متعلق­به  N. cyriacigeorgica 4نمونه مربوط به farcinica..N 3 نمونه مربوط­به  N. asteroides و5 نمونه مربوط­به  N. nova بود.

نتیجه‌گیری: مطالعه حاضر نشان از توانای بالای روش مولکولی در تشخیص دقیق جنس و گونه نوکاردیا دارد و لزوم مطالعه بیش­تر این بیماری در مطالعه­های آینده بیش از پیش احساس می­شود. نوکاردیوزیس نباید به­عنوان یک بیماری غیرمعمول تلقی شود هم­چنین در مطالعه ما نشان داده شد که شاخص بالایی از از نظر شیوع بالینی به­خصوص در بیماران نقص ایمنی و بیماران ریوی و مبتلا به سل دارد.

واژه­های کلیدی: نوکاردیا، تعیین توالی،نوکاردیازیس، برونش، خلط، IAU science

نوکاردیا عضوی از خانواده نوکاردیاسه و از دسته اکتینومایست­های هوازی هستند که گرم مثبت، هوازی اجباری، کاتالازمثبت، غیرمتحرک، نیمه اسیدفست و کنـد رشـد بوده و در محیط­های کشت و بافت­ها اغلب تشکیل فیلامنت­هایی را تشکیل می­دهند که بـه عناصرکوکـسی و به شکل باسیل تبدیل می­شوند (1) .تـاکنون بـیش از 109 گونـه نوکاردیا شناسـایی شـده اسـت کـه 54 گونه برای انسان بیماری­زا هستند. از جمله مهم­ترین گونه­های بیماری­زا برای انسان : N. nova complex, N. abscessus complex, N. transvalensis complex N. farcinica, N. asteroides type VI (N. cyriacigeorgica), N. brevicatena/N. paucivorans complex است (2). این باکتری­های فرصت­طلب، در زیستگاه­های طبیعی مانند خاک، هـوا و آب حضورداشـــته و ســـبب ایجـــاد عفونـــت در قسمت­های مختلف بـدن و ایجـاد اشـکال بـالینی هم­چون عفونت­هـای تنفسـی، جلـدی، زیرجلـدی، جلـدی- لنفـاوی، مایسـتومایی، عصـبی و چشـمی می­گردند که اگر به­موقع تـشخیص داده و درمان نشود، در بدن پخش می­شوند و برای انسان کشنده خواهند بود (3،4). از آنجایی­که بیماران دچار نقص سیستم ایمنی، بـدخیمی­های هماتولوژیک، گیرندگان پیوند اعضاء، ایدز، مـصرف طـولانی مدت کورتیکواستروئیدها، الکلیـسم مـزمن و دیـابتی­هـا، دچـار کمبـود سـلول T هستـند، ایـن بیمـاران مـستعد ابـتلا بـه نوکاردیوزیس ریوی هستند (5). نوکاردیوزیس بیماری نگران­کننده جهانی است که سالانه 1000-500 مورد در ایالات متحده گزارش می­شود و میزان بروز آن در ایران مشخص نبوده و اغلب به­صورت موردی دیده می­شود (6). این بیماری می‌تواند ریه یا کل بدن (نوکاردیوز سیستمیک) را مبتلا کند. شایع‌ترین عوامل آن نوکاردیا آستروئیدس و نوکاردیا برازیلینسیس است. در بیماران مبتلا به نوکاردیوز مغزی، میزان مرگ و میر تا ۸۰٪ می‌رسد. در سایر اشکال بیماری، میزان مرگ و میر حتی درصورت درمان مناسب تا ۵۰٪ می‌رسد (7،8).

علائــم بــالینی و ویژگــی­هــای رادیولوژیــک نوکاردیوزیس ریوی شبیه بیماری سل ریوی است، اما پیـشرفت آن نسبت­به بیماری سل سریع­تر بوده و دوره بیماری چند مـاه است. ضایعه ریوی ناشی از نوکاردیوزیس ریوی موضعی و بـدون علائم بالینی همراه با آبسه و گـاهی بـه­صـورت پنومـونی دیـده  می­شود. دراغلب موارد، عفونت­هـای نوکـاردیوزیس بـه­علـت فقـدان علائم کلینیکی ویژه به­صـورت صـحیح و سـریع تـشخیص داده نمی­شود (9). روش­های تشخیصی مولکولی به­علت دارا بودن سرعت بالا جایگاه مهمی در تکنیک­های تشخیصی نوین دارند. کاربرد این تکنیک­ها در بیماری­هایی مانند نوکاریازیس از اهمیت خاصی برخوردار است.  PCR مبتنی­بر توالی یکی از مؤثرترین روش­ها برای شناسایی عفونت­های نوکاردیا است. این روش شامل تقویت DNA با پرایمرهای اختصاصی جنس است. در این روش، توالی نوکلئوتیدی ارگانیسم  با توالی­های مرجع مقایسه و شناسایی  می­شود (10). نوکاردیا باکتری کنـد رشـد بوده و برای شخیص سریع و دقیق آن و هم­چنین برای درمـان، از روش­های مولکولی که در مقایسه با کـشت از سـرعت، دقت، حساسیت و اختصاصیت بالاتری در شناسـایی گونـه­هـای نوکاردیا برخوردار هستند استفاده می­شود. با توجه­به این­که سل در ایران اندمیک است و تحت کنترل است اما به­خاطر همسایگی ایران با کشورهای همسایه در چند سال اخیر جنگ را تجربه کرده­اند باز هم احتمال ورود آن از مرز‌ها وجود دارد و با توجه­به این‌که سل از راه تنفس سرایت می‌کند کسانی که واکسن آن را دریافت کرده‌اند نیز بین 3 تا 80 درصد در معرض ابتلا به آن قرار دارد. با توجه­به این­که مطالعه­های کمی در خصوص شیوع نوکاریازیس در استان خوزستان انجام گرفته است هدف از انجام این مطالعه جداسازی و شناسایی گونه­‌های نوکاردیا از نمونه­های شست وشوی برونش و خلط بیماران مشکوک به نوکاردیازیس با استفاده از روش مولکولی PCR در استان خوزستان است.

مواد و روش­ها

در این بررسـی تعـداد 178 نمونه شست­وشوی برونش و 100 نمونه خلط از بیماران مشکوک به نوکاردیازیس در طی مدت از بهمن 1398 تا شهریور 1399 از شهرهای مختلف استان خوزستان شامل (اهواز، دزفول، مسجد سلیمان، لالی، امیدیه، آبادان ) جمع­آوری گردیده و به آزمایشگاه میکروب­شناسی شهر اهواز جهت تأیید و شناسایی دقیق فرستاده شدند.

روش اســتخراج DNA

 برای استخراج DNA  اسید نوکلوئیک از کیت کیاژن (QlAamp DNA Mini Kit-QIAGEN) استفاده شد.از سـویه اسـتانداردN. brasiliensis PTCC1422  تهیـه شـده از سـازمان پژوهـش­های علمـی صـنعتی ایـران بـه­عنوان کنترل مثبت استفاده گردید. هم­چنین غلظت DNA استخراج شده با دستگاه اسپکتروفوتومتر (Eppendorf,Germany) با طول موج ۲۶۰ نانومتر اندازه­گیری گردید.

تکثیر DNA استخراج شده از طریق PCR برای ردیابی ژن های 16 S rRNA، NG  و Bet

در این روش بــه منظــور شناســایی عوامــل نوکاردیوزیس همراه با هاوسکیپینگ ژن خانه دار در نمونـه هـای بـرونش از PCR بــا پرایمرهــای شــناخته شــده و اختصاصی جـنس نوکاردیـا شـامل پرایمرهـای NG1 و NG2 بــرای تکثیــر قطعــه 598 جفــت بــاز از ژن16 S rRNA و پرایمرهای BetF و BetR برای تکثیر قطعه 204 جفـت بـازی ژن بتا اکتین موجود در نمونه هـای بـالینی اسـتفاده شـد (11،12)(جدول 1)

جدول 1- پرایمر های مورد استفاده در این مقاله

تهیه Master Mix و انجام PCR

جهت انجام PCR، از مسترمیکس آماده جهت جلوگیری از ایجاد آلودگی و سرعت کار استفاده گردید. حجم کلی مسترمیکس در هر آزمایش با یک حجم اضافی محاسبه گردید. سپس به میکروتیوب­های استریل که از قبل به تعداد نمونه­ها و کنترل مثبت و منفی نام­گذاری شده بود، ۲۰ میکرولیتر Master Mix و ۵ میکرولیتر DNA اضافه گردید. پس از اطمینان از بسته بودن درب میکروتیوپ­ها، در دستگاه ترموسایکلر جهت تکثیر ژن­های موردنظر از DNA های استخراج شده براساس برنامه اجرایی، بـا اسـتفاده از دستگاه ترموسایکلر (Techne) با شـرایط حـرارت 95 درجه سانتی­گراد 3 دقیقه (واسرشت سـاز ابتـدایی)، 95 درجه سانتی­گراد 20 ثانیه (واسرشت سـازی )، 58 درجه سانتی­گراد 40 ثانیه (اتصال پرایمر) 72 درجه سانتی­گراد 90 ثانیه (گسترش پرایمر) و 72 درجه سانتی­گراد 5 دقیقه گسـترش نهـایی انجام گردید. درنهایت 1۰ میکرولیتر از محصول  PCR برروی ژل آگارز 5/1 درصد واجد Safe stain منتقل گردید و پس از الکتروفـورزتوسـط دسـتگاه تـرانس لومیناتور مورد بررسی قرار گرفت. از DNA سویه N. Brasiliensis PTCC1422 به­عنوان کنترل مثبت و از آب مقطر استریل به­عنوان کنترل منفی استفاده گردید.

برنامه اجرایی دستگاه ترموسایکلر برای ژن NG1,2 و BetFR به­روش PCR Duplex

انجام PCR طبق مراحل ذکر شده انجام گرفت. پس از اطمینان از بسته بودن درب میکروتیوپ­ها، در دستگاه ترموسایکلر جهت تکثیر ژن­های موردنظر از DNA های استخراج شده براساس برنامه اجرایی، بـا اسـتفاده از دستگاه ترموسایکلر (Techne) با شـرایط حـرارت 94 درجه سانتی­گراد 5 دقیقه (واسرشت سـاز ابتـدایی)، 94 درجه سانتی­گراد 30 ثانیه (واسرشت سـازی)، 60 درجه سانتی­گراد 45 ثانیه (اتصال پرایمر) 72 درجه سانتی­گراد 90 ثانیه ( گسترش پرایمر) و 72 درجه سانتی­گراد 5 دقیقه گسـترش نهـایی انجام گردید. درنهایت 1۰ میکرولیتر از محصول  PCR برروی ژل آگارز 5/1 درصد واجد Safe stain منتقل گردید.

تعیین توالی

بـه­منظـور شناسـایی گونـه­هـای نوکاردیـا، محصولات PCR  حاوی قطعه ژن به­طول 598 جفت بـازی و 1500 بازی را پس از تخلیص از روی ژل، جهت تعیین توالی به شرکت تکاپوزیست ارسال نموده و نتایج تعیـین تـوالی به­وسـیله نـرم­افزار Mega5 آنالیز گردید. 

یافته­ها

در این مطالعه اپیدمیولوژیک توصیفی، 278 نمونه شامل 178 نمونه شست­وشوی برونش و 100 نمونه خلط اخذ شده از بیماران مشکوک به نوکاردیوزیس که به­دستور پزشک متخصص براساس علائم بالینی مشخص شده بودند در بازه زمانی سال­های ۱۳۹۹-۱۳۹8مورد بررسی قرار گرفتند. تمامی بیمارانی که مشکوک به نوکاردیوزیس بودند از نظر متغیرهایی مانند سن، جنس، ملیت و بیماری زمینه­ای مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. در مجموع 278 مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج تعیین توالی حاصل از محصولات  PCR بـا پرایمر اختصاصی جنس و گونه نوکاردیا و نـشان داد که 27 مورد از نمونه­ها از نظر گونه­های نوکاردیا مثبت بود 261 مورد (93%( منفی گزارش شدند. از 7 نمونه شست­و شوی برونش ، 6 مورد متعلـق­بـه گونـهN . Nova  و 1 مورد متعلق­به گونه farcinica..N  است. 20 نمونه مربوط­به خلط و 8 مورد متعلق­به N. cyriacigeorgica، 4 نمونه مربوط­به farcinica..N، 3 نمونه مربوط­به  N. asteroides و5 نمونه مربوط­به  N. nova بود. از 2۷ مورد دارای نوکاردیوزیس،2۴  (92%( بیمار ملیت ایرانی و ۳ (8/2%( بیمار ملیت عراقی داشتند. تمام ۱۷ مورد دارای سل خارج مثبت ساکن شهر بودند و بیمار ساکن روستا در مطالعه یافت نشد. آمارهای توصیفی سن در بیماران مبتلا به نوکاردیوزیس در جدول 2 نشان داده شده است. از نظر محل سکونت، ۱5 (55%) بیمار ساکن شهر اهواز و ۳ (11%) بیمار به­ترتیب ساکن شهرهای دزفول و امیدیه،2 نفر ساکن لالی، 2 نفر ساکن مسجدسلیمان و2 نفر ساکن آبادان بودند.

جدول2- توزیع فراوانی نوکاردیازیس برحسب گروه­های سنی مختلف در بیماران مبتلا به نوکاردیازیس

همان­طور که مشاهده می­شود بیش­ترین گروه سنی متعلق­به 40-31 سال بوده است. از نظر بیماری بیماری زمینه­ای در این مطالعه 89% از بیماران دارای بیماری زمینه­ای بودند در واقع از مجموع 27۸ بیمار مشکوک به نوکاردیوزس، 251 بیمار دارای بیماری زمینه­ای هستندکه آمار بسیار بالایی است .در مورد نوکاردیوزس بیش­ترین موارد بیماری زمینه­ای مربوط به عفونت ریه و عود سل و عفونت فعال توبرکلوزیس بود. در این مطالعه 4 نفر هم­زمان به هر دو عفونت سل و نوکاردیازیس داشتند (جدول3). هم­چنین در جدول 4 نوع نمونه براساس جنسیت را در 27 بیمار نشان می­دهد.

بحث

بررسی شیوع گونه­های نوکاردیا در نمونه­های بالینی، به­دلیل شناسایی و درمان سخت این باکتری بسیار اهمیت دارد. در بسیاری از مطالعه­های انجام گرفته در ایران شناسایی باکتری به­درستی انجام نشده است و هنوز از این بیماری شیوع مناسب و دقیقی گزارش نشده است. در این مطالعه گونه N. nova (27/11) بیش­تر از دیگر گونه­های دیگر یافت شده و به­دنبال آن

جدول3- بیماری­های زمینه­ای، گونه نوکاریا و نوع نمونه در بیماران مبتلا به نوکاردیوزیس

جدول 4- بررسی نوع نمونه براساس جنسیت در بیماران مبتلا به نوکاردیازیس

 (27/6) N. cyriacigeorgica و (27/3) N. asteroides و (27/1) farcinica. N به­ترتیب فراوانی قرار گرفتند. Famili و همکاران در ایران نیز در مطالعه­ای مشابه نشان دادند N. cyriacigeorgica  بیش­تر از بقیه ایزوله­ها جدا شده بود (6) در دیگر مطالعه­های انجام گرفته در ایران نیز N. asteroides و N. cyriacigeorgica بیش­تر گزارش شده­اند (13.14). برخلاف نتایج ما در مطالعه Wauters و همکاران در سال 2005 بیش­تر ایزوله­های جداشده از بیماران farcinica. N (44%) و بود و N. nova در رده بعدی قرار داشت. یکی از دلایل این تفاوت در شیوع گزارش شده، تفاوت منطقه جغرافیایی و حجم نمونه می­تواند باشد (15). البته گونه­های نوکاردیا گزارش شده در مطالعه ما جز گونه­های شایع در دیگر مناطق جهان است (18-16). در مطالعه ما 4 بیمار هم­زمان به هر دو عفونت سل و نوکاردیازیس بستری بودند و این مسئله میزان مرگ و میر بیماران را افزایش می­دهد و پاسخ بیمار را نسبت­به دارو های درمانی کاهش می­دهد. نوکاردیوزیس در کشورهای در حال توسعه مانند ایران که بیماری­هایی مانند سل به­صورت اندمیک بوده به­دلیل شباهت بالینی یا تشخیص داده نمی­شوند و یا از آن­ها چشم­پوشی می­شود. ویژگی­های رادیولوژیکی بین نوکاردیوز ریوی و سل ریوی از یک طرف و از طرف دیگر به­دلیل توانایی­های ضعیف تشخیصی این بیماری در ایران یک تهدید بزرگ برای بهداشت عمومی است (19). در مطالعه Ekrami و همکاران در سال 2015 در ایران، استان خوزستان، به بررسی نوکاردیازیس در افراد مشکوک به سل در شهر اهواز پرداختند که در این مطالعه از دو روش کشت و هم PCR به­صورت هم­زمان برای شناسایی نوکاردیا استفاده کردند. از 157، نمونه­های مثبت با رنگ­آمیزی اسید فست، کشت و PCR برای ما به­ترتیب برای 6٪ ، 10٪ و 7٪ نمونه گزارش شد، در حالی­که فقط دو نمونه برای گونه­های نوکاردیا نتایج مثبت داشتند. یکی از تفاوت­های مهم این مقاله عدم استفاده از تعیین توالی که دو ایزوله در حد شناسایی نوع باکتری باقی ماندند.هم­چنین مطالعه دیگر نیز بر عفونت هم­زمان سل با نوکاریا و در مواردی دیگر HIV با نوکاریا اشاره داشتند که در مطالعه ما HIV یافت نشد (21،20). در اواخر سال 1990 Wallace  و همکاران، Steingrube و همکاران برای اولین بار استفاده از روش­های مولکولی برای شناسایی جنس و گونه نوکاردیا پیشنهاد دادند. آن­ها اذعان داشتند روش­های فنوتیپی همانند کشت به­دلیل نیاز به انکوباسیون طولانی و کند رشد بودن باکتری، امکان آلودگی محیط کشت را با باکتری یا قارچ­های ساپروفیت بسیار زیاد می­کند (23،22). روش­های مولکولی برای تشخیص سریع گونه­های نوکاردیایی از نمونه بالینی کاربردی است. تشخیص باکتری نوکاردیا در سطح گونه به­منظور مطالعات اپیدمیولوژیک و تعیین توزیع جغرافیایی این باکتری اهمیت داشته و کم بودن مطالعه­ها در این زمینه بر لزوم تشخیص سریع نوکاردیای جدا شده از نظر بالینی تأکید دارد. هم­چنین روش­های مولکولی PCR  مبنتی تعیین توالی با اختصاصیت و حساسیت هرچه بیش­تر نسبت­به روش­های کشت و میکروسکوپی امکان بررسی تمام گونه­های شناخته شده نوکاردیا را فراهم می­کند و قادرنـد جـنس نوکاردیـا را از جـنس­هـای مایکوبـاکتریوم، کورینـه بـاکتریوم و رودوکوکوس افتراق دهند و باعث تشخیص سریع نوکـاردیوزیس قبل از پیشرفت بیماری شوند و جلوی عوارض غیرقابل برگـشت و در نهایـت مـرگ و میـر را بگیرنـد. همگام با مطالعه ما Alfaresi و همکاران در سال 2006 با استفاده از روش RealTime-PCR این روش را نیز برای شناسایی گونه­های نوکاردیا مناسب دیدند و حساسیت و اختصاصیات این روش را به­ترتیب 100% و 90% گزارش کردند ( 24). Fatahi Bafghi و همکاران در سال 2016 در ایران، تهران در مطالعه­ای به شناسایی گونه­ای نوکاردیا از نمونه­های مختلف بالینی به­روش­های مختلف مولکولی پرداختند. برای شناسایی دقیق در سطح گونه از روش  (RFLP)Restriction fragment length polymorphism با استفاده ازژن hsp65  و توالی کامل ژن 16S rRNAاستفاده کردند. بیست و هفت ایزوله نوکاردیا در نتایج آزمون­های فنوتیپی N.asteroides complex , N. otitidiscaviarum N. nova,  و Nocardia spp را نشان می­دادند. توالی ژن  16S rRNA نوکاردیا N.cyriacigeorgica ، N. otitidiscaviarum ، N. cardiafarcinica ، N. transvalensis و N. nova آنها نشان دادند و هم­چنین آن­ها نشان دادند که در روش RFLP برخی از گونه­ها ممکن است تشابه داشته باشند و تعیین توالی ژن کامل 16S rRNA برای تأیید لازم است (25).

نتیجه­گیری

مطالعه حاضر نشان از توانای بالای روش مولکولی در تشخیص دقیق جنس و گونه نوکاردیا دارد و لزوم مطالعه بیش­تر این بیماری در مطالعه­های آینده بیش از پیش احساس می­شود. هم­چنین بررسی مقاومت آنتی­بیوتیکی نیز می­تواند در اهداف ویژه سایر مطالعه­ها باشد. نوکاردیوزیس نباید به­عنوان یک بیماری غیرمعمول تلقی شود و در مطالعه ما نشان داده شد که شاخص بالایی از نظر شیوع بالینی به­خصوص در بیماران نقص ایمنی و بیماران ریوی و مبتلا به سل دارد. برای مطالعه بهتر ویژگی­های بالینی، بیماری­زایی، تشخیص و روش­های درمانی، مطالعه­های آینده نگر بیش­تری از ایران لازم است. در حالی­که با تأکید بر تکنیک­های مولکولی مبتنی­بر توالی بر تشخیص باکتری تا سطح جنس نسبت­به شناسایی دقیق و تست­های حساسیت آنتی­بیوتیکی به­کار گرفته شود.

سپاسگزاری

از کمیته تحقیقات دانشجویی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی اهواز بـه­خـاطر ایجـاد زمینـه اجـرای ایـن تحقیـق در آزمایشگاه آن مرکز تشکر و قدردانی می­گردد.