دوره 12، شماره 45 - ( 8-1400 )
جلد 12 شماره 45 صفحات 112-97 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Akhlaghi M, Eftekharivash L, Parnian F, Taebpour M, Rostamian T, Zarezadeh Mehrizi M, et al . Synthesis and study of cellular and physicochemical properties of nanoliposomes containing aqueous extract of Hedera Helix. NCMBJ 2021; 12 (45) :97-112
URL: http://ncmbjpiau.ir/article-1-1444-fa.html
URL: http://ncmbjpiau.ir/article-1-1444-fa.html
اخلاقی میلاد، افتخاری وش لیدا، پرنیان فاطمه، طائبپور محمد، رستمیان توحید، زارع زاده مهریزی مریم، و همکاران.. سنتز و بررسی ویژگی های سلولی و فیزیکوشیمیایی نانولیپوزوم های حاوی عصارهی آبی Hedera Helix. مجله تازه هاي بيوتكنولوژي سلولي و مولكولي. 1400; 12 (45) :97-112
میلاد اخلاقی 
، لیدا افتخاری وش ، فاطمه پرنیان ، محمد طائبپور ، توحید رستمیان ، مریم زارع زاده مهریزی ، کاظم انصاری ، بی بی فاطمه حقیرالسادات
، لیدا افتخاری وش ، فاطمه پرنیان ، محمد طائبپور ، توحید رستمیان ، مریم زارع زاده مهریزی ، کاظم انصاری ، بی بی فاطمه حقیرالسادات
مرکز تحقیقات نانوتکنولوژی و مهندسی بافت، پژوهشکدهی علوم تولید مثل، دانشگاه علوم پزشکی و خدمات درمانی شهید صدوقی یزد، یزد، ایران ، B.F. Haghirosadat
متن کامل [PDF 985 kb]
(1070 دریافت)
| چکیده (HTML) (2461 مشاهده)
نمودار 1 : طیف جذبی عصارهی گیاه عشقه در طول موج 200 تا 800 نانومتر
نمودار 2: نمودار استاندار عصاره ی عشقه در بافر PBS
نمودار 3: نمودار استاندار عصاره ی عشقه در بافر ایزوپروپیل
نمودار 4: نمودار رهایش عصارهی عشقه از سامانهی لیپوزومی طی 48 ساعت به وسیلهی روش اسپکتروفتومتری.
شکل 1 : نمودار و جدول اندازهی نانو سامانههای سنتز شده بر حسب نانومتر به وسیلهی دستگاه نانوسایزر.
شکل 2: نمودار و جدول تعیین بار میزان بار سطحی سامانه ی لیپیدی بر حسب mV.
شکل 3: طیف FTIR لیپوزوم بلانک
شکل 4: طیف FTIR لیپوزوم حاوی عصاره
شکل 5: تصاویر حاصل از عکسبرداری AFM از نانو سامانهی لیپوزومی حاوی عصارهی عشقه.
نمودار 5: نتایج حاصل از تست MTT بعد از 48 ساعت تاثیر سامانهی لیپوزومی فاقد عصاره با غلظتهای مشخص بر روی ردهی سلولی HFF جهت بررسی عدم سمیت لیپوزومهای ساخته شده بر روی سلولهای نرمال.
منابع:
1. Kibiti CM, Afolayan AJ. Herbal therapy: A review of emerging pharmacological tools in the management of diabetes mellitus in Africa. Pharmacognosy magazine. 2015;11(Suppl 2):S258.
2. Liu W, Ge T, Pan Z, Leng Y, Lv J, Li B. The effects of herbal medicine on epilepsy. Oncotarget. 2017;8(29):48385.
3. Barakat F, Aboee-Mehrizi F, Haghiralsadat BF, Sedighi-Khavidak S, Ashkezari MD. Designing and optimization of liposomal nano-carriers containing Nepeta persica extract and study of its cytotoxicity on the breast cancer cell line (MCF-7). Journal of Shahid Sadoughi University of Medical Sciences. 2019.
4. Bezruk I, Marksa M, Georgiyants V, Ivanauskas L, Raudone L. Phytogeographical profiling of ivy leaf (Hedera helix L.). Industrial Crops and Products. 2020;154:112713.
5. Pop CE, Parvu M, ARSENE AL, Parvu AE, Vodnar DC, Tarcea M, et al. Investigation of antioxidant and antimicrobial potential of some extracts from Hedera helix L. gut. 2017;4(6):11.
6. Roşca-Casian O, Mircea C, Vlase L, Gheldiu A-M, Teuca DT, Pârvu M. Chemical composition and antifungal activity of Hedera helix leaf ethanolic extract. Acta Biologica Hungarica. 2017;68(2):196-207.
7. Hasimun P, Adnyana IK. Zingiberaceae family effects on alpha-glucosidase activity: implication for diabetes. Bioactive Food as Dietary Interventions for Diabetes: Elsevier; 2019. p. 387-93.
8. Barnes LA, Leach M, Anheyer D, Brown D, Carè J, Lauche R, et al. The effects of Hedera helix on viral respiratory infections in humans: A rapid review. Advances in integrative medicine. 2020;7(4):222-6.
9. Kim HK, Na SS, Kim HH. Effects of Horticultural Therapy Programs on Depression and Self-esteem in Released-Convicts. Journal of People, Plants, and Environment. 2017;20(2):143-8.
10. Adil A, Khan SS, Naeem S, Ikram R, Jaffer N. Evaluation of acute and chronic hepatoprotective activity of Hedera helix L. Aqueous leaf extract on carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in rat model. Pak J Phytopathol. 2017;34:1-15.
11. Sun H, Li F, Xu Z, Sun M, Cong H, Qiao F, et al. De novo leaf and root transcriptome analysis to identify putative genes involved in triterpenoid saponins biosynthesis in Hedera helix L. PLoS One. 2017;12(8):e0182243.
12. Akhlaghi M, Ebrahimpour M, Ansari K, Parnian F, Zarezadeh Mehrizi M, Taebpour M. Synthesis, study and characterization of nano niosomal system containing Glycrrizha glabra extract in order to improve its therapeutic effects. New Cellular and Molecular Biotechnology Journal. 2021;11(42):65-82.
13. Haghiralsadat F, Azhdari M, Kalantar SM, Naderinezhad S, Teymourizadeh K, Yazdani M, et al. Strategy of Improvements in the rapeutic index of medicinal herbs of Iranianin digenous: Synthesis and characterization of phospholipid lipid-based vesicles in corporated Trachyspermum copticum. SSU_Journals. 2016;24(6):468-78.
14. Salem MZ, Zidan YE, Mansour MM, El Hadidi NM, Elgat WAA. Antifungal activities of two essential oils used in the treatment of three commercial woods deteriorated by five common mold fungi. International Biodeterioration & Biodegradation. 2016;106:88-96.
15. Sherry M, Charcosset C, Fessi H, Greige-Gerges H. Essential oils encapsulated in liposomes: a review. Journal of liposome research. 2013;23(4):268-75.
16. Sercombe L, Veerati T, Moheimani F, Wu SY, Sood AK, Hua S. Advances and challenges of liposome assisted drug delivery. Frontiers in pharmacology. 2015;6:286.
17. Pandey H, Rani R, Agarwal V. Liposome and their applications in cancer therapy. Brazilian archives of biology and technology. 2016;59.
18. Shahbazian S, Akbarzadeh A, Torabi S, Omidi M. Anti-cancer activity of pegylated liposomal trans-anethole on breast cancer cell lines MCF-7 and T47D. Biotechnology letters. 2015;37(7):1355-9.
19. Bozzuto G, Molinari A. Liposomes as nanomedical devices. International journal of nanomedicine. 2015;10:975.
20. Li J, Wang X, Zhang T, Wang C, Huang Z, Luo X, et al. A review on phospholipids and their main applications in drug delivery systems. Asian journal of pharmaceutical sciences. 2015;10(2):81-98.
21. Alavi M, Karimi N, Safaei M. Application of various types of liposomes in drug delivery systems. Advanced pharmaceutical bulletin. 2017;7(1):3.
22. Majdizadeh M, Rezaei Zarchi S, Movahedpour AA, Shahi Malmir H, Sasani E, Haghiralsadat BF. A new strategy in improving therapeutic indexes of medicinal herbs: preparation and characterization of nano-liposomes containing Mentha piperita essential oil. SSU_Journals. 2018;25(11):853-64.
23. مالمیر هش, کلانتر س, ساسانی ا, اسگری م, زاده مم, حقیرالسادات ببف. Synthesis and optimization of niosomal carriers containing doxorubicin in order to achieve a final formulation with high potential in cancer cells temperature and acidity. Journal of Shahid Sadoughi University of Medical Sciences. 2019.
24. Danhier F, Feron O, Préat V. To exploit the tumor microenvironment: passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. Journal of controlled release. 2010;148(2):135-46.
25. Honary S, Zahir F. Effect of zeta potential on the properties of nano-drug delivery systems-a review (Part 1). Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 2013;12(2):255-64.
26. Valenti D, De Logu A, Loy G, Sinico C, Bonsignore L, Cottiglia F, et al. Liposome-incorporated Santolina insularis essential oil: preparation, characterization and in vitro antiviral activity. Journal of liposome research. 2001;11(1):73-90.
27. Detoni C, Cabral-Albuquerque E, Hohlemweger S, Sampaio C, Barros T, Velozo E. Essential oil from Zanthoxylum tingoassuiba loaded into multilamellar liposomes useful as antimicrobial agents. Journal of microencapsulation. 2009;26(8):684-91.
28. Celia C, Trapasso E, Locatelli M, Navarra M, Ventura CA, Wolfram J, et al. Anticancer activity of liposomal bergamot essential oil (BEO) on human neuroblastoma cells. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2013;112:548-53.
29. Tao F, Hill LE, Peng Y, Gomes CL. Synthesis and characterization of β-cyclodextrin inclusion complexes of thymol and thyme oil for antimicrobial delivery applications. LWT-Food Science and Technology. 2014;59(1):247-55.
30. Haghjoo S, Ghanbarzadeh B, Hamishekar H, Asni Ashari S, Dehghannia J. Evaluation of Colloidal and Antioxidant Properties of Nanoliposome Loaded with Urtica dioica L. Extract. Innovative Food Technologies. 2015;2(3):11-23.
31. Bashiri S, GHANBARZADEH B, HAMISHEHKAR H, DEHGHANNIA J. Beta-Carotene loaded nanoliposome: effects of gama–oryzanol on particle size stability and encapsulation. 2015.
32. Ebrahimi Khosfi M, Khosravi Darani K, Hosseini H, Arabi Sh KFR, Kohi Kamali P. Production of nanoliposomes containing essential oil of Boiss Zatariamultiflora by response surface method. Nano Meghyas. 2014;1(2):119-28.
33. Cui H, Zhao C, Lin L. The specific antibacterial activity of liposome-encapsulated Clove oil and its application in tofu. Food Control. 2015;56:128-34.
34. Gharenaghadeh S, Samadlouie H, Sowti M, Hamisekar H, Mokaram R. Evaluation of the antimicrobial and antioxidant properties of Salvia essential oil nano liposome (Salvia multicaulis). Journal of Food Science and Technology. 2017;14(62):271-82.
35. Hosseini SF, Zandi M, Rezaei M, Farahmandghavi F. Two-step method for encapsulation of oregano essential oil in chitosan nanoparticles: preparation, characterization and in vitro release study. Carbohydrate polymers. 2013;95(1):50-6.
متن کامل: (2412 مشاهده)
Synthesis and study of cellular and physicochemical properties of nanoliposomes containing aqueous extract of Hedera Helix
Milad Akhlaghi1, Lida Eftekharivash2, Fatemeh Parnian3, Mohammad Taebpour4, Tohid Rostamian5, Mahbobeh Zarezadeh Mehrizi6, Kazem Ansari7, Bibi Fatemeh Haghirosadat8*
Email: Fhaghirosadat@gmail.com
Aim and background: The use of medical herbs because of their reasonable price and availability is rapidly increasing but it faces many challenges. Researchers are trying to overcome these challenges by designing nano-drug delivery carriers such as liposome. In this study, a formulation of liposomal system containing Hedera Helix extract was synthesized and its toxicity on normal cells and physicochemical characteristics were evaluated.
Material and Method: In the first step, extraction of Hedera Helix was done by succulent method. In the next step, nano-liposomes were prepared by thin film method from phosphatidylcholine and cholesterol and by using hydration inactive method the extract was loaded into them. Then the encapsulation rate and the release pattern were assayed by spectrophotometry method, the size of nanoparticles and their zeta potential were evaluated by the DLS, the non-interaction between the extract and the nanosystem was assessed by FT-IR technique and the morphology of the nanoparticles was examined by AFM microscope and finally the non-toxicity of the system on normal cells was assayed by MTT method.
Results: The results of this study showed that nano-liposomes containing Hedera Helix extract having 48.6 nm of diameter, 0.406 dispersion index, -37.3 ± 1.72 mV zeta potential and 82.67 ± 1.12 encapsulation efficiency are follow the slow releasing drug pattern. FTIR and AFM data demonstrated that there is no interaction between the extract and nanoliposomes and nanoliposomes have appropriate morphology. Finally, the results of the MTT assay confirmed the non-toxicity activity of nano-liposome.
Conclusion: In this study, physicochemical studies of nanosystems after loading Hedera Helix extract into liposomal nanosystems showed that the system is a slow-release and anionic type with acceptable size, morphology and acceptable encapsulation rate. The synthesized liposomes could be a suitable carrier for the Hedera Helix extract and increase its stability, solubility and thus improve its therapeutic performance.
Key words: liposome, slow-release, Hedera Helix extract encapsulation, viability rate, Iau Science.
سنتز و بررسی ویژگیهای سلولی و فیزیکوشیمیایی
نانولیپوزومهای حاوی عصاره آبی گیاه عشقه
میلاد اخلاقی1، لیدا افتخاری وش2، فاطمه پرنیان3، محمد طائبپور4، توحید رستمیان5، مریم زارع زاده مهریزی6، کاظم انصاری7، بی بی فاطمه حقیرالسادات*8
چکیده:
سابقه و هدف:استفاده از گیاهان درمانی با توجه به قیمت مناسب و در دسترس بودن آنها به شدت در حال افزایش است اما با چالش هایی از جمله حلالیت پایین در آب و نیمه عمر پایین در سیستم گردش خون رو به رو است. محققین با طراحی نانو حامل های دارویی مثل لیپوزوم سعی بر غلبه بر این چالش ها دارند. در این مطالعه، فرمولاسیونی از لیپوزومهای حاوی عصارهی گیاه عشقه ساخته و ویژگی های فیزیکوشیمیایی و سمیت آن بر روی سلولهای نرمال بررسی شد.
مواد و روش ها:در قدم اول، عصارهگیری از گیاه عشقه به روش سوکسله انجام گردید. در مرحلهی بعد، نانو لیپوزوم ها با روش فیلم نازک از فسفاتیدیل کولین و کلسترول تهیه و عصاره به صورت غیر فعال درون آنها بارگذاری گردید. سپس میزان لود عصاره و روند رهایش عصاره از سامانه با روش اسپکتروفتومتری، اندازهی نانو ذرات و پتانسیل زتای آنها به وسیلهی دستگاه زتا سایزر ، عدم بر هم کنش بین عصاره و سامانه به وسیلهی روش طیف سنجی مادون قرمز و مورفولوژی نانو ذرات نیز به وسیلهی میکروسکوپ نیروی اتمی مورد بررسی قرار گرفت و در آخر میزان سمیت سامانه بر روی سلولهای نرمال با روش MTT سنجیده شد.
یافته ها:بررسی نتایج این مطالعه نشان داد که بعد از عصاره گیری از گیاه عشقه و بارگذاری آنها درون نانو سیستم و مشخصه یابی آنها مشخص شد که نانو لیپوزومهای حاوی عصارهی عشقه با سایز nm 6/48 شاخص پراکندگی 406/. ، پتانسیل زتای mV 72/1 ±37/3- و راندمان بارگذاری 12/1 ±67/82 از نوع آهسته رهش میباشند. همچنین بررسی های FTIR و AFM نشان داد که میان عصاره و سامانه بر هم کنشی وجود ندارد و نانو لیپوزومها از نظر مورفولوژی طبیعی هستند. در آخر نیز نتایج تست MTT، عدم سمیت نانو لیپوزومها بر روی سلولهای نرمال را ثابت کرد.
بحث:در این پژوهش بررسیهای فیزیکوشیمیایی نانو سامانه بعد از بارگذاری عصارهی عشقه درون نانوسامانههای لیپوزومی نشان داد که سامانهی ساخته شده از نوع آهسته رهش و آنیونی بوده و با داشتن سایز، مورفولوژی مناسب و میزان درون گیری قابل قبول عصاره میتواند به عنوان حاملی مناسب برای عصارهی گیاه عشقه باشد و سبب افزایش پایداری، حلالیت و در نتیجه بهبود عملکرد آن گردد.
نتیجهگیری:سامانهی لیپوزومی سنتز شده میتواند به حاملی مناسب برای عصارهی عشقه باشد و در نتیجه باعث ارائهی رویکردی بهتر در مسیر بالینی استفاده از این گیاه به عنوان یک دارو و سیستم دارو رسانی نوین معرفی گردد.
واژههای کلیدی: لیپوزوم، آهسته رهش، انکپسولیشن عصارهی عشقه، میزان زندهمانی، .Iau Science
مقدمه:
Milad Akhlaghi1, Lida Eftekharivash2, Fatemeh Parnian3, Mohammad Taebpour4, Tohid Rostamian5, Mahbobeh Zarezadeh Mehrizi6, Kazem Ansari7, Bibi Fatemeh Haghirosadat8*
- MSc, Department of clinical biochemistry, Faculty of Medicine, Shahid Sadoughi University of Medical Sciences, Yazd, Iran
- Assistant Professor of Microbiology, Maragheh Branch, Islamic Azad University. Maragheh, Iran.
- MSc, Department of Medical Biotechnology, Shahid Sadoughi University of Medical Sciences, Yazd, Iran
- MSc, Depatment of Medical Biotechnology, Faculty of Medicine, Shahid Sadoughi University of Medical sciences, Yazd, Iran
- MSc, Department of clinical biochemistry, Faculty of Medicine, Shahid Sadoughi University of Medical Sciences, Yazd, Iran
- MD, Faculty of Dentistry, Shahid Sadoughi University of Medical Sciences, Yazd, Iran
- MD, Nano-Biotech Foresight Company Biotechnology Campus, Science & Technology Park of Yazd, Yazd, Iran
- Assistant Professor, Medical Nanotechnology & Tissue Engineering Research Center, Yazd Reproductive Sciences Institute, Shahid Sadoughi Uviverstity of Medical Sciences, Yazd, Iran
Email: Fhaghirosadat@gmail.com
Aim and background: The use of medical herbs because of their reasonable price and availability is rapidly increasing but it faces many challenges. Researchers are trying to overcome these challenges by designing nano-drug delivery carriers such as liposome. In this study, a formulation of liposomal system containing Hedera Helix extract was synthesized and its toxicity on normal cells and physicochemical characteristics were evaluated.
Material and Method: In the first step, extraction of Hedera Helix was done by succulent method. In the next step, nano-liposomes were prepared by thin film method from phosphatidylcholine and cholesterol and by using hydration inactive method the extract was loaded into them. Then the encapsulation rate and the release pattern were assayed by spectrophotometry method, the size of nanoparticles and their zeta potential were evaluated by the DLS, the non-interaction between the extract and the nanosystem was assessed by FT-IR technique and the morphology of the nanoparticles was examined by AFM microscope and finally the non-toxicity of the system on normal cells was assayed by MTT method.
Results: The results of this study showed that nano-liposomes containing Hedera Helix extract having 48.6 nm of diameter, 0.406 dispersion index, -37.3 ± 1.72 mV zeta potential and 82.67 ± 1.12 encapsulation efficiency are follow the slow releasing drug pattern. FTIR and AFM data demonstrated that there is no interaction between the extract and nanoliposomes and nanoliposomes have appropriate morphology. Finally, the results of the MTT assay confirmed the non-toxicity activity of nano-liposome.
Conclusion: In this study, physicochemical studies of nanosystems after loading Hedera Helix extract into liposomal nanosystems showed that the system is a slow-release and anionic type with acceptable size, morphology and acceptable encapsulation rate. The synthesized liposomes could be a suitable carrier for the Hedera Helix extract and increase its stability, solubility and thus improve its therapeutic performance.
Key words: liposome, slow-release, Hedera Helix extract encapsulation, viability rate, Iau Science.
سنتز و بررسی ویژگیهای سلولی و فیزیکوشیمیایی
نانولیپوزومهای حاوی عصاره آبی گیاه عشقه
میلاد اخلاقی1، لیدا افتخاری وش2، فاطمه پرنیان3، محمد طائبپور4، توحید رستمیان5، مریم زارع زاده مهریزی6، کاظم انصاری7، بی بی فاطمه حقیرالسادات*8
- گروه بیوشیمی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی و خدمات درمانی شهید صدوقی یزد، یزد، ایران
- گروه میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد مراغه، مراغه، ایران
- گروه زیست فناوری، پردیس بین الملل دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد، یزد، ایران
- گروه زیست فناوری، پردیس بین الملل دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد، یزد، ایران
- گروه بیوشیمی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی و خدمات درمانی شهید صدوقی یزد، یزد، ایران
- دانشکده دندان پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی و خدمات درمانی شهید صدوقی یزد، یزد، ایران
- پزشکی عمومی، شرکت ریز فناوران فردانگر، مرکز زیست فناوری، پارک علم و فناوری، یزد، ایران
- مرکز تحقیقات نانوتکنولوژی و مهندسی بافت، پژوهشکدهی علوم تولید مثل، دانشگاه علوم پزشکی و خدمات درمانی شهید صدوقی یزد، یزد، ایران
سابقه و هدف:استفاده از گیاهان درمانی با توجه به قیمت مناسب و در دسترس بودن آنها به شدت در حال افزایش است اما با چالش هایی از جمله حلالیت پایین در آب و نیمه عمر پایین در سیستم گردش خون رو به رو است. محققین با طراحی نانو حامل های دارویی مثل لیپوزوم سعی بر غلبه بر این چالش ها دارند. در این مطالعه، فرمولاسیونی از لیپوزومهای حاوی عصارهی گیاه عشقه ساخته و ویژگی های فیزیکوشیمیایی و سمیت آن بر روی سلولهای نرمال بررسی شد.
مواد و روش ها:در قدم اول، عصارهگیری از گیاه عشقه به روش سوکسله انجام گردید. در مرحلهی بعد، نانو لیپوزوم ها با روش فیلم نازک از فسفاتیدیل کولین و کلسترول تهیه و عصاره به صورت غیر فعال درون آنها بارگذاری گردید. سپس میزان لود عصاره و روند رهایش عصاره از سامانه با روش اسپکتروفتومتری، اندازهی نانو ذرات و پتانسیل زتای آنها به وسیلهی دستگاه زتا سایزر ، عدم بر هم کنش بین عصاره و سامانه به وسیلهی روش طیف سنجی مادون قرمز و مورفولوژی نانو ذرات نیز به وسیلهی میکروسکوپ نیروی اتمی مورد بررسی قرار گرفت و در آخر میزان سمیت سامانه بر روی سلولهای نرمال با روش MTT سنجیده شد.
یافته ها:بررسی نتایج این مطالعه نشان داد که بعد از عصاره گیری از گیاه عشقه و بارگذاری آنها درون نانو سیستم و مشخصه یابی آنها مشخص شد که نانو لیپوزومهای حاوی عصارهی عشقه با سایز nm 6/48 شاخص پراکندگی 406/. ، پتانسیل زتای mV 72/1 ±37/3- و راندمان بارگذاری 12/1 ±67/82 از نوع آهسته رهش میباشند. همچنین بررسی های FTIR و AFM نشان داد که میان عصاره و سامانه بر هم کنشی وجود ندارد و نانو لیپوزومها از نظر مورفولوژی طبیعی هستند. در آخر نیز نتایج تست MTT، عدم سمیت نانو لیپوزومها بر روی سلولهای نرمال را ثابت کرد.
بحث:در این پژوهش بررسیهای فیزیکوشیمیایی نانو سامانه بعد از بارگذاری عصارهی عشقه درون نانوسامانههای لیپوزومی نشان داد که سامانهی ساخته شده از نوع آهسته رهش و آنیونی بوده و با داشتن سایز، مورفولوژی مناسب و میزان درون گیری قابل قبول عصاره میتواند به عنوان حاملی مناسب برای عصارهی گیاه عشقه باشد و سبب افزایش پایداری، حلالیت و در نتیجه بهبود عملکرد آن گردد.
نتیجهگیری:سامانهی لیپوزومی سنتز شده میتواند به حاملی مناسب برای عصارهی عشقه باشد و در نتیجه باعث ارائهی رویکردی بهتر در مسیر بالینی استفاده از این گیاه به عنوان یک دارو و سیستم دارو رسانی نوین معرفی گردد.
واژههای کلیدی: لیپوزوم، آهسته رهش، انکپسولیشن عصارهی عشقه، میزان زندهمانی، .Iau Science
استفاده از گیاهان دارویی در جهان به دلیل عوارض جانبی کم و در دسترس بودن آنها به شدت در حال افزایش است و ایران نیز به عنوان کشوری با تنوع گیاهی فراوان و همچنین تاریخ غنی در استفاده از گیاهان دارویی از جمله کشورهایی است که مصرف گیاهان دارویی در آن رواج دارد (1). استفاده از گیاهان دارویی با وجود پیشرفتهای زیاد در ساخت داروهای شیمیایی همچنان بسیار مورد توجه هستند، به طوری که جزیی جدایی ناپذیر از سیستم درمانی بسیاری از کشورها شده اند (2).
گیاه عشقه با نام معمول Ivy، از جمله گیاهانی با خواص درمانی فراوان است که در درمان بسیاری از بیماریها کاربرد دارد. عشقه با نام علمی Hedera Helix و از خانواده ی Araliacease است. این گیاه از جمله گیاهان پیچکی و همیشه سبز است که در بیشتر نقاط جهان پیدا میشود (3). گیاه عشقه دارای ساقه ای چوبی است که در هنگام برش عرضی ساقهی آن، از داخل به خارج به ترتیب استوانه ی مرکزی، درون پوست، بافت پارانشیم، بافت کلانشیم و روپوست دیده میشود (4). عشقه دارای برگهایی تناوبی، توپر و با رویه ای چرمی شکل است (5). از این گیاه برای درمان بسیاری از بیماریها استفاده میشود. برگهای این گیاه دارای خاصیت ضد التهابی و ضد درد هستند (6). همچنین در ترکیه از جوشاندهی برگهای عشقه برای درمان بیماران دیابتی استفاده میکنند (7). این گیاه همچنین دارای اثر درمانی بر روی سلول های بافت تنفسی است و از آن در درمان سرماخوردگی همراه با سرفههای خشک، برونشیت و آسم نیز استفاده میشود (8). خاصیت ضد افسردگی، ضد قارچی و کرمکشی نیز از جمله ویژگیهای این گیاه است (9, 10). در آنالیزهای فیتوشیمیایی این گیاه مشخص شده که در عصارهی این گیاه ترکیبات شیمیایی نظیر استرولهای اشباع نشده، تانن، ساپونینها، آلکالوئیدها و فلاونوئیدها وجود دارد که میتوان برخی از ویژگیهای این گیاه همچون خاصیت آنتی اکسیدانی و ضد توموری آن را به این ترکیبات نسبت داد (11).
در میان تمام مزایای استفاده از گیاهان دارویی از جمله در دسترس بودن و ارزان بودن آنها (12) استفاده از این گیاهان و عصارههای آنها، با چالش هایی نظیر اکسید شدن برخی از مواد موثر موجود در عصاره، اثر گذاری نامناسب بر بافت هدف و ناپایداری این ترکیبات در شرایط طبیعی بدن انسان، رو به رو است. لذا، علم نانو با ساخت نانو ذرههای با خاصیت حمل داروها و بهبود عملکرد آنها مانند لیپوزوم و نیوزوم سعی بر غلبه یا کاهش این مشکلات دارد (13, 14).
در بین نانو ذرههای حامل دارو، توجه و استفاده از لیپوزومها، که ویزیکولهای چند لایه ی، ساخته شده از ترکیبات لیپیدی هستند به شدت در حال افزایش است (15). این ذرات دارای توانایی بارگذاری ترکیبات لیپوفیل در بین لایه های لیپیدی خود و ترکیبات هیدروفیل در فضاهای میان مایعی خود هستند. از جمله مزیتهای استفاده از این ترکیبات میتوان به محافظت از ترکیبات فعال به وسیله ی لایههای لیپیدی موجود در ساختمان لیپوزومها، اثر گذاری بالا و سمیت پایین ، رها سازی آهسته دارو، سازگاری زیستی مناسب و هدف درمانی (Target therapy) آنها اشاره کرد، که همین مزایا سبب جلب توجه محققین در ساخت و استفاده از این ترکیبات در دهههای اخیر شده است (15, 16).
لیپوزومها برای اولین بار در سال 1960 و توسط بنگام ( Alec Bangham ) کشف شدند (17). در ابتدا از لیپوزومها برای مطالعه و بررسی ساختار غشاهای زیستی مثل جهت گیری لیپیدها در غشای سلولی، انتقال یونها از میان غشای سلول و شناخت ویژگیهای فیزیکوشیمیایی غشا استفاده میشد (18)، اما امروزه از این نانو ذرهها به دلیل داشتن ویژگیهای مناسب و سازگار به عنوان حاملهای دارویی در درمان بسیاری از بیماریها استفاده میشود (19). فسفولیپیدها و کلسترول از اصلیترین اجزا ساختمان لیپوزومها هستند (20). غلظت مولی فسفولیپیدها در ساختمان لیپوزومها متفاوت است و به طور معمول بین 50 تا 70% ساختمان لیپوزومها را شامل میشوند. فسفاتیدیل کولین ( SPC )، رایجترین فسفولیپیدی است که در ساخت لیپوزومها از آن استفاده میشود. کلسترول نیز بین 30 تا 45 درصد ساختمان لیپوزومها را شامل میشود و سبب ایجاد ثبات و پایداری در بین لایههای لیپوزوم میگردد (21).
با توجه به خواص درمانی ثابت شدهی گیاه عشقه و مزایای گستردهی لیپوزومها به عنوان حاملهای دارویی، هدف از مطالعهی حاضر، طراحی، سنتز و مشخصه یابی سامانهی لیپوزومی حاوی عصارهی گیاه عشقه و بررسی عدم سمیت لیپوزومهای فاقد عصاره بر روی سلولهای نرمال است.
روش کار:
عصاره گیری
برای به دست آوردن عصارهی گیاه عشقه ابتدا این گیاه در پاییز سال 1399 از شهرستان یزد جمع آوری شد و نوع گونهی آن به تایید متخصصین منابع طبیعی دانشگاه یزد رسید. پس از شستشو، خشک کردن برگهای گیاه به دور از نور خورشید و در سایه انجام گرفت. پس از خشک شدن، برگها توسط آسیاب برقی پودر شدند. سپس 20 گرم از پودر حاصله را به 100 میلی لیتر آب مقطر اضافه و به مدت 4 ساعت در دمای اتاق (24 درجه سانتی گراد) قرار گرفت. برای فیلتراسیون از فیلتر پارچهایی استفاده شد، محتویات ظرف را در پارچه ریخته و مایع خارج شده از پارچه را جمعآوری گردید. بعد از آن سانتریفیوژ مایع با سرعت 3000 دور بر دقیقه و به مدت 5 دقیقه انجام گرفت و به یک پلیت شیشه ایی منتقل شد. به منظور تبخیر آب کامل مایع، پلیت برای 72 ساعت در انکوباتور با دمای 37 درجهی سانتی گراد قرار داده شد.
تعیین طول موج ماکزیموم و رسم منحنی استاندارد
برای به دست آوردن طول موج ماکزیموم از روش اسپکتروفوتومتری استفاده شد. ابتدا استوک عصارهی عشقه در حلالهای PBS و ایزوپروپیل تهیه و با استفاده از آن رقتهای مختلفی از عصاره ساخته شد. سپس جذبها در بازهی 200 تا 800 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتری ( Epoch، آمریکا ) خوانش و طیف جذبی برای تمامی غلظتها رسم گردید. طول موجی که بیشترین میزان جذب در تمامی غلظتها را داشت به عنوان طول موج ماکزیموم انتخاب شد. برای رسم منحنی استاندارد، غلظتهای متفاوتی از عصاره در حلال های ایزوپروپیل ( Merck، آلمان ) و PBS ( Sigma، آمریکا ) تهیه گردید. جذب نوری آنها در طول موج ماکزیموم و با سه بار تکرار خوانش و سپس منحنی استاندار رسم و معادلهی خط آن نیز محاسبه گردید.
سنتز سامانه لیپوزومی حاوی عصاره ی عشقه
به منظور ساخت لیپوزومهای حاوی عصاره عشقه از روش آب پوشانی لایه نازک استفاده گردید. ابتدا فسفاتیدیل کولین ( Merk، آلمان ) ( 70% )، کلسترول ( Merk، آلمان ) ( 30% ) و عصاره گیاه عشقه ( 2 میلی گرم ) در درمای 45 درجهی سانتیگراد و به وسیلهی روتاری ( هایدولف، آلمان) با دور rpm 150 در حلال کلروفورم حل گردیدند و سپس فیلم نازک خشک، تحت شرایط خلاء تهیه گردید. عمل هیدراته کردن نیز با اضافه کردن آب مقطر استریل به مدت 60 دقیقه و در دمای 50 درجهی سانتیگراد انجام گرفت و بعد از آن نانو ذرههای ساخته شده به منظور کاهش سایز در سونیکیت حمامی به مدت 60 دقیقه با توان اولتراسونیک 100 وات و فرکانس 28 ± 5% کیلو هرتز قرار گرفتند (22).
مشخصه یابی نانو لیپوزومهای سنتز شده
ویژگیهای فیزیکوشیمیایی نانو لیپوزومهای سنتز شده شامل مقدار عصارهی بارگذاری شده، اندازه و پتانسیل زتا ، مورفولوژی و رهایش دارو مورد بررسی قرار گرفت.
تعیین میزان عصاره ی بار گذاری شده
برای تعیین درصد بارگذاری عصاره در لیپوزوم ابتدا باید عصارههای آزاد و بارگیری نشده حذف میگردیدند که برای این منظور از روش جداسازی به وسیلهی کیسه دیالیز در دمای 4 درجه ی سانتی گراد استفاده گردید. سپس لیپوزومهای ساخته شده را با ایزوپروپیل به نسبتهای10/ 1، 20/1 و 40/1 مخلوط کرده تا دیوارهی لیپیدی اطراف عصاره شکسته و عصارهی عشقه آزاد گردد. سپس میزان جذب عصارهی انکپسوله شده با استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتری و در طول موج ماکزیموم عصاره تعیین گردید و در پایان با استفاده از منحنی استاندارد به دست آمده و رابطه ی (1) درصد بارگذاری عصارهی عشقه در لیپوزوم محاسبه گردید (22).
رابطهی 1)
× 100 = درصد عصارهی بارگذاری شده
تعیین اندازهی نانو ذرات و ضریب پراکندگی
محدودهی توزیع اندازهی ذرات و همچنین پیک اندازهی ذرات با استفاده از تکنیک تفرق دینامیکی نور ((DLS تعیین گردید. این روش تکنیکی است برای اندازهگیری ذرات محلول، با اندازهی در محدودهی میکرومتر تا نانومتر، که به این منظور از دستگاه نانو سایزر ( Malvern Instrument مدل Nano zeta sizer ES، انگلستان ) استفاده شد. همچنین برای برای تعیین میزان بار سطحی یا همان پتانسیل زتا (Zeta-Potential) که نشان دهندهی باری است که یک ذره در محیطی خاص کسب میکند از دستگاه زتا سایزر ( شرکت Malvern Instrument مدل Nano-zeta sizer ES، انگلستان) در دمای 25 درجهی سانتی گراد استفاده شد. پتانسیل زتا، پارامتری مناسب جهت نمایش میان کشش مغناطیسی بین ذرات است.
اندازه گیری سایز و بار سطحی نانولیپوزومها در دمای 25 درجه سانتی گراد و با تابش نور لیزر با طول موج nm 657 تحت زاویه زاویهی 90 درجه انجام گردید. آزمایشات این مرحله با سه بار تکرار و مدت زمان تقریبی 30 ثانیه برای هر تکرار انجام گرفت. برای اندازهگیری بار سطحی نانولیپوزومها از µL 1500 نمونه با غلظت mg/mL 1/0 و برای اندازهگیری سایز ذرات از µL 600 نمونه با غلظتهای mg/mL 5/0 تا 1/0 استفاده گردید.
بررسی مورفولوژی نانو ذرات
بهترین روش جهت اطمینان یافتن از شکل و ساختار نانو ذرات، مشاهدهی میکروسکوپی است. در این مطالعه از میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM) برای بررسی مورفولوژی نانو لیپیدهای سنتز شده از نظر شکل، یکنواختی و زبری استفاده گردید. از میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM) برای بررسی نمونهها با ابعادی در محدودهی نانومتر و همچنین بررسی توپوگرافی سطحی آنان استفاده میگردد. این میکروسکوپ مجهز به سوزنی نوک تیز سیلیکونی با قطر کمتر از 10 نانومتر و طول 2 میکرون است که بر روی اهرمی قرار دارد و در اثر نیروی بین نمونه و سوزن اهرم خم میشود و انعکاس نور لیزر بر روی آشکارساز جابهجا میگردد که از روی این جا به جایی میتوان نیروی بر هم کنش بین سوزن و سطح نمونه را به دست آورد. به منظور آماده سازی نمونه جهت عکس برداری با AFM، ابتدا سوسپانسونی از نمونه با آب با غلظت mg/mL 1/0 ساخته شد. سپس به کمک ورقه های تازه برش خورده از جنس میکا یک دسته نوار چسبیده به هم ایجاد گردید. یک قطره از سوسپانسیون بر روی میکا ریخته و بعد از 5 دقیقه با جریان ثابتی از هوا قطره از روی سطح پاک گردید و بعد از آن عکس برداری انجام شد.
بررسی سامانه ی لیپوزومی توسط دستگاه طیف سنجی مادون قرمز ( FTIR)
جهت بررسی وجود و یا عدم وجود برهم کنش بین سامانه وعصارهی عشقه، سامانهی لیپیدی فاقد عصاره و لیپوزومهای حاوی عصاره با استفاده از دستگاه اسپکترومتر FTIR ( Brucker، آلمان ) مورد بررسی قرار گرفتند. برای این منظور نمونهها با نمک پتاسیم بروماید ( KBr ) مخلوط و فشرده شدند. طیف مادون قرمز در محدوده ی طول موج 4000 – 400 cm-1 برای بررسی گروههای عاملی مورد سنجش قرار گرفت. سپس طیف FTIR لیپوزومهای فاقد عصاره و حاوی عصاره با یکدیگر مقایسه شدند.
بررسی روند رهایش دارو
برای بررسی روند رهاسازی دارو از حامل دارویی در محیط آزمایشگاهی از روش کیسه دیالیز و در شرایط فیزیولوژیک بدن (دمای 37 درجه سانتی گراد و 4/7 pH) به مدت 48 ساعت استفاده شد. در این روش مقدار 1 میلیلیتر ازلیپوزومهای حاوی عصارهی عشقه را درون کیسهی دیالیز ریخته و سپس کیسهی دیالیز را در یک محیط ایزوله حاوی بافر PBS استیرر شد. سپس در فواصل زمانی نیم، 1، 2، 3، 6، 9، 12، 24، 36 و 48 ساعته مقدار مشخصی از بافر PBS اطراف کیسه را برداشته و مقدار جذب آنها به وسیلهی دستگاه اسپکتروفوتومتر و طول موج ماکزیموم ( nm 320 ( مشخص گردید. لازم به ذکر است که در هر مرحله به همان میزان بافر استفاده شده، بافر جدید هم دما جایگزین آن گردید. در آخر با استفاده از منحنی کالیبراسیون به دست آمده در PBS در دما و pH ذکر شده میزان رهایش دارو را در زمانهای مختلف، حساب و نمودار آن را رسم شد (22, 23).
تعیین سمیت سامانه و محاسبه درصد زنده مانی
کشت سلول
سلولهای نرمال ردهی فیبروبلاست انسان ( HFF ) از انسیتوی پاستور تهران تهیه شد. سلولها درون فلاسکهای 75 میلیلیتری در محیط کشت 1640 RPMI غنی شده با L-گلوتامین (2 mM) به همراه سرم گاوی 10% (Fetal bovine serum)، 1% پنی سیلین - استرپتومایسین ( U/mL 100 پنی‌سیلین و µg/mL 100 استرپتومایسین) در انکوباتور با دمای 37 درجهی سانتیگراد، CO2 5% و رطوبت 95% کشت داده شدند.
تعیین سمیت سلولی و زنده مانی
برای بررسی سمیت سلولی از روش MTT استفاده شد. برای انجام این کار ابتدا سلولهای نرمال HFF به مدت 48 ساعت با غلظت 104 در هر چاهک در پلیت 96 تایی کشت داده شدند. سپس به منظور سنجش عدم سمیت نانو سامانهی سنتز شده، لیپوزومهای بدون عصاره را با غلظتهای 1/0، 1، 10، 100 و 1000 برای 48 ساعت بر سلولها اثر داده شد.
بعد از آن 20 میکرولیتراز نمک MTT را به هر چاهک اضافه و برای 4 ساعت انکوباسیون انجام گرفت، سپس 150 میکرولیتر DMSO را جهت حل کردن کریستالهای فورمازان اضافه و به وسیلهی دستگاه الایزا ریدر جذبها را در طول موج 570 نانومتر خوانش و با استفاده از رابطه ی 2 درصد زنده مانی سلول ها را محاسبه کردیم .
رابطه ی 2)
× 100
یافته ها:
تعیین طول موج ماکسیمم و تهیه منحنی استاندارد عصارهی عشقه
طیف جذبی گیاه عشقه در بازهی 200 تا 700 نانومتر به وسیلهی دستگاه اسپکتروفوتومتر تهیه و رسم گردید ( نمودار 1). بررسیهای حاصل از این طیف جذبی نشان داد که عصارهی گیاه عشقه در طول موج nm 320 بیشترین جذب را دارد.
گیاه عشقه با نام معمول Ivy، از جمله گیاهانی با خواص درمانی فراوان است که در درمان بسیاری از بیماریها کاربرد دارد. عشقه با نام علمی Hedera Helix و از خانواده ی Araliacease است. این گیاه از جمله گیاهان پیچکی و همیشه سبز است که در بیشتر نقاط جهان پیدا میشود (3). گیاه عشقه دارای ساقه ای چوبی است که در هنگام برش عرضی ساقهی آن، از داخل به خارج به ترتیب استوانه ی مرکزی، درون پوست، بافت پارانشیم، بافت کلانشیم و روپوست دیده میشود (4). عشقه دارای برگهایی تناوبی، توپر و با رویه ای چرمی شکل است (5). از این گیاه برای درمان بسیاری از بیماریها استفاده میشود. برگهای این گیاه دارای خاصیت ضد التهابی و ضد درد هستند (6). همچنین در ترکیه از جوشاندهی برگهای عشقه برای درمان بیماران دیابتی استفاده میکنند (7). این گیاه همچنین دارای اثر درمانی بر روی سلول های بافت تنفسی است و از آن در درمان سرماخوردگی همراه با سرفههای خشک، برونشیت و آسم نیز استفاده میشود (8). خاصیت ضد افسردگی، ضد قارچی و کرمکشی نیز از جمله ویژگیهای این گیاه است (9, 10). در آنالیزهای فیتوشیمیایی این گیاه مشخص شده که در عصارهی این گیاه ترکیبات شیمیایی نظیر استرولهای اشباع نشده، تانن، ساپونینها، آلکالوئیدها و فلاونوئیدها وجود دارد که میتوان برخی از ویژگیهای این گیاه همچون خاصیت آنتی اکسیدانی و ضد توموری آن را به این ترکیبات نسبت داد (11).
در میان تمام مزایای استفاده از گیاهان دارویی از جمله در دسترس بودن و ارزان بودن آنها (12) استفاده از این گیاهان و عصارههای آنها، با چالش هایی نظیر اکسید شدن برخی از مواد موثر موجود در عصاره، اثر گذاری نامناسب بر بافت هدف و ناپایداری این ترکیبات در شرایط طبیعی بدن انسان، رو به رو است. لذا، علم نانو با ساخت نانو ذرههای با خاصیت حمل داروها و بهبود عملکرد آنها مانند لیپوزوم و نیوزوم سعی بر غلبه یا کاهش این مشکلات دارد (13, 14).
در بین نانو ذرههای حامل دارو، توجه و استفاده از لیپوزومها، که ویزیکولهای چند لایه ی، ساخته شده از ترکیبات لیپیدی هستند به شدت در حال افزایش است (15). این ذرات دارای توانایی بارگذاری ترکیبات لیپوفیل در بین لایه های لیپیدی خود و ترکیبات هیدروفیل در فضاهای میان مایعی خود هستند. از جمله مزیتهای استفاده از این ترکیبات میتوان به محافظت از ترکیبات فعال به وسیله ی لایههای لیپیدی موجود در ساختمان لیپوزومها، اثر گذاری بالا و سمیت پایین ، رها سازی آهسته دارو، سازگاری زیستی مناسب و هدف درمانی (Target therapy) آنها اشاره کرد، که همین مزایا سبب جلب توجه محققین در ساخت و استفاده از این ترکیبات در دهههای اخیر شده است (15, 16).
لیپوزومها برای اولین بار در سال 1960 و توسط بنگام ( Alec Bangham ) کشف شدند (17). در ابتدا از لیپوزومها برای مطالعه و بررسی ساختار غشاهای زیستی مثل جهت گیری لیپیدها در غشای سلولی، انتقال یونها از میان غشای سلول و شناخت ویژگیهای فیزیکوشیمیایی غشا استفاده میشد (18)، اما امروزه از این نانو ذرهها به دلیل داشتن ویژگیهای مناسب و سازگار به عنوان حاملهای دارویی در درمان بسیاری از بیماریها استفاده میشود (19). فسفولیپیدها و کلسترول از اصلیترین اجزا ساختمان لیپوزومها هستند (20). غلظت مولی فسفولیپیدها در ساختمان لیپوزومها متفاوت است و به طور معمول بین 50 تا 70% ساختمان لیپوزومها را شامل میشوند. فسفاتیدیل کولین ( SPC )، رایجترین فسفولیپیدی است که در ساخت لیپوزومها از آن استفاده میشود. کلسترول نیز بین 30 تا 45 درصد ساختمان لیپوزومها را شامل میشود و سبب ایجاد ثبات و پایداری در بین لایههای لیپوزوم میگردد (21).
با توجه به خواص درمانی ثابت شدهی گیاه عشقه و مزایای گستردهی لیپوزومها به عنوان حاملهای دارویی، هدف از مطالعهی حاضر، طراحی، سنتز و مشخصه یابی سامانهی لیپوزومی حاوی عصارهی گیاه عشقه و بررسی عدم سمیت لیپوزومهای فاقد عصاره بر روی سلولهای نرمال است.
روش کار:
عصاره گیری
برای به دست آوردن عصارهی گیاه عشقه ابتدا این گیاه در پاییز سال 1399 از شهرستان یزد جمع آوری شد و نوع گونهی آن به تایید متخصصین منابع طبیعی دانشگاه یزد رسید. پس از شستشو، خشک کردن برگهای گیاه به دور از نور خورشید و در سایه انجام گرفت. پس از خشک شدن، برگها توسط آسیاب برقی پودر شدند. سپس 20 گرم از پودر حاصله را به 100 میلی لیتر آب مقطر اضافه و به مدت 4 ساعت در دمای اتاق (24 درجه سانتی گراد) قرار گرفت. برای فیلتراسیون از فیلتر پارچهایی استفاده شد، محتویات ظرف را در پارچه ریخته و مایع خارج شده از پارچه را جمعآوری گردید. بعد از آن سانتریفیوژ مایع با سرعت 3000 دور بر دقیقه و به مدت 5 دقیقه انجام گرفت و به یک پلیت شیشه ایی منتقل شد. به منظور تبخیر آب کامل مایع، پلیت برای 72 ساعت در انکوباتور با دمای 37 درجهی سانتی گراد قرار داده شد.
تعیین طول موج ماکزیموم و رسم منحنی استاندارد
برای به دست آوردن طول موج ماکزیموم از روش اسپکتروفوتومتری استفاده شد. ابتدا استوک عصارهی عشقه در حلالهای PBS و ایزوپروپیل تهیه و با استفاده از آن رقتهای مختلفی از عصاره ساخته شد. سپس جذبها در بازهی 200 تا 800 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتری ( Epoch، آمریکا ) خوانش و طیف جذبی برای تمامی غلظتها رسم گردید. طول موجی که بیشترین میزان جذب در تمامی غلظتها را داشت به عنوان طول موج ماکزیموم انتخاب شد. برای رسم منحنی استاندارد، غلظتهای متفاوتی از عصاره در حلال های ایزوپروپیل ( Merck، آلمان ) و PBS ( Sigma، آمریکا ) تهیه گردید. جذب نوری آنها در طول موج ماکزیموم و با سه بار تکرار خوانش و سپس منحنی استاندار رسم و معادلهی خط آن نیز محاسبه گردید.
سنتز سامانه لیپوزومی حاوی عصاره ی عشقه
به منظور ساخت لیپوزومهای حاوی عصاره عشقه از روش آب پوشانی لایه نازک استفاده گردید. ابتدا فسفاتیدیل کولین ( Merk، آلمان ) ( 70% )، کلسترول ( Merk، آلمان ) ( 30% ) و عصاره گیاه عشقه ( 2 میلی گرم ) در درمای 45 درجهی سانتیگراد و به وسیلهی روتاری ( هایدولف، آلمان) با دور rpm 150 در حلال کلروفورم حل گردیدند و سپس فیلم نازک خشک، تحت شرایط خلاء تهیه گردید. عمل هیدراته کردن نیز با اضافه کردن آب مقطر استریل به مدت 60 دقیقه و در دمای 50 درجهی سانتیگراد انجام گرفت و بعد از آن نانو ذرههای ساخته شده به منظور کاهش سایز در سونیکیت حمامی به مدت 60 دقیقه با توان اولتراسونیک 100 وات و فرکانس 28 ± 5% کیلو هرتز قرار گرفتند (22).
مشخصه یابی نانو لیپوزومهای سنتز شده
ویژگیهای فیزیکوشیمیایی نانو لیپوزومهای سنتز شده شامل مقدار عصارهی بارگذاری شده، اندازه و پتانسیل زتا ، مورفولوژی و رهایش دارو مورد بررسی قرار گرفت.
تعیین میزان عصاره ی بار گذاری شده
برای تعیین درصد بارگذاری عصاره در لیپوزوم ابتدا باید عصارههای آزاد و بارگیری نشده حذف میگردیدند که برای این منظور از روش جداسازی به وسیلهی کیسه دیالیز در دمای 4 درجه ی سانتی گراد استفاده گردید. سپس لیپوزومهای ساخته شده را با ایزوپروپیل به نسبتهای10/ 1، 20/1 و 40/1 مخلوط کرده تا دیوارهی لیپیدی اطراف عصاره شکسته و عصارهی عشقه آزاد گردد. سپس میزان جذب عصارهی انکپسوله شده با استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتری و در طول موج ماکزیموم عصاره تعیین گردید و در پایان با استفاده از منحنی استاندارد به دست آمده و رابطه ی (1) درصد بارگذاری عصارهی عشقه در لیپوزوم محاسبه گردید (22).
رابطهی 1)
× 100 = درصد عصارهی بارگذاری شده تعیین اندازهی نانو ذرات و ضریب پراکندگی
محدودهی توزیع اندازهی ذرات و همچنین پیک اندازهی ذرات با استفاده از تکنیک تفرق دینامیکی نور ((DLS تعیین گردید. این روش تکنیکی است برای اندازهگیری ذرات محلول، با اندازهی در محدودهی میکرومتر تا نانومتر، که به این منظور از دستگاه نانو سایزر ( Malvern Instrument مدل Nano zeta sizer ES، انگلستان ) استفاده شد. همچنین برای برای تعیین میزان بار سطحی یا همان پتانسیل زتا (Zeta-Potential) که نشان دهندهی باری است که یک ذره در محیطی خاص کسب میکند از دستگاه زتا سایزر ( شرکت Malvern Instrument مدل Nano-zeta sizer ES، انگلستان) در دمای 25 درجهی سانتی گراد استفاده شد. پتانسیل زتا، پارامتری مناسب جهت نمایش میان کشش مغناطیسی بین ذرات است.
اندازه گیری سایز و بار سطحی نانولیپوزومها در دمای 25 درجه سانتی گراد و با تابش نور لیزر با طول موج nm 657 تحت زاویه زاویهی 90 درجه انجام گردید. آزمایشات این مرحله با سه بار تکرار و مدت زمان تقریبی 30 ثانیه برای هر تکرار انجام گرفت. برای اندازهگیری بار سطحی نانولیپوزومها از µL 1500 نمونه با غلظت mg/mL 1/0 و برای اندازهگیری سایز ذرات از µL 600 نمونه با غلظتهای mg/mL 5/0 تا 1/0 استفاده گردید.
بررسی مورفولوژی نانو ذرات
بهترین روش جهت اطمینان یافتن از شکل و ساختار نانو ذرات، مشاهدهی میکروسکوپی است. در این مطالعه از میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM) برای بررسی مورفولوژی نانو لیپیدهای سنتز شده از نظر شکل، یکنواختی و زبری استفاده گردید. از میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM) برای بررسی نمونهها با ابعادی در محدودهی نانومتر و همچنین بررسی توپوگرافی سطحی آنان استفاده میگردد. این میکروسکوپ مجهز به سوزنی نوک تیز سیلیکونی با قطر کمتر از 10 نانومتر و طول 2 میکرون است که بر روی اهرمی قرار دارد و در اثر نیروی بین نمونه و سوزن اهرم خم میشود و انعکاس نور لیزر بر روی آشکارساز جابهجا میگردد که از روی این جا به جایی میتوان نیروی بر هم کنش بین سوزن و سطح نمونه را به دست آورد. به منظور آماده سازی نمونه جهت عکس برداری با AFM، ابتدا سوسپانسونی از نمونه با آب با غلظت mg/mL 1/0 ساخته شد. سپس به کمک ورقه های تازه برش خورده از جنس میکا یک دسته نوار چسبیده به هم ایجاد گردید. یک قطره از سوسپانسیون بر روی میکا ریخته و بعد از 5 دقیقه با جریان ثابتی از هوا قطره از روی سطح پاک گردید و بعد از آن عکس برداری انجام شد.
بررسی سامانه ی لیپوزومی توسط دستگاه طیف سنجی مادون قرمز ( FTIR)
جهت بررسی وجود و یا عدم وجود برهم کنش بین سامانه وعصارهی عشقه، سامانهی لیپیدی فاقد عصاره و لیپوزومهای حاوی عصاره با استفاده از دستگاه اسپکترومتر FTIR ( Brucker، آلمان ) مورد بررسی قرار گرفتند. برای این منظور نمونهها با نمک پتاسیم بروماید ( KBr ) مخلوط و فشرده شدند. طیف مادون قرمز در محدوده ی طول موج 4000 – 400 cm-1 برای بررسی گروههای عاملی مورد سنجش قرار گرفت. سپس طیف FTIR لیپوزومهای فاقد عصاره و حاوی عصاره با یکدیگر مقایسه شدند.
بررسی روند رهایش دارو
برای بررسی روند رهاسازی دارو از حامل دارویی در محیط آزمایشگاهی از روش کیسه دیالیز و در شرایط فیزیولوژیک بدن (دمای 37 درجه سانتی گراد و 4/7 pH) به مدت 48 ساعت استفاده شد. در این روش مقدار 1 میلیلیتر ازلیپوزومهای حاوی عصارهی عشقه را درون کیسهی دیالیز ریخته و سپس کیسهی دیالیز را در یک محیط ایزوله حاوی بافر PBS استیرر شد. سپس در فواصل زمانی نیم، 1، 2، 3، 6، 9، 12، 24، 36 و 48 ساعته مقدار مشخصی از بافر PBS اطراف کیسه را برداشته و مقدار جذب آنها به وسیلهی دستگاه اسپکتروفوتومتر و طول موج ماکزیموم ( nm 320 ( مشخص گردید. لازم به ذکر است که در هر مرحله به همان میزان بافر استفاده شده، بافر جدید هم دما جایگزین آن گردید. در آخر با استفاده از منحنی کالیبراسیون به دست آمده در PBS در دما و pH ذکر شده میزان رهایش دارو را در زمانهای مختلف، حساب و نمودار آن را رسم شد (22, 23).
تعیین سمیت سامانه و محاسبه درصد زنده مانی
کشت سلول
سلولهای نرمال ردهی فیبروبلاست انسان ( HFF ) از انسیتوی پاستور تهران تهیه شد. سلولها درون فلاسکهای 75 میلیلیتری در محیط کشت 1640 RPMI غنی شده با L-گلوتامین (2 mM) به همراه سرم گاوی 10% (Fetal bovine serum)، 1% پنی سیلین - استرپتومایسین ( U/mL 100 پنی‌سیلین و µg/mL 100 استرپتومایسین) در انکوباتور با دمای 37 درجهی سانتیگراد، CO2 5% و رطوبت 95% کشت داده شدند.
تعیین سمیت سلولی و زنده مانی
برای بررسی سمیت سلولی از روش MTT استفاده شد. برای انجام این کار ابتدا سلولهای نرمال HFF به مدت 48 ساعت با غلظت 104 در هر چاهک در پلیت 96 تایی کشت داده شدند. سپس به منظور سنجش عدم سمیت نانو سامانهی سنتز شده، لیپوزومهای بدون عصاره را با غلظتهای 1/0، 1، 10، 100 و 1000 برای 48 ساعت بر سلولها اثر داده شد.
بعد از آن 20 میکرولیتراز نمک MTT را به هر چاهک اضافه و برای 4 ساعت انکوباسیون انجام گرفت، سپس 150 میکرولیتر DMSO را جهت حل کردن کریستالهای فورمازان اضافه و به وسیلهی دستگاه الایزا ریدر جذبها را در طول موج 570 نانومتر خوانش و با استفاده از رابطه ی 2 درصد زنده مانی سلول ها را محاسبه کردیم .
رابطه ی 2)
× 100 یافته ها:
تعیین طول موج ماکسیمم و تهیه منحنی استاندارد عصارهی عشقه
طیف جذبی گیاه عشقه در بازهی 200 تا 700 نانومتر به وسیلهی دستگاه اسپکتروفوتومتر تهیه و رسم گردید ( نمودار 1). بررسیهای حاصل از این طیف جذبی نشان داد که عصارهی گیاه عشقه در طول موج nm 320 بیشترین جذب را دارد.
نمودار 1 : طیف جذبی عصارهی گیاه عشقه در طول موج 200 تا 800 نانومتر
نمودار استاندارد برای عشقه در حلال PBS خطی راست با معادله ی Y= 0.0036X – 0.1456 است که دارای ضریب تعیین ( R2)، 999/0 میباشد (نمودار 2). این معادله یک معادلهی درجه یک بوده و رابطه ی خطی میان جذب و غلظت را تایید میکند. همچنین نمودار استاندارد عشقه در بافر ایزوپروپیل نیز خطی راست با معادله ی درجه یک Y=0.0055X + 0.0171 و ضریب تعیین 999/0 است (نمودار 3).
نمودار 2: نمودار استاندار عصاره ی عشقه در بافر PBS
نمودار 3: نمودار استاندار عصاره ی عشقه در بافر ایزوپروپیل
بررسی میزان بارگذاری عصاره درون سامانه و الگوی رهایش آن با استفاده از روش اسپکتروفتومتری
میزان لود عصارهی عشقه درون سامانهی لیپوزومی به وسیلهی روش اسپکتروفتومتری با استفاده از معادلهی خط عصاره ی عشقه درون بافر ایزوپروپیل ( نمودار3) و رابطهی 1، 12/1 ± 67/82 درصد محاسبه گردید. همچنین با استفاده از معادلهی خط عصارهی عشقه در بافر PBS و روش اسپکتروفتومتری ( نمودار 2)، الگوی رهایش دارو مطابق با نمودار 4 به دست آمد. الگوی رهایش دارو از سامانه همانطور که از نمودار برداشت میشود دارای 2 فاز است. در فار اول به دلیل اختلاف غلظت زیاد دارو میان لیپوزوم و بافر، میزان رهایش دارو زیاد است اما در فاز دوم با کاهش اختلاف غلظت ، رهایش دارو آهسته گشته و از شیب نمودار کاسته شده است. حداکثر رهایش دارو از سامانه نیز در طول 48 ساعت 5/82 درصد است.
میزان لود عصارهی عشقه درون سامانهی لیپوزومی به وسیلهی روش اسپکتروفتومتری با استفاده از معادلهی خط عصاره ی عشقه درون بافر ایزوپروپیل ( نمودار3) و رابطهی 1، 12/1 ± 67/82 درصد محاسبه گردید. همچنین با استفاده از معادلهی خط عصارهی عشقه در بافر PBS و روش اسپکتروفتومتری ( نمودار 2)، الگوی رهایش دارو مطابق با نمودار 4 به دست آمد. الگوی رهایش دارو از سامانه همانطور که از نمودار برداشت میشود دارای 2 فاز است. در فار اول به دلیل اختلاف غلظت زیاد دارو میان لیپوزوم و بافر، میزان رهایش دارو زیاد است اما در فاز دوم با کاهش اختلاف غلظت ، رهایش دارو آهسته گشته و از شیب نمودار کاسته شده است. حداکثر رهایش دارو از سامانه نیز در طول 48 ساعت 5/82 درصد است.
نمودار 4: نمودار رهایش عصارهی عشقه از سامانهی لیپوزومی طی 48 ساعت به وسیلهی روش اسپکتروفتومتری.
اندازه و پتانسیل زتای ذرات نانو سامانه ی لیپوزومی
همانظور که ذکر شد اندازهی نانو سامانههای سنتز شده به روش DLS تعیین گردید. نتایج حاصل از DLS ( شکل 1 ) نشان داد که اندازهی نانو حاملهای لیپیدی سنتز شده در حدود 6/48 نانومتر است. همچنین میزان شاخص پراکندگی نیز 402/0 تعیین شد. آزمایشات در این مرحله با سه بار تکرار انجام شد.
همانظور که ذکر شد اندازهی نانو سامانههای سنتز شده به روش DLS تعیین گردید. نتایج حاصل از DLS ( شکل 1 ) نشان داد که اندازهی نانو حاملهای لیپیدی سنتز شده در حدود 6/48 نانومتر است. همچنین میزان شاخص پراکندگی نیز 402/0 تعیین شد. آزمایشات در این مرحله با سه بار تکرار انجام شد.
شکل 1 : نمودار و جدول اندازهی نانو سامانههای سنتز شده بر حسب نانومتر به وسیلهی دستگاه نانوسایزر.
پتانسیل زتای نانو حاملهای سنتز شده با دستگاه زتا سایزر اندازهگیری گردید. نتایج حاصل از این دستگاه نشان داد که میزان بار سطحی نانو لیپیدهای سنتز شده به طور میانگین mV 72/1 ±3/37- است که نشان میدهد نانو سامانه حاصل از نوع آنیونی است که سمیت کمتری برای سلولها دارد (شکل 2) .
شکل 2: نمودار و جدول تعیین بار میزان بار سطحی سامانه ی لیپیدی بر حسب mV.
بررسی نتایج حاصل از طیف سنجی مادون قرمز ( FT-IR ) نانو سامانه ی لیپوزومی
به منظور بررسی پایداری نانو حامل سنتز شده و عدم بر هم کنش سامانه و عصاره از تکنیک FTIR استفاده گردید. با توجه به طیفهای به دست آمده چنین استنباط میشود که در سامانهی خالی ( شکل 3 )، پیک شاخص cm-1 3440 است که نشان دهندهی گروه عاملی الکلی است که همین پیک با اختلافی جزئی به میزان cm-1 3305 در لیپوزوم حاوی عصاره (شکل 4 ) تکرار شده است. پیک شاخص cm-1 2952 نیز شاهدی بر وجود گروه عاملی آلکانی با پیوند کششی C-H است که این پیک نیز در سامانه ی حاوی عصاره با اختلافی جزئی به میزان cm-1 2956 تکرار شده است. پیک شاخص cm-1 2858 نیز مرتبط با گروه عاملی –CH2 است که در سامانه بعد از بارگذاری نیز عینا تکرار شده است.
به طور کلی، از مقایسه نمودارهای FTIR میتوان به این نتیجه رسید که حضور عصاره در سامانه سبب ایجاد پیک اضافه که بیانگر تشکیل ساختاری جدید یا تجزیه ی ترکیبات موجود در سامانه، نگردیده است. پس بارگیری عصاره در سامانه هیچ بر هم کنش غیر طبیعی ایجاد نکرده است.
به منظور بررسی پایداری نانو حامل سنتز شده و عدم بر هم کنش سامانه و عصاره از تکنیک FTIR استفاده گردید. با توجه به طیفهای به دست آمده چنین استنباط میشود که در سامانهی خالی ( شکل 3 )، پیک شاخص cm-1 3440 است که نشان دهندهی گروه عاملی الکلی است که همین پیک با اختلافی جزئی به میزان cm-1 3305 در لیپوزوم حاوی عصاره (شکل 4 ) تکرار شده است. پیک شاخص cm-1 2952 نیز شاهدی بر وجود گروه عاملی آلکانی با پیوند کششی C-H است که این پیک نیز در سامانه ی حاوی عصاره با اختلافی جزئی به میزان cm-1 2956 تکرار شده است. پیک شاخص cm-1 2858 نیز مرتبط با گروه عاملی –CH2 است که در سامانه بعد از بارگذاری نیز عینا تکرار شده است.
به طور کلی، از مقایسه نمودارهای FTIR میتوان به این نتیجه رسید که حضور عصاره در سامانه سبب ایجاد پیک اضافه که بیانگر تشکیل ساختاری جدید یا تجزیه ی ترکیبات موجود در سامانه، نگردیده است. پس بارگیری عصاره در سامانه هیچ بر هم کنش غیر طبیعی ایجاد نکرده است.
شکل 3: طیف FTIR لیپوزوم بلانک
شکل 4: طیف FTIR لیپوزوم حاوی عصاره
تصویر برداری از نانو ذرات با میکروسکوپ نیروی اتمی
با توجه به تصاویر (شکل 5 ) به دست آمده از میکروسکوپ نیروی اتمی ( AFM) میتوان به این نتیجه رسید که نانو لیپوزومهای حاوی عصارهی عشقه دارای شکلی کروی با محدودههای کاملا مشخص هستند. این تصاویر نشان میدهد که نانو ذرات از لحاظ مورفولوژی ( کروی، صافی، کلوخه نشدن) طبیعی میباشند.
با توجه به تصاویر (شکل 5 ) به دست آمده از میکروسکوپ نیروی اتمی ( AFM) میتوان به این نتیجه رسید که نانو لیپوزومهای حاوی عصارهی عشقه دارای شکلی کروی با محدودههای کاملا مشخص هستند. این تصاویر نشان میدهد که نانو ذرات از لحاظ مورفولوژی ( کروی، صافی، کلوخه نشدن) طبیعی میباشند.
شکل 5: تصاویر حاصل از عکسبرداری AFM از نانو سامانهی لیپوزومی حاوی عصارهی عشقه.
بررسی اثر سمیت نانو لیپید های ساخته شده بر روی سلولهای HFF
نتایج حاصل از تست MTT بر روی سلول های نرمال نشان میدهد که سامانهی لیپوزومی ساخته شده دارای سمیت بسیار ناچیز بر روی سلولهای طبیعی HFF است چرا که بر اثر تیمار این سلولها در 48 ساعت و تحت تاثیر غلظتهای 0.1، 1، 10، 100 و 1000 میکرو گرم بر میلیلیتر از سامانهی فاقد عصاره، میزان زنده مانی سلولها به ترتیب برابر است با 100، 98، 98، 97 و 97 درصد است که نشان از سمیت پایین نانو لیپوزومهای سنتز شده دارد.
نتایج حاصل از تست MTT بر روی سلول های نرمال نشان میدهد که سامانهی لیپوزومی ساخته شده دارای سمیت بسیار ناچیز بر روی سلولهای طبیعی HFF است چرا که بر اثر تیمار این سلولها در 48 ساعت و تحت تاثیر غلظتهای 0.1، 1، 10، 100 و 1000 میکرو گرم بر میلیلیتر از سامانهی فاقد عصاره، میزان زنده مانی سلولها به ترتیب برابر است با 100، 98، 98، 97 و 97 درصد است که نشان از سمیت پایین نانو لیپوزومهای سنتز شده دارد.
نمودار 5: نتایج حاصل از تست MTT بعد از 48 ساعت تاثیر سامانهی لیپوزومی فاقد عصاره با غلظتهای مشخص بر روی ردهی سلولی HFF جهت بررسی عدم سمیت لیپوزومهای ساخته شده بر روی سلولهای نرمال.
بحث:
مطالعهی حاضر نشان داد که نانو لیپوزومهای سنتز شده، توانایی بارگذاری 12/1± 67/82 درصد از عصارهی عشقه را در خود دارند. همچنین دارای روندی، آهسته رهش برای رهایی دارو هستند، چرا که بعد از 48 ساعت 5/82 درصد از عصاره از سامانه جدا شد که این عدد حداکثر میزان رهایش دارو 48 ساعت بود. کلسترول از جمله عوامل موثر در میزان رهایش دارو از سامانه است. همانطور که Haghiralsadat و همکارانش در سال 2017 نشان دادند با افزایش میزان کلسترول در ساختار لیپوزومها میزان رهایش دارو افزایش میابد (24). همچنین با بررسیها به وسیلهی DLS مشخص گردید که نانو لیپوزومهای سنتز شده دراین پژوهش دارای اندازهایی در حدود nm6/48 و بار mV 72/1± 3/37- هستند که این بار منفی میتواند سبب افزایش پایداری نانو لیپیدهای سنتز شده گردد چرا که بار منفی، مانع از رسوب واتصال لیپوزومها به یکدیگر میشود (25, 26). همچنین بررسی و مقایسهی طیفهای FTIR سامانهی فاقد عصاره با لیپوزومهای حاوی عصاره نشان داد که عصاره با لیپوزومها بر هم کنش نداشته و عصاره، ساختار و موقیت دارویی خود را پس از بارگذاری درون نانو حاملها حفظ کرده است. از تصاویر حاصل از میکروسکوپ انرژی اتمی ( AFM ) نیز میتوان به این نتیجه رسید که نانو ذرهها علاوه بر اندازه و توزیع مناسب بار، دارای مورفولوژی نرمال هستند. نتایج حاصل از تست MTT نیز نشان داد که نانو لیپوزومهای سنتز شده دارای سمیت بسیار پایینی بر روی سلولهای نرمال HFF هستند به طوریکه تحت تیمار این سلولها با غلظت 1000 میلیگرم بر میلیلیتر از لیپوزومهای فاقد عصارهی گیاه عشقه، میزان زندهمانی سلولها برابر با 97 درصد بود.
تا کنون مطالعات زیادی بر لیپوزومها به عنوان حاملهای دارویی صورت گرفته است. برای مثال والتنی و همکارانش در سال 2001، لیپوزوم های تک لایه و چند لایه حاوی اسانس سانتولیا سنتز کردند که اندازه، شاخص پراکندگی و درصد بارگذاری در لیپوزومهای چند لایه و تک لایه را به ترتیب nm 63 – 467 ، 15/0 –33/0 و 80 – 5/78 درصد گزارش کردند (26) . میزان بارگذاری بیشتر عصاره و اندازهی کوچکتر لیپوزومها از جمله مزیتهای مطالعهی ما نسبت به این مطالعه بود.
در سال 2009 نیز Detony و همکارانش لیپوزومهای چند لایه ایی با اندازهی nm 937، حاوی اسانس Zanthoxylum tingoassuiba با درصد همپوشانی 7/43 درصد را با روش فیلم نازک سنتز کردند (27). میزان همپوشانی بیشتر بیشتر از جمله مزیتهای مطالعهی حاضر نسبت به مطالعهی دتونی بود.
Celia و همکارانش نیز در سال 2015 نانو لیپوزومهای حاوی اسانس ترنج با پتانسیل زتای 6- و اندازهی nm 186 سنتز کردند که سبب افزایش حلالیت اسانس و در نتیجه افزایش خاصیت ضد سرطانی آن گردید (28).
در سال 2014 نیز Taeeo و همکارانش نیز ساخت نانو حاملهایی حاوی اسانس آویشن با میزان هم پوشانی 80 درصد و اندازه ی در محدودهی 580 تا 3200 را گزارش کردند (29).
Haghjoo و همکارانش نیز در سال 2015 با استفاده از غلظتهای مختلف فسفاتیدیل کولین و کلسترول لیپوزومهایی با اندازهی بین 81 تا 94 نانومتر، شاخص پراکندگی 3/0 درصد و درصد همپوشانی 83/68 به منظور بارگیری اسانس گزنه سنتز کردند (30).
Bashiri و همکارانش نیز در سال 2015 به بررسی میزان پایداری نانو ذرات حاوی بتا کاروتن با اندازهی nm 64 در گذشت زمان پرداختند. 77/89 درصد بیشترین میزان هم پوشانی در بهترین فرمول ساخته شده به وسیلهی بشیری بود (31).
Khosfi و همکارانش در سال 2015 نیز، لیپوزومهای حاوی اسانس آویشن شیرازی با درصد همپوشانی4/54 درصد سنتز کردند. آنها همچنین گزارش کردند که لود اسانس آویشن درون نانو حاملهای لیپوزومی سبب افزایش خاصیت آنتی اکسیدانی آن میگردد. خوسفی در مطالعهی خود نیز از میزان محتوای فسفاتیدیل کولین به کار رفته در ساختمان لیپوزومها به عنوان فاکتوری مهم در درصد ریزپوشانی آنها اشاره کرد (32).
در سال 2015، Haiying Cui و همکارانش نیز گزارش کردند که موفق به سنتز نانو لیپوزومهای حاوی اسانس میخک با اندازهایی در محدود 3/78 تا 1/156 نانومتر، شاخص پراکندگی 196/0 ، بار سطحی 5/24- و میزان همپوشانی 41/20 شده اند (33).
Gharah naghdeh و همکارانش نیز در سال 2017، ساخت نانو لیپوزومهای حاوی عصارهی مریم گلی با درصدهای مختلفی از فسفاتیدیل کولین و کلسترول و با اندازهایی بین 82 تا 88 نانومتر، شاخص پراکندگی 390/0 و درصد همپوشانی بالای 70 درصد را گزارش کردند (34).
در سال 2013 نیز Hosseini و همکارانش نیز، نانو ذراتی بر پایه کیتوزان سنتز کردند که بر طبق گزارش آنها این نانو ذرات توانایی انکپسوله کردن 34 درصد از اسانس پونه کوهی را داشتند (35).
نتیجه گیری:
در این پژوهش، سامانهی لیپوزومی به منظور بارگذاری عصارهی گیاه عشقه در جهت پایداری و افزایش خواص درمانی ثابت شده آن سنتز گردید. با توجه به قیمت مناسب و عوارض کمتر داروهای گیاهی نسبت به داروهای شیمیایی نیاز سیستمهایی جهت تسهیل استفاده از این ترکیبات و در نتیجه جایگزینی با سیستمهای درمانی متداول امروز بیش از بیش مورد توجه است. در این پژوهش، پس از عصارهگیری از گیاه عشقه، سامانه لیپوزومی به عنوان حامل این عصاره سنتز و ویژگی های فیزیکوشیمیایی آن مانند اندازه، شاخص پراکندگی، بار سطحی، میزان درون پوشانی، الگوی رهایش و عدم برهمکنش با عصاره با چند آزمایش مشخص و سپس تایید گردید. با توجه به نتایج مطالعه ی حاضر میتوان بیان داشت که میتوان از سامانهی سنتز شده با داشتن خواص فیزیکوشیمیایی مناسب در مسیرهای بالینی و سیر درمان بسیاری از بیماریها استفاده کرد، اگر چه که انجام سایر تستهای تکمیلی از جمله تستهای آنتی باکتریال و آنتی اکسیدان پیش از هر گونه استفاده از این سامانه پیشنهاد میشود.
مطالعهی حاضر نشان داد که نانو لیپوزومهای سنتز شده، توانایی بارگذاری 12/1± 67/82 درصد از عصارهی عشقه را در خود دارند. همچنین دارای روندی، آهسته رهش برای رهایی دارو هستند، چرا که بعد از 48 ساعت 5/82 درصد از عصاره از سامانه جدا شد که این عدد حداکثر میزان رهایش دارو 48 ساعت بود. کلسترول از جمله عوامل موثر در میزان رهایش دارو از سامانه است. همانطور که Haghiralsadat و همکارانش در سال 2017 نشان دادند با افزایش میزان کلسترول در ساختار لیپوزومها میزان رهایش دارو افزایش میابد (24). همچنین با بررسیها به وسیلهی DLS مشخص گردید که نانو لیپوزومهای سنتز شده دراین پژوهش دارای اندازهایی در حدود nm6/48 و بار mV 72/1± 3/37- هستند که این بار منفی میتواند سبب افزایش پایداری نانو لیپیدهای سنتز شده گردد چرا که بار منفی، مانع از رسوب واتصال لیپوزومها به یکدیگر میشود (25, 26). همچنین بررسی و مقایسهی طیفهای FTIR سامانهی فاقد عصاره با لیپوزومهای حاوی عصاره نشان داد که عصاره با لیپوزومها بر هم کنش نداشته و عصاره، ساختار و موقیت دارویی خود را پس از بارگذاری درون نانو حاملها حفظ کرده است. از تصاویر حاصل از میکروسکوپ انرژی اتمی ( AFM ) نیز میتوان به این نتیجه رسید که نانو ذرهها علاوه بر اندازه و توزیع مناسب بار، دارای مورفولوژی نرمال هستند. نتایج حاصل از تست MTT نیز نشان داد که نانو لیپوزومهای سنتز شده دارای سمیت بسیار پایینی بر روی سلولهای نرمال HFF هستند به طوریکه تحت تیمار این سلولها با غلظت 1000 میلیگرم بر میلیلیتر از لیپوزومهای فاقد عصارهی گیاه عشقه، میزان زندهمانی سلولها برابر با 97 درصد بود.
تا کنون مطالعات زیادی بر لیپوزومها به عنوان حاملهای دارویی صورت گرفته است. برای مثال والتنی و همکارانش در سال 2001، لیپوزوم های تک لایه و چند لایه حاوی اسانس سانتولیا سنتز کردند که اندازه، شاخص پراکندگی و درصد بارگذاری در لیپوزومهای چند لایه و تک لایه را به ترتیب nm 63 – 467 ، 15/0 –33/0 و 80 – 5/78 درصد گزارش کردند (26) . میزان بارگذاری بیشتر عصاره و اندازهی کوچکتر لیپوزومها از جمله مزیتهای مطالعهی ما نسبت به این مطالعه بود.
در سال 2009 نیز Detony و همکارانش لیپوزومهای چند لایه ایی با اندازهی nm 937، حاوی اسانس Zanthoxylum tingoassuiba با درصد همپوشانی 7/43 درصد را با روش فیلم نازک سنتز کردند (27). میزان همپوشانی بیشتر بیشتر از جمله مزیتهای مطالعهی حاضر نسبت به مطالعهی دتونی بود.
Celia و همکارانش نیز در سال 2015 نانو لیپوزومهای حاوی اسانس ترنج با پتانسیل زتای 6- و اندازهی nm 186 سنتز کردند که سبب افزایش حلالیت اسانس و در نتیجه افزایش خاصیت ضد سرطانی آن گردید (28).
در سال 2014 نیز Taeeo و همکارانش نیز ساخت نانو حاملهایی حاوی اسانس آویشن با میزان هم پوشانی 80 درصد و اندازه ی در محدودهی 580 تا 3200 را گزارش کردند (29).
Haghjoo و همکارانش نیز در سال 2015 با استفاده از غلظتهای مختلف فسفاتیدیل کولین و کلسترول لیپوزومهایی با اندازهی بین 81 تا 94 نانومتر، شاخص پراکندگی 3/0 درصد و درصد همپوشانی 83/68 به منظور بارگیری اسانس گزنه سنتز کردند (30).
Bashiri و همکارانش نیز در سال 2015 به بررسی میزان پایداری نانو ذرات حاوی بتا کاروتن با اندازهی nm 64 در گذشت زمان پرداختند. 77/89 درصد بیشترین میزان هم پوشانی در بهترین فرمول ساخته شده به وسیلهی بشیری بود (31).
Khosfi و همکارانش در سال 2015 نیز، لیپوزومهای حاوی اسانس آویشن شیرازی با درصد همپوشانی4/54 درصد سنتز کردند. آنها همچنین گزارش کردند که لود اسانس آویشن درون نانو حاملهای لیپوزومی سبب افزایش خاصیت آنتی اکسیدانی آن میگردد. خوسفی در مطالعهی خود نیز از میزان محتوای فسفاتیدیل کولین به کار رفته در ساختمان لیپوزومها به عنوان فاکتوری مهم در درصد ریزپوشانی آنها اشاره کرد (32).
در سال 2015، Haiying Cui و همکارانش نیز گزارش کردند که موفق به سنتز نانو لیپوزومهای حاوی اسانس میخک با اندازهایی در محدود 3/78 تا 1/156 نانومتر، شاخص پراکندگی 196/0 ، بار سطحی 5/24- و میزان همپوشانی 41/20 شده اند (33).
Gharah naghdeh و همکارانش نیز در سال 2017، ساخت نانو لیپوزومهای حاوی عصارهی مریم گلی با درصدهای مختلفی از فسفاتیدیل کولین و کلسترول و با اندازهایی بین 82 تا 88 نانومتر، شاخص پراکندگی 390/0 و درصد همپوشانی بالای 70 درصد را گزارش کردند (34).
در سال 2013 نیز Hosseini و همکارانش نیز، نانو ذراتی بر پایه کیتوزان سنتز کردند که بر طبق گزارش آنها این نانو ذرات توانایی انکپسوله کردن 34 درصد از اسانس پونه کوهی را داشتند (35).
نتیجه گیری:
در این پژوهش، سامانهی لیپوزومی به منظور بارگذاری عصارهی گیاه عشقه در جهت پایداری و افزایش خواص درمانی ثابت شده آن سنتز گردید. با توجه به قیمت مناسب و عوارض کمتر داروهای گیاهی نسبت به داروهای شیمیایی نیاز سیستمهایی جهت تسهیل استفاده از این ترکیبات و در نتیجه جایگزینی با سیستمهای درمانی متداول امروز بیش از بیش مورد توجه است. در این پژوهش، پس از عصارهگیری از گیاه عشقه، سامانه لیپوزومی به عنوان حامل این عصاره سنتز و ویژگی های فیزیکوشیمیایی آن مانند اندازه، شاخص پراکندگی، بار سطحی، میزان درون پوشانی، الگوی رهایش و عدم برهمکنش با عصاره با چند آزمایش مشخص و سپس تایید گردید. با توجه به نتایج مطالعه ی حاضر میتوان بیان داشت که میتوان از سامانهی سنتز شده با داشتن خواص فیزیکوشیمیایی مناسب در مسیرهای بالینی و سیر درمان بسیاری از بیماریها استفاده کرد، اگر چه که انجام سایر تستهای تکمیلی از جمله تستهای آنتی باکتریال و آنتی اکسیدان پیش از هر گونه استفاده از این سامانه پیشنهاد میشود.
منابع:
1. Kibiti CM, Afolayan AJ. Herbal therapy: A review of emerging pharmacological tools in the management of diabetes mellitus in Africa. Pharmacognosy magazine. 2015;11(Suppl 2):S258.
2. Liu W, Ge T, Pan Z, Leng Y, Lv J, Li B. The effects of herbal medicine on epilepsy. Oncotarget. 2017;8(29):48385.
3. Barakat F, Aboee-Mehrizi F, Haghiralsadat BF, Sedighi-Khavidak S, Ashkezari MD. Designing and optimization of liposomal nano-carriers containing Nepeta persica extract and study of its cytotoxicity on the breast cancer cell line (MCF-7). Journal of Shahid Sadoughi University of Medical Sciences. 2019.
4. Bezruk I, Marksa M, Georgiyants V, Ivanauskas L, Raudone L. Phytogeographical profiling of ivy leaf (Hedera helix L.). Industrial Crops and Products. 2020;154:112713.
5. Pop CE, Parvu M, ARSENE AL, Parvu AE, Vodnar DC, Tarcea M, et al. Investigation of antioxidant and antimicrobial potential of some extracts from Hedera helix L. gut. 2017;4(6):11.
6. Roşca-Casian O, Mircea C, Vlase L, Gheldiu A-M, Teuca DT, Pârvu M. Chemical composition and antifungal activity of Hedera helix leaf ethanolic extract. Acta Biologica Hungarica. 2017;68(2):196-207.
7. Hasimun P, Adnyana IK. Zingiberaceae family effects on alpha-glucosidase activity: implication for diabetes. Bioactive Food as Dietary Interventions for Diabetes: Elsevier; 2019. p. 387-93.
8. Barnes LA, Leach M, Anheyer D, Brown D, Carè J, Lauche R, et al. The effects of Hedera helix on viral respiratory infections in humans: A rapid review. Advances in integrative medicine. 2020;7(4):222-6.
9. Kim HK, Na SS, Kim HH. Effects of Horticultural Therapy Programs on Depression and Self-esteem in Released-Convicts. Journal of People, Plants, and Environment. 2017;20(2):143-8.
10. Adil A, Khan SS, Naeem S, Ikram R, Jaffer N. Evaluation of acute and chronic hepatoprotective activity of Hedera helix L. Aqueous leaf extract on carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in rat model. Pak J Phytopathol. 2017;34:1-15.
11. Sun H, Li F, Xu Z, Sun M, Cong H, Qiao F, et al. De novo leaf and root transcriptome analysis to identify putative genes involved in triterpenoid saponins biosynthesis in Hedera helix L. PLoS One. 2017;12(8):e0182243.
12. Akhlaghi M, Ebrahimpour M, Ansari K, Parnian F, Zarezadeh Mehrizi M, Taebpour M. Synthesis, study and characterization of nano niosomal system containing Glycrrizha glabra extract in order to improve its therapeutic effects. New Cellular and Molecular Biotechnology Journal. 2021;11(42):65-82.
13. Haghiralsadat F, Azhdari M, Kalantar SM, Naderinezhad S, Teymourizadeh K, Yazdani M, et al. Strategy of Improvements in the rapeutic index of medicinal herbs of Iranianin digenous: Synthesis and characterization of phospholipid lipid-based vesicles in corporated Trachyspermum copticum. SSU_Journals. 2016;24(6):468-78.
14. Salem MZ, Zidan YE, Mansour MM, El Hadidi NM, Elgat WAA. Antifungal activities of two essential oils used in the treatment of three commercial woods deteriorated by five common mold fungi. International Biodeterioration & Biodegradation. 2016;106:88-96.
15. Sherry M, Charcosset C, Fessi H, Greige-Gerges H. Essential oils encapsulated in liposomes: a review. Journal of liposome research. 2013;23(4):268-75.
16. Sercombe L, Veerati T, Moheimani F, Wu SY, Sood AK, Hua S. Advances and challenges of liposome assisted drug delivery. Frontiers in pharmacology. 2015;6:286.
17. Pandey H, Rani R, Agarwal V. Liposome and their applications in cancer therapy. Brazilian archives of biology and technology. 2016;59.
18. Shahbazian S, Akbarzadeh A, Torabi S, Omidi M. Anti-cancer activity of pegylated liposomal trans-anethole on breast cancer cell lines MCF-7 and T47D. Biotechnology letters. 2015;37(7):1355-9.
19. Bozzuto G, Molinari A. Liposomes as nanomedical devices. International journal of nanomedicine. 2015;10:975.
20. Li J, Wang X, Zhang T, Wang C, Huang Z, Luo X, et al. A review on phospholipids and their main applications in drug delivery systems. Asian journal of pharmaceutical sciences. 2015;10(2):81-98.
21. Alavi M, Karimi N, Safaei M. Application of various types of liposomes in drug delivery systems. Advanced pharmaceutical bulletin. 2017;7(1):3.
22. Majdizadeh M, Rezaei Zarchi S, Movahedpour AA, Shahi Malmir H, Sasani E, Haghiralsadat BF. A new strategy in improving therapeutic indexes of medicinal herbs: preparation and characterization of nano-liposomes containing Mentha piperita essential oil. SSU_Journals. 2018;25(11):853-64.
23. مالمیر هش, کلانتر س, ساسانی ا, اسگری م, زاده مم, حقیرالسادات ببف. Synthesis and optimization of niosomal carriers containing doxorubicin in order to achieve a final formulation with high potential in cancer cells temperature and acidity. Journal of Shahid Sadoughi University of Medical Sciences. 2019.
24. Danhier F, Feron O, Préat V. To exploit the tumor microenvironment: passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. Journal of controlled release. 2010;148(2):135-46.
25. Honary S, Zahir F. Effect of zeta potential on the properties of nano-drug delivery systems-a review (Part 1). Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 2013;12(2):255-64.
26. Valenti D, De Logu A, Loy G, Sinico C, Bonsignore L, Cottiglia F, et al. Liposome-incorporated Santolina insularis essential oil: preparation, characterization and in vitro antiviral activity. Journal of liposome research. 2001;11(1):73-90.
27. Detoni C, Cabral-Albuquerque E, Hohlemweger S, Sampaio C, Barros T, Velozo E. Essential oil from Zanthoxylum tingoassuiba loaded into multilamellar liposomes useful as antimicrobial agents. Journal of microencapsulation. 2009;26(8):684-91.
28. Celia C, Trapasso E, Locatelli M, Navarra M, Ventura CA, Wolfram J, et al. Anticancer activity of liposomal bergamot essential oil (BEO) on human neuroblastoma cells. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2013;112:548-53.
29. Tao F, Hill LE, Peng Y, Gomes CL. Synthesis and characterization of β-cyclodextrin inclusion complexes of thymol and thyme oil for antimicrobial delivery applications. LWT-Food Science and Technology. 2014;59(1):247-55.
30. Haghjoo S, Ghanbarzadeh B, Hamishekar H, Asni Ashari S, Dehghannia J. Evaluation of Colloidal and Antioxidant Properties of Nanoliposome Loaded with Urtica dioica L. Extract. Innovative Food Technologies. 2015;2(3):11-23.
31. Bashiri S, GHANBARZADEH B, HAMISHEHKAR H, DEHGHANNIA J. Beta-Carotene loaded nanoliposome: effects of gama–oryzanol on particle size stability and encapsulation. 2015.
32. Ebrahimi Khosfi M, Khosravi Darani K, Hosseini H, Arabi Sh KFR, Kohi Kamali P. Production of nanoliposomes containing essential oil of Boiss Zatariamultiflora by response surface method. Nano Meghyas. 2014;1(2):119-28.
33. Cui H, Zhao C, Lin L. The specific antibacterial activity of liposome-encapsulated Clove oil and its application in tofu. Food Control. 2015;56:128-34.
34. Gharenaghadeh S, Samadlouie H, Sowti M, Hamisekar H, Mokaram R. Evaluation of the antimicrobial and antioxidant properties of Salvia essential oil nano liposome (Salvia multicaulis). Journal of Food Science and Technology. 2017;14(62):271-82.
35. Hosseini SF, Zandi M, Rezaei M, Farahmandghavi F. Two-step method for encapsulation of oregano essential oil in chitosan nanoparticles: preparation, characterization and in vitro release study. Carbohydrate polymers. 2013;95(1):50-6.
نوع مطالعه: مقاله پژوهشی |
موضوع مقاله:
بیوشیمی
دریافت: 1400/1/22 | پذیرش: 1400/5/21 | انتشار: 1400/10/1
دریافت: 1400/1/22 | پذیرش: 1400/5/21 | انتشار: 1400/10/1
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
