A survey of evolutionary changes of fatty acids and storage proteins

in three Brassica species by comparative genomics method

Shadi heidari¹, Peivand heidari¹, Baharak Heidari²*

1. Department of Plant Breeding, Faculty of Agriculture, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran.

2. Department of Computer Engineering, Faculty of Engineering, Kermanshah Branch, Islamic Azad University, Kermanshah, Iran.

Corresponding author:

Department of Computer Engineering, Faculty of Engineering, Kermanshah Branch, Islamic Azad University, Kermanshah, Iran.   Email: b_heidari@iauksh.ac.ir

Abstract

Aim and Background: Brassica napus has one of the most important oilseed crops in the world, which has undergone extensive genome reconstruction following an interspecies hybridization of Brassica rapa and Brassica oleracea. In order to understand the functional changes of B. napus genome during the evolution, comparison of gene expression was performed in three species of Brassica.

Materials and Methods: Seed preliminary data of three Brassica libraries were collected from the Harvard university database. To find similarities between three libraries, all EST sequences were assembled using EGassembler software. Then, all contigs were analyzed by X-blast using CLC Protein workbench software against nonredundant proteins of gene bank. IDEG6 software was used to identify genes with different expression between libraries. MapMan comparative classification tool was used to classify functional catalogs.

Results: Comparison of gene expression between the three species showed that 23 genes in 5 functional groups including fatty acids, storage proteins, amino acids, transcriptional regulation and signaling were statistically significant.

Conclusion: While B. rapa and B. oleracea encode the largest number of ESTs involved in the biosynthesis of erucic acid and linolenic acid, genome in B. napus has evolved to produce more oleic acid and linoleic acid, which may have resulted from the deletion or duplication of the genome during evolution. In addition, Cruciferin transcripts accounted for 40% of total seed storage protein transcripts. This study paves the way for further research on the genetic consequences of polyploidy during canola breeding evolution.

Key words: Gene expression, Expressed sequence tags, Functional catalogs, Hybridization, Iau Science

بررسی تغییرهای تکاملی اسیدهای چرب و پروتئین‌های ذخیره‌ای در سه گونه Brassica با روش ژنومیکس مقایسه‌ای

شادی حیدری¹، پیوند حیدری¹، بهارک حیدری^*2

1. گروه اصلاح نباتات، دانشکده کشاورزی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران.

2. گروه مهندسی کامپیوتر، دانشکده فنی و مهندسی، واحد کرمانشاه، دانشگاه آزاد اسلامی، کرمانشاه، ایران

نویسنده مسئول:

گروه مهندسی کامپیوتر، دانشکده فنی و مهندسی، واحد کرمانشاه، دانشگاه آزاد اسلامی، کرمانشاه، ایران.

پست الکترونیکی:  b_heidari@iauksh.ac.ir

چکیده

سابقه و هدف: Brassica napus دارای یکی از مهمترین محصولات روغنی در جهان است که به دنبال هیبریداسیون بین گونه‌ای Brassica rapa و Brassica oleracea، تحت بازسازی گسترده ژنوم قرار گرفته است. به منظور درک تغییرات کارکردی ژنوم B. napus در طی تکامل، مقایسه بیان ژن در سه گونه Brassica انجام شد.

مواد و روش‌ها: اطلاعات اولیه بذر سه کتابخانه Brassica از بانک اطلاعات دانشگاه هاروارد جمع‌آوری شد. برای پیدا کردن شباهت بین سه کتابخانه، همه توالی‌های EST با استفاده از نرم‌افزار EGassembler دسته‌بندی شدند. سپس همه کانتیگ‌ها به وسیله جستجوگر بلاست X توسط نرم افزارCLC Protein Workbench در مقابل پروتئین‌های غیر تکراری بانک ژن آنالیز شدند. برای شناسایی ژنهای با بیان متفاوت در بین کتابخانه‌ها، نرم افزارIDEG6 مورد استفاده قرار گرفت. برای دسته‌بندی کاتالوگ‌های عملکردی، ابزار طبقه‌بندی MapMan استفاده شد.

یافته‌ها: مقایسه بیان ژن بین3 گونه نشان داد که 23 ژن در 5 گروه کارکردی شامل اسیدهای چرب، پروتئین‌‌های ذخیره‌ای، اسید‌های آمینه، تنظیم رونویسی و پیام‌رسانی از نظر آماری تفاوت معنی‌دار دارند.

نتیجه گیری: در حالیکه B. rapa و B. oleracea بیشترین تعداد EST موثر در بیوسنتز اسید چرب اروسیک و اسید لینولنیک را رمزگذاری می‌کنند، ژنوم در B. napus به سمت تولید اسید اولئیک و اسید لینولئیک بیشتر تکامل یافته است که ممکن است به دنبال حذف و یا مضاعف شدگی ژنوم در طی تکامل ایجاد شده باشد. به علاوه، رونوشت های کروسیفرین 40 درصد کل رونوشت های پروتئین های ذخیره ای بذور را تشکیل داد. این مطالعه زمینه‌ساز انجام تحقیقات بیشتر در زمینه پیامدهای ژنتیکی پلی پلوئیدی طی تکامل در راستای به نژادی کلزا است.

واژه های کلیدی: بیان ژن، برچسب‌های توالی بیان شده، گروه‌های کارکردی، هیبریداسیون، Iau Science

مقدمه

کلزا یکی از مهمترین محصولات روغنی در جهان است. حدود 40-45 درصد وزن دانه روغن است. روغن کلزا 6 درصد چربی اشباع دارد که کمتر از روغن‌های گیاهی دیگر است. همچنین از 58 درصد چربی تک اشباع نشده تشکیل شده است که این ویژگی مورد پسند مصرف کنندگان است. کنجاله کلزا از 32 تا 38 درصد پروتئین دارد. کنجاله کلزا، بخشی از دانه باقی‌مانده پس از استخراج روغن، برای صنعت دام ارزش دارد (1). در حال حاضر از کلزا برای اهداف خاص صنعتی استفاده نمی‌شود. پیشرفت فناوری اما می‌تواند کاربردهای جدیدی مانند بیودیزل در مصارف صنعتی برای روغن کلزا ایجاد کند. بنابر گزارش وزارت جهادکشاورزی، در سال زراعی ۹۸-۹۷، ۴۲۰ هزار تن کلزا در سطح کشور تولید شد (2). این مقدار تولید جوابگوی نیاز کشور نیست و وابستگی شدید کشور به واردات دانه‌های روغنی، کنجاله و روغن وجود دارد و سالانه قریب 4 میلیارد دلار ارز برای واردات این محصولات از کشور خارج می‌شود. لذا استفاده از ارقام زراعی اصلاح شده می‌تواند به رفع نیاز کشور بپردازد. در حال حاضر فقط تعداد محدودی از ارقام دوصفر (00) کلزا موجود است و اکثر آنها کاملاً متناسب با مناطقی نیستند که در آن پرورش داده می‌شوند و از نظر انواع ترکیب بیوشیمیایی بذر به وضوح با ارقام سنتی تفاوت دارند. اسید اروسیک از محتوای روغن بذر حذف شده است و مقدار گلوکوزینولات در دانه‌ها به طور قابل توجهی کاهش یافته است. در کل، این دستکاری‌های ژنتیکی برای دستیابی به خصوصیات مفید در ارقام دوصفر به طور قابل توجهی تنوع ژنتیکی و فنوتیپی کلزا را کاهش داده است. بنابراین، در خانواده Brassica، به منابع جدیدی برای تغییرات ژنتیکی نیاز است. یکی از راه‌های گسترش منابع ژنتیکی برای تولید دانه‌های روغنی بدست آوردن آلوپلی پلوئیدهای مصنوعی به وسیله تلاقی با گونه‌های مولد B. rapa و B. oleracea است. پلی پلوئیدی پدیده‌ای رایج در تکامل گیاهان گل‌دهنده است که منجر به تنوع زیستی و شکل‌گیری سریع گونه‌های جدید می‌شود. B. napus یک گیاه آلوتتراپلوئید (دانه روغنی، AACC، 38=x4=n2) و مهمترین گونه زراعی جنس Brassica می‌باشد که از هیبریداسیون اتفاقی و دو برابر شدن طبیعی کروموزوم‌ها بین B. rapa (شلغم، AA، 20=x2=n2) و B. oleracea (کلم، CC، 18=x2=n2) حاصل و با تغییرات پیچیده محیطی روبرو شده است. این تغییرات، در نتیجه انتخاب طبیعی، در ژنوم آنها رمزگذاری شده و سرنخ‌هایی برای واگرایی ژنتیکی آن از اجدادش فراهم می‌کند (3). بنابراین استنباط تغییرات بین گونه‌ها با تجزیه و تحلیل ترکیبات موجودی ژن در را به شاخه غنی ژنومیکس مقایسه‌ای باز می‌کند. تکامل واگرا می‌تواند برای تشخیص صفات، در زیست شناسی ملکولی توسط توالی‌های نوکلئوتیدی و پروتئینی که از دو یا چند ژن همولوگ مشتق شده‌اند بکار برده شود (4). مقایسه ژنوم بذر کلزا در مقایسه با اجداد آن در فهم تغیرات کارکردی ژنوم در طی تکامل موثر می‌باشد تا بدین وسیله بتوان از آنها در گسترش تنوع ژنتیکی کلزا اقدام نمود. Niu و همکاران با استفاده از بررسی پروفایل بیان کمتر از 8000 توالی EST[1] در بذر B. napus نشان دادند که بیوسنتز و تنظیم اسید های چرب بین B. napus و آرابیدوپسیس حفاظت شده است (5). Fu و همکاران با استفاده از تجزیه و تحلیل بیان افتراقی ژن نشان دادند که ژن‌هایی مانند ساکارز سنتاز، پیروات کیناز و 6 فسفو گلوکونات دهیدروژناز که مربوط به متابولیسم قند هستند، در ارقامی با محتوای روغن بالاتر فرا تنظیم می‌شوند. نتایج آنها اطلاعات مهمی از مکانیسم ژنتیکی مولکولی اختلاف محتوای روغن کلزا را فراهم کرد (6). وجود تنوع در ارقام و گونه‌ها نه تنها روند انتخاب را تسریع می‌کند بلکه باعث افزایش کارایی انتخاب صفات مطلوب در سطح سلولی می‌شود (7). درحال حاضر، از روش‌های ژنومیکس کارکردی تجزیه و تحلیل توالی EST به عنوان روش موثر، ارزان و سریع و قدرتمند برای تجزیه الگوی بیان تعداد بسیار زیادی ژن به طور همزمان در مراحل تکوینی و تکاملی مختلف، به طور گسترده استفاده می‌شود (8). Heidary و همکاران با استفاده از تجزیه و تحلیل EST داده‌های جمع‌آوری شده از پایگاه داده دانشگاه هاروارد، مهمترین ژن‌های مربوط به تنش خشکی گندم، برنج، پنبه و فستوکا را گزارش دادند و از نرم افزار IDEG6[2] برای شناسایی ژن‌هایی با بیان افتراقی بین کتابخانه‌ها استفاده کردند. آنها همچنین ژن‌های تفسیر شده را با استفاده از ابزار Mapman به گروه‌های کارکردی طبقه‌بندی کردند (9). مطالعات مقایسه‌ای بیان ژن اندکی بر اساس تعیین توالی cDNA به منظور روشن کردن تغییرات بیان ژن مربوط به تکامل در بذور سه گونه Brassica انجام شده است. در این تحقیق با استفاده از تجزیه و تحلیل توالی‌های EST تغییرات احتمالی در بیان برخی ژن‌های موثر در مسیر‌های بیوسنتز اسید‌های چرب و پروتئین‌های ذخیره‌ای در طی تکامل در بذور سه گونه Brassica بررسی شد.

مواد و روش‌ها

داده‌های اولیه سه کتابخانه B. napus (BN238-Na) با 7895 EST، B. rapa (BR304-Ra) با 7534 EST و B. oleracea (BO51-Ol) با 6923 EST مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. داده‌ها از پایگاه داده دانشگاه هاروارد (Http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi) جمع‌آوری شد. کتابخانه زیست محاسباتی و کتابخانه های ژنومیکس عملکردی پروژه‌های شاخص ژن‌ها در طیف گسترده‌ای از ارگانیسم‌ها هستند (10). توالی cDNA با استفاده از نرم‌افزار EGassembler به صورت خوشه‌ای دسته‌بندی شد (Http://egassembler.hgc.jp). در مرحله پیش پردازش، خالص‌سازی توالی‌های EST شامل پاکسازی توالی، پوشاندن تکرار، پوشاندن وکتور، پوشاندن اندامک و دسته‌بندی توالی با درصد تطابق cutoff N≥95 انجام شد. در مرحله بعد، توالی‌های EST در کانتیگ‌ها شامل دو یا چندEST  و سینگلتون شامل فقط یکEST  دسته‌بندی شدند (11). برای یافتن شباهت‌های سه کتابخانه، تمام توالی‌های EST توسط نرم‌افزار Egassembler دسته‌بندی شد. سپس همه کانتیگ‌ها با استفاده از X-blast توسط نرم‌افزار CLC bio در برابر پایگاه داده پروتئین‌های غیر تکراری با E-value ≤10⁻⁵ مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند (12). برای شناسایی ژن‌ها با بیان افتراقی در کتابخانه‌ها، از نرم افزار IDEG6 و آماره  Audic-Claverie((Http://telethon.bio.unipd.it/ideg6 استفاده شد (13). توالی‌های مربوط به کانتیگ و سینگلتون هر کتابخانه توسط برنامه X-blast در برابر منبع اطلاعاتی آرابیدوپسیس بارگیری شده از پایگاه داده TAIR[3] (Ftp://ftp.arabidopsis.org) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت (14). برای دسته‌بندی کاتالوگ‌های عملکردی، ابزار طبقه‌بندی مقایسه‌ای MapMan (http://www.gomapman.org) به صورت آنلاین استفاده شد (15). از خروجی‌های Mapman برای توصیف کاتالوگ‌های مختلف در کتابخانه‌ها استفاده شده است. از نرم افزار IDEG6 و آزمون Audic-Claverie برای یافتن کاتالوگ‌های مختلف عملکردی در دو کتابخانه استفاده شد. توالی‌های شناسایی شده به سه دسته هستی‌شناسی ژنGO[4]  (بیولوژیکی، سلولی و مولکولی) طبقه‌بندی شدند.

یافته‌ها

نتایج دسته‌بندی EST ها با میانگین طول EST 571-847 از سه کتابخانه B. napus، B. rapa و B. oleracea در جدول 1 آمده است. نتایج نشان داد که به ترتیب درکتابخانه بذر B. napus، B. rapa وB. oleracea 1061، 948 و912 کانتیگ و 3282، 3172 و 3027 سینگلتن ایجاد شد. 1986 (15/25 %)، 1540 (44/20 %) و 1654 (89/23 %) درکتابخانه بذر B. napus، B. rapaو B. oleracea سهم خیلی ضعیفی (≥1*10^-5 E-value) در همولوژی با توالی‌های موجود در پایگاه داده‌ها داشتند و یا هیچ توالی مشابهی با آنها وجود نداشت در حالیکه 5909، 5994 و 5269 EST به ترتیب همولوژی بالا یا متوسطی را نشان دادند (E-value≤1*10^-5).

جدول1- تعداد کانتیگ و سینگلتن‌های هر کتابخانه بر اساس خروجی نرم افزار EGassembler.

تعداد کل EST ها                                               7895                        7534                        6923       

تعداد کانتیگ ها                                                   1061                        948                          912

تعداد EST درکانتیگ                                           4613                        4362                        3896

تعداد سینگلتن                                                    3282                        3172                        3027

کانتیگ‌هایی که hit مشخصی ندارند                         198                          156                          214

بر پایه نتایج ما، توالی‌هایی که در نشان دادن همولوژی معنی‌دار برای هر پروتئین در پایگاه داده‌های عمومی شکست خوردند، کاندیدای مناسبی برای ژن‌های جدید هستند. مقایسه بیان ژن و ژنومیکس کارکردی B. napus، B. rapa و B. oleracea با استفاده از تجزیه و تحلیل منابع EST بذر این سه گونه، تفاوت معنی‌دار 23 ژن از نظر آماری در 5 گروه کارکردی تعیین شده در سایت Mapman شامل پروتئین‌های ذخیره‌ای، اسید‌های آمینه، اسیدهای چرب، تنظیم رونویسی و پیام‌رسانی را نشان دادند. گروه‌های کارکردی متفاوت به همراه ژن‌ها با بیان افتراقی و تعداد EST در هر کتابخانه در جدول 2 مشخص شده است.

تطابق احتمالی (Map Man)                                     اجزای سلولی                            فرایند های بیولوژیکی                               B. rapa                  B. napus                B. oleracea           p-value

اسید چرب امگا 3 دساتوراز (FAD3)                              شبکه اندوپلاسمی                         بیوسنتز اسیدهای چرب                                 ^*17                           8                              ^*15                           ^21-E2

Δ-9 استئاروئیل-ACP دساتوراز (FAB2)                      استرومای کلروپلاست                    بیوسنتز اسیدهای چرب                                 8                              ^*19                           3                              ^27-E3

استیل کوآنزیم A کربوکسیلاز کربوکسیل- ترانسفراز           استرومای کلروپلاست                    فرآیند بیوسنتزی CoA –مالونیل                    ^*47                           3                              ^*47                             ^9-E5

- زیر واحد بتا (accD)

اسید چرب الونگاز 1 (FAE1)                                        غشا اینتگرال                               بیوسنتز اسیدهای چرب                                 ^*26                           2                              ^*19                           ^43-E3

اسفنگولیپید دلتا-4 دساتوراز (DES1)                             شبکه اندوپلاسمی                         فرآیند بیوسنتزی سرامید                                3                              ^*7                             2                              ^52-E1

اسفنگولیپید دلتا - 8 دساتوراز (SLD)                             شبکه اندوپلاسمی                         فرآیند بیوسنتزی اسفنگولیپید                         8                              ^*11                           6                              ^30-E2

اسید چرب دساتوراز 4 (FAD4)                                    فرآیند متابولیک لیپید                    غشا اینتگرال                                               3                              ^*5                             1                              ^49-E6

آسیل-CoA دساتوراز (ADS)                                       غشا                                           فرآیند بیوسنتزی اسیدهای چرب غیراشباع        14                            ^*29                           10                            ^93-E2

کروسیفرین                                                                 شبکه اندوپلاسمی                         پروتئین ذخیره ای بذر                                   ^*9                             ^*17                           0                              ^27-E 4

ناپین                                                                         -                                              پروتئین ذخیره ای بذر                                   1                              ^*3                             0                              ^91-E2

پروتئین انتقال چربی (LTP)                                          -                                              انتقال چربی                                                3                              ^*7                             2                              ^84-E2

پروتئین فراوان اواخر جنین زایی (LEA)                          سیتوزول                                    پاسخ تنش                                                  2                              ^*9                             3                              ^92-E1

سیستئین سنتاز                                                           میتوکندری                                 بیوسنتز سیستئین                                        11                            ^*29                           9                              ^20-E2

متیونین سنتاز                                                             سیتوزول                                    بیوسنتز متیونین                                          8                              ^*21                           7                              ^82-E7

گلوتامین سنتتاز                                                           سیتوزول                                    بیوسنتز اسید آمینه                                       ^*54                           ^*72                           25                            ^93-E2

پرولین دهیدروژناز (ProDH)                                         میتوکندری                                 متابولیسم پرولین                                         14                            19                            ^*27                           ^22-E3

پروتئین دو عملکردی بیوسنتز آرژنین ArgJ                      کلروپلاست                                 فرآیند بیوسنتزی آرژنین                 ^*32                           15                            23                                ^75-E3

آمینو اسید پرمئاز 1 (AAP)                                          غشا سلولی                                 انتقال آمینو اسید                                          8                              ^*12                           7                                ^5-E2

فاکتور رونویسی شوک حرارتی A4a (HSFA4a)             سیتوپلاسم، هسته                        تنظیم رونویسی                                           3                              ^*9                             2                                ^8-E1

غیر حساس به آبسیزیک اسید 3 (ABI3)                        هسته                                         تنظیم رونویسی                                           7                              ^*14                           5                              ^37-E3

p-value  به آماره Audic-Claverie برای بیان متفاوت اشاره دارد. اختلافات معنی‌دار با ^* در جدول نشان داده شده است.

بحث

گروه کارکردی اسید‌های چرب

از ژن‌هایی که در گروه کارکردی اسید‌های چرب در سه کتابخانه  B. napus،B. rapa و B. oleracea اختلاف بیان داشتند می‌توان به ژن‌های موثر در بیوسنتز اسیدهای چرب غیر اشباع چند باندی (FAD2[5])،(FAD3[6])  اشاره نمود. اسید چرب FAD2، نقشی اساسی در تولید اسید لینولئیک (18:2) در شبکه آندوپلاسمی[7] دارد و اولین مرحله مورد نیاز برای تولید اسیدهای چرب اشباع نشده چندگانه موجود در بذر را کاتالیز می‌کند. FAD3 جز اسیدهای چرب اشباع نشده با چند پیوند مضاعف PUFA[8])) در دانه‌های روغنی است و نقش زیادی در تبدیل اسید لینولئیک امگا 6 (18:2) به اسید لینولنیک امگا 3 (18:3) دارد. اسیدهای چرب امگا 3 به دلیل حضور در غشای سلول عملکرد مهمی در فعالیت فیزیولوژیکی گیاه دارند. در مطالعه حاضر FAD2 در کتابخانه B. napus و B. rapa اختلاف معنی‌داری با B. oleracea نشان داد. FAD3 در کتابخانه B. rapa و B. oleracea با کتابخانه B. napus اختلاف معنی نشان داد (جدول 2). Lee و همکاران در مطالعه‌ای 4 ژن FAD2 را از گونه‌های مختلف جنس Brassica بررسی نمودند و از طریق مطالعات فیلوژنی گزارش نمودند که ژن FAD2-3 B. napus یک شبه ژن غیرفعال جهش‌یافته با حذف و الحاق چندین نوکلئوتید از B. rapa به ارث رسیده است (3). این در حالیست که در مطالعه ما، B. napus و B. rapa از نظر بیان ژن FAD2 اختلاف معنی‌دار نداشتند. FAB2[9] (SAD) ژن دیگری است که اختلاف معنی‌داری بین B. napus با دو کتابخانه B. rapa و B. oleracea نشان داد. FAB2 گروه‌هایی از آنزیم‌های موضعی در پلاستیدها هستند که در گیاهان عالی پیوند مضاعفی به اسیدهای استئاریک اشباع اضافه می‌کند تا آنها را به اسیدهای اولئیک اشباع نشده تبدیل کند. این اسیدهای اولئیک به نوبه خود به عنوان پیش‌ماده بیوسنتز اسیدهای چرب عمل می‌کنند. این امر در ساخت اسیدهای چرب غیر اشباع چند باندی، مانند تشکیل اسید لینولئیک (18:2) توسط FAD2 و FAD3 و تشکیل اسید لینولنیک (18:3) در ER کمک می‌کنند. علاوه بر این، FAD4 و FAD5 اسید پالمیتیک (16:0) را به اسید پالمیتولیک (16:1) تبدیل می‌کنند (16). این اعمال نقش کلیدی آنزیم‌هایSAD  را در تعیین محتوای کلی اسیدهای چرب اشباع نشده(UFA[10])  مشخص می‌کند و توجه محققان را به خود جلب کرده است. نتایج مطالعه ما در توافق با نتایج Knutzon و همکاران است که افزایش بیان FAB2 را در B. napus گزارش دادند و نشان دادند که کاهش فعالیت آنزیمی SAD منجر به افزایش چشمگیر سطح (18:0) در بذر B. napus، از 2٪ به 40٪ شده است (17). با توجه به اهمیت عملکردی اشباع اسیدهای چرب در توسعه گیاهان و کاربردهای صنعتی، ژن های SAD از بسیاری از گونه‌های گیاهی شناسایی و مشخص شده‌اند و ارتباط زیادی بین فعالیت‌های SAD و سطح اسیدهای چرب به طور گسترده‌ای وجود دارد (18). از طرف دیگر در B. rapa و B. oleracea ژن‌های موثر در بیوسنتز اسیدهای چرب اروسیک در سطح بالاتری بیان شدند. از ژن‌های مهم درگیر در بیوسنتز اسیدهای چرب اورسیک می‌توان به (accD[11]) اشاره نمود که در کتابخانه‌های B. rapa و B. oleracea افزایش بیان معنی‌دار داشتند. این آنزیم در بیوسنتز اسید اورسیک نقش دارد. در توافق با نتایج ما  Townو همکاران در بررسی ژنومیکس مقایسه‌ای گونه‌های Brassica، افزایش بیان ژن accD ناشی از تغییرات ژنتیکی را در B. oleracea گزارش دادند (19). در کتابخانه‌های B. rapa و B. oleracea افزایش بیان ژن (FAE1[12]) نیز مشاهده شد. FAE1 مرحله تراکم اولیه در مسیر طویل شدن بیوسنتز VLCFA[13] (اسید چرب با زنجیره بسیار طولانی) را کاتالیز می‌کند و بنابراین یک ژن اصلی در بیوسنتز اسید اورسیک است (20). Sun و همکاران در توافق با نتایج ما تنها دو ایزوفرم از ژن FAE1 را در B. napus گزارش کردند که هر کدام را به صورت جداگانه از گونه‌های دیپلوئید والدین خود B. oleracea و B. rapa دریافت کرده‌ است (20). ژن (DES1[14]) ژن دیگری است که در کتابخانه B. napus افزایش بیان داشت و اختلاف معنی‌داری با دو کتابخانه B. rapa و B. oleracea نشان داد. DES1 برای بیوسنتز اسفنگولیپیدها دلتا 4 اشباع نشده و مشتقات آن مورد نیاز است. اسفنگولیپیدهای گیاهی در ساخت ماتریس غشای سلولی، انسجام ساختاری غشا، تشکیل دومین غشا و در مسیرهای پیام‌رسانی فرآیندهای فیزیولوژیکی خصوصاً انتقال سیگنال وابسته به اسید ابسیزیک[15] و به عنوان متابولیت‌های میانجی فرآیند سلولی مانند مرگ سلولی برنامه‌ریزی شده و در پاسخ به تنش‌های زیستی و غیر زیستی محیطی نقش دارند (21). با این حال، اطلاعات مربوط به نقش آنها در بذر ناشناخته است. ژن‌های دیگر با افزایش بیان در B. napus که اختلاف معنی‌داری با دو کتابخانه B. rapa و B. oleracea نشان دادند (FAD4[16]) ، (SLD[17]) و (ADS[18]) بودند. (FAD4) که در کتابخانه B. napus افزایش بیان داشت در تولید گونه‌های مولکولی فسفاتیدیل گلیسرول اختصاصی کلروپلاست حاوی (E3) 16:1 نقش دارد و تشکیل پیوند دوگانه ترانس را کاتالیز می‌کند. Xue و همکاران در توافق با نتایج ما در بررسی ژنومی و توصیف خانواده ژن FAD4 در B. napus و گونه‌های والدین آن نشان دادند که به ترتیب، B. napus، B. rapa، B. oleracea، آرابیدوپسیس و برنج حاوی هفت، چهار، چهار، یک و یک رونوشت ژن FAD4 بودند (22). ADS و SLD در مسیر بیوسنتز اسیدهای چرب اشباع نشده چندگانه که بخشی از متابولیسم لیپید است نقش دارد. در کل سطح بیشتر بیان ژن‌های موثر در بیوسنتز اسیدهای چرب غیر اشباع در کتابخانه B. napus نسبت به دو کتابخانه B. rapa و B. oleracea بالاتر بود. در B. napus به ترتیب ژن‌های کد کننده اسید اولئیک FAB2، اسید لینولئیک FAD2 دارای بیشترین میزان EST و کمترین رونوشت اسید اروسیک در کتابخانه بذر بودند. در B. rapa و B. oleracea به ترتیب ژن‌های کد کننده اسید اروسیک ((accD و(FAE1) و اسید لینولنیک (FAD3) بیشترین مقدار را داشتند. در B. oleracea کمترین میزان بیان ژن‌های کد کننده اسید اولئیک و اسید لینولئیک مشاهده شد. روغن بذور جنس Brassica با مقدار قابل توجهی اسیدهای چرب اشباع نشده زنجیره بلند، عمدتاً اسید اورسیک که در اکثر روغن‌های دیگر گیاهی تجاری وجود ندارد، مشخص می‌شود. این درحالیست که در B. napus کاهش چشمگیر بیان EST موثر در بیوسنتز اسید اروسیک مشاهده شد. این امر احتمالاً به دنبال حذف اصلاح شده اسید اروسیک از ارقام دو صفر کلزا روی داده است. از آنجا که B. rapa و B. oleracea "به عنوان اجداد کلزا" بیشترین تعداد EST موثر در بیوسنتز اسید اروسیک و اسید لینولنیک را رمزگذاری می‌کنند، لذا لزوم انتقال ژن‌های موثر در بیوسنتز اسید اروسیک به B. napus از اجداد آن اهمیت زیادی در برنامه‌های اصلاحی پیدا می‌کند.

گروه کارکردی پروتئین های ذخیره‌ای بذر

ژن‌های افتراقی در گروه کارکردی پروتئین ذخیره‌ای بذر (SSP[19]) شامل کروسیفرین، ناپین، ((LTP[20] و (LEA[21]) بودند. SSPs مجموعه‌ای از پروتئین‌ها هستند که در مراحل مختلف تکامل دانه در سطوح بالایی در دانه‌ها تجمع می‌یابد. در طول جوانه‌زنی دانه، SSPs تخریب می‌شود و اسیدهای آمینه حاصل توسط گیاهچه‌های در حال توسعه به عنوان یک منبع تغذیه‌ای مورد استفاده قرار می‌گیرد. کروسیفرین در B. napus و B. rapa افزایش بیان نشان دادند. ناپین، LTP و LEA در کتابخانه B. napus افزایش بیان داشتند. رونوشت‌های مربوط به کروسیفرین حدود 40% رونوشت‌های مربوط به SSPs را شامل شد. در حالیکه سهم پروتئین ناپین در بذور بسیار کمتر بود. Delisle و همکاران نرخ رونویسی و بیان هر دو کروسیفرین و ناپین را در بذر B. napus بالا و به ترتیب 11 و 8 درصد میزان رونوشت های کل گزارش نمودند که در توافق با میزان بیان بالای کروسیفرین در نتایج ما بود (23). علاقه تجاری روزافزونی برای بررسی و کنترل تنوع ژنتیکی ترکیب پروتئین ذخیره بذر دانه‌های روغنی وجود دارد، زیرا ناپین و کروسیفرین دارای خواص ساختاری، حرارتی، عملکردی و بیولوژیکی کاملاً متفاوتی هستند که آنها را برای تعدادی از برنامه‌های کاربردی در تولید مواد غذایی و غیر غذایی جذاب می‌سازد (24). علاوه بر این، پروتئین‌های شبه ناپین به عنوان خاصیت ضد میکروبی و ضد باکتریایی نسبت داده می‌شوند (25). Cameron و همکاران نشان دادند که LTP های گیاهی در غلظت‌های بالا در بافت‌های اپیدرمی وجود دارد و توانایی اتصال اسیدهای چرب مورد نیاز برای سنتز کوتین و سوبرین را دارند (26). بعلاوه، القا سنتز LTP با ضخیم شدن لایه کوتیکول همراه است و حذف ژن‌های LTP منجر به تغییر در ترکیب چربی و چگالی لایه کوتیکول می‌شود. از این رو اختلاف در بیان ژن‌های LTP در بین کتابخانه‌ها ممکن است به ترکیبات و ساختار مونومرهایی که در پوشش بذر رسوب می‌کنند مربوط باشد. پروتئین‌های (LEA) گروه متنوعی و گسترده‌ای از پلی‌پپتیدها هستند که نقش مهمی در خشک شدن و تحمل انجماد در گیاهان دارند. Liang و همکاران در توافق با نتایج ما نشان دادند که بیان اکثر BnLEA ها در بذر B. napus افزایش یافته و تکثیر قطعه‌ای و تکثیر کل ژنوم نقش عمده‌ای در گسترش خانواده ژن‌های BnLEA داشته است (27). بنابراین احتمالاً افزایش بیان ژن LEA در مطالعه حاضر در کتابخانه B. napus نسبت به دو کتابخانه دیگر ناشی از فرایند آلو پلی‌پلوئیدی و تکثیر ژن در طی تکامل است.

گروه کارکردی اسید‌های آمینه

در کل، کتابخانه‌ها دارای سطح بیان کمتری از ژن‌های موثر در بیوسنتز اسیدهای آمینه گوگردی شامل سیستئین و متیونین نسبت به سایر اسیدهای آمینه بودند. با وجود بیان پایین این ژن‌ها در هر سه کتابخانه، تفاوت معنی‌داری نیز بین کتابخانه B. napus با دو کتابخانه دیگر وجود داشت (جدول 2). شاید مقدار کم این اسید‌های آمینه به محتوای پایین پروتئین ذخیره‌ای ناپین مربوط باشد چرا که ناپین نسبت به کروسیفرین دارای محتوای بیشتری از اسیدهای آمینه گوگرد سیستئین، متیونین و لیزین است. Malabat و همکاران گزارش کردند که اختلاف موجود در محتوای اسید آمینه بین ژنوتیپ‌های کلزا ممکن است نماینده محتویات مختلف ناپین و کروسیفرین باشد (1). بنابراین اصلاح ژنتیکی ترکیب پروتئین‌های ذخیره بذر مستقیماً بر ترکیب اسید آمینه تأثیر می‌گذارد. در کتابخانه B. oleracea افزایش معنی‌دار بیان ژن (ProDH[22]) نسبت به دو کتابخانه دیگر مشاهده شد. ProDH یک آنزیم فراگیر در موجودات زنده است که نه تنها برای کاتابولیسم پرولین ضروری است بلکه نقش اصلی را در تأمین انرژی، قطع پتانسیل اکسایش اکسیداسیون بین محفظه‌های سلولی و تولید گونه‌های اکسیژن واکنش پذیر دارد. نقش‌های بیولوژیکی ProDH در هموستاز سلول و سازگاری از طریق فرآیندهای انرژی، رشدی، سازگاری، فیزیولوژیکی و آسیب شناختی در یوکاریوت‌ها به شدت مورد تحقیق قرار گرفته است (28). Faës و همکاران در توافق با نتایج ما کاهش بیان ژن ProDH را در بذر B. napus (بر خلاف ریشه و سایر ارگان ها) گزارش نمودند و این را از نظر تکامل مولکولی ناشی از این دانستند که همه توالی های BnaProDH تحت انتخاب تصفیه کننده قوی قرار گرفته اند و برخی از نسخه ها غیر فعال شده اند (29). تعیین نقش ProDH در بذر گونه‌های Brassica برای ایجاد چارچوبی جهت تحقیقات آینده پیشنهاد می‌شود. (AAP[23]) در کتابخانه B. napus نسبت به دو کتابخانه دیگر افزایش بیان نشان داد. AAP یک پروتئین میل ترکیبی با اختصاصیت سوبسترا گسترده در نظر گرفته می‌شود. در گیاهان، AAP نیز در فرآیندهای مختلف فیزیولوژیکی، از جمله جذب آمینو اسیدها، بارگیری فلوئم یا انتقال زایلم-فلوئم، بارگیری بذر و عملکرد بذر نقش دارند (30). AAP های بومی سازی شده در غشای پلاسما در جذب سلولی همراه با H⁺ طیف وسیعی از آمینواسیدها نقش دارند. Zhou و همکاران در توافق با نتایج ما میزان بیان بالای AAP را در B. napus گزارش کردند که ناشی از 34 ژن AAP است و نتایج آنها نشان داد که BnaAAPs تحت فشار انتخاب تصفیه‌کننده قوی قرار گرفته‌اند (31). یک مطالعه اخیر گزارش کرده است که دستکاری ژنتیکی AAP باعث بهبود نقل و انتقال آمینواسیدها از منابع به مقاصد می‌شود و باعث افزایش کارایی استفادهN  (NUE[24]) می‌شود. هر یک از اعضای خانواده AAP الگوی بیان زمانی و مکانی اختصاصی را نشان می‌دهدکه نشان‌دهنده نقش‌های غیر اضافی AAP در گیاهان است (32). بنابراین با استفاده از انتقال ژن AAP اختصاصی بذر می‌توان محتوای آمینو‌اسیدهای انتخابی و حتی پروتئین‌های ذخیره‌ای مورد نیاز جهت مصارف مختلف را بهبود بخشید. به عنوان مثال Schmidt و همکاران نشان دادند که جهش‌یافته‌های فاقد تمایل بالا AAP8 یک فنوتیپ بذر شدید را نشان می‌دهند. فنوتیپ بذر با یک ترکیب آمینو‌اسیدی به طور اختصاصی تغییر یافته ارتباط دارد. اسید آسپارتیک و اسید گلوتامیک درجهش‌یافته‌ها به طور قابل توجهی کاهش می‌یابد. AAP8 نقش مهمی در جذب اسیدهای آمینه به آندوسپرم و تأمین اسیدهای آمینه جنین در حال رشد در طی جنین‌زایی اولیه دارد (33).

گروه کارکردی تنظیم رونویسی

در گروه کارکردی تنظیم رونویسی، عوامل رونویسی شوک حرارتی (Hsfs[25]) در کتابخانه B. napus افزایش بیان داشتند که به عنوان اجزای انتهایی در زنجیره انتقال سیگنال محسوب می‌شوند که با واسطه فعال کردن ژن‌های پاسخ‌دهنده به گرما و سایر تنش‌ها با شناسایی موتیف اتصال پالیندرومیک محافظت شده در پروموترهای ژن‌های القا شده با تنش گرمایی به عنوان عناصر تنش گرمایی شناخته می‌شوند. Hsf گیاهان نه تنها در پاسخ به تنش گرمایی نقش دارند، بلکه در پاسخ به سایر عوامل تنش‌زا و نیز در طول رشد اندام و مراحل توسعه‌ای عمل می‌کنند (34) و گروه A4 Hsf در کنترل هموستاز گونه‌های اکسیژن فعال گیاهان نقش دارند (35). گزارش شده است که HsfA9 در رشد و نمو رویان و رشد دانه در آرابیدوپسیس و آفتابگردان شرکت می‌کند (36). علاوه بر این، بیان بیش از حد HaHSFA9 اختصاصی دانه در تنباکو تحمل کم آبی شدید را در مرحله رویشی ایجاد می‌کند (37). در مطالعه حاضر، از آنجا که سطح بالای بیان Hsf در ژنوم B. napus مشاهده شد، تجزیه و تحلیل مقایسه‌ای ژن Hsf در سه گونه نقش هیبریداسیون و آلوپلی‌پلوئیدی در تکامل ژن Hsf در B. napus برجسته می‌کند. Lohani و همکاران در توافق با نتایج ما نشان دادند که همولوگ ژن Hsf در گونه‌های Brassica یافت می‌شود اما در آرابیدوپسیس وجود ندارد پس پلی‌پلوئیداسیون منجر به تشکیل خوشه‌های ژنی اختصاصی Brassica شده است (38). تغییرات ژنتیکی می‌تواند صفات مختلفی را در یک موجود معرفی کند. در طی تکامل، با تکثیر نسل، افرادِ دارای ویژگیِ مزیت دار به طور فزاینده‌ای در جمعیت رایج می‌شود و باعث می‌شود جمعیت متفاوت از اجداد ایجاد شوند. بنابراین بررسی پیچیدگی روابط تکاملی در ارزیابی تنوع ژنتیکی از اهمیت زیادی برخوردار است و کمک زیادی به اصلاحگران می‌کند (39). از طرفی در کتابخانه B. napus، افزایش بیان ژن‌های درگیر در بیوسنتز فلاونوئید‌ها و فنیل پروپانوئیدها مشاهده شد (این نتایج در جدول 2 نشان داده نشده است). بنابراین، این احتمال وجود دارد که HSFA4a در تنظیم بیان و فعالیت برخی از ژن‌ها مانند فعال‌سازی سیستم آنتی‌اکسیدانی و سایر فاکتورهای پاسخ تنش در تحمل خشک شدگی بذر عمل کند. البته باید این نکته را مد نظر قرار داد که الگوی بیان فضایی و زمانی HSF می‌تواند در بافت‌های مختلف گیاه بر پاسخ های مختلف تأثیر بگذارد. این ویژگی‌ها به این معنی است که مسیرهای انتقال سیگنال HSF شبکه‌های بسیار اضافه و اختصاصی هستند (36). نتایج این مطالعه کمک می‌کند تا زمینه‌ای برای مطالعات عملکردی ژن‌های Hsf در بذرگونه‌های Brassica فراهم شود و درک ما از تنوع عملکردی ژن‌های Hsf گیاهی در طی تکامل بهبود یابد ضمن اینکه تلاش زیادی برای شناسایی بسترهای هدف به منظور درک بهتر عملکرد Hsf در بذور Brassica لازم است. در کتابخانه B. napus افزایش بیان ژن ABI3[26] نسبت به دو کتابخانه دیگر مشاهده شد. ABA بسیاری از فرایندهای بیولوژیکی از جمله القای بسته شدن روزنه، خواب دانه، مهار رشد ریشه و پاسخ استرس محیطی را کنترل می‌کند. آزمایشات بیوشیمیایی و مولکولی نشان داده است که ژن رمزگذار فاکتور رونویسی ABI3 یکی از مهمترین ژن‌های تنظیم‌کننده در مسیر پیام‌رسانی ABA برای رشد بذر در گیاهان است (40). در آرابیدوپسیس فاکتورهای رونویسی از قبیل ABI3 که به طور اختصاصی در بذر بیان می‌شوند، شناخته شده است که در تجمع SSP و کنترل بیان بسیاری از تنظیم کننده‌های دیگر مسیرهای متابولیکی نقش دارند. Xu و همکاران گزارش دادند که پروتئین ABI3 با تنظیم مستقیم توسعه پوسته دانه علاوه بر تنظیم پروتئین‌های ذخیره‌سازی در تحمل خشک شدن نقش دارد (41). بنابراین میتوان استنباط نمود، تفاوت در بیان ABI3 در گونه‌های Brassica ممکن است به تفاوت در ساختار پوسته بذر و یا تجمع پروتئین‌های ذخیره‌سازی مرتبط با خشک شدن بذر ربط داشته باشد. Verdier و همکاران گزارش دادند که تنظیم تجمع ذخیره بذر با تعامل پیچیده هورمون‌ها با فاکتورهای رونویسی همراه است (42). ABA تنظیم‌کننده اصلی بیان ژن در بذور است و با تنظیم‌کننده اصلی ABI3 تعامل دارد و نشان داده شده است که در B. napus، هنگامی که توسط ABA القا شود، سطح کرسیفرین و ناپین بالاتر است (23). پروتئین فسفاتاز ABI1 که تنظیم‌کننده پاسخ ABA در گیاهان است برای تنظیم بیان ژن‌های ناپین در B. napus یافت شد (43).

گروه کارکردی پیام‌رسانی

  EST تفسیر شده دیگری که در کتابخانه B. napus با سایر کتابخانه‌ها اختلاف معنی‌داری داشت می‌توان به پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن (MAPK[27]) اشاره نمود که مربوط به گروه کارکردی پیام‌رسانی است. فسفوریلاسیون برگشت پذیر توسط کینازهای پروتئینی کاتالیز می‌شود که γ- فسفات را از ATP به باقی‌مانده اسیدهای آمینه پروتئین منتقل می‌کند. فسفوریلاسیون می‌تواند به طور چشمگیری آنزیم‌ها را فعال یا مهار کند و بر تعامل پروتئین-پروتئین تأثیر بگذارد. از طریق فسفوریلاسیون، پروتئین کینازها می‌توانند سیگنال‌های سلولی را تقویت و گسترش دهند. به طور فزاینده‌ای در گیاهان و بذرها، پروتئین کینازهای درگیر در پاسخ‌های هورمونی، دفاعی و استرس محیطی در حال کلون‌سازی و مشخص شدن هستند. با این وجود، گزارش‌های اندکی در مورد تکامل خانواده MAPK در گیاهان وجود دارد. به عنوان مثال Kalapos و همکاران تکامل MAPK را در 13 گونه گیاهی بررسی کردند (44) و تا کنون هیچ گزارشی در مورد تکامل این کینازها در گونه‌های Brassica گزارش نشده است و همین امر لزوم تحقیق در این زمینه را نشان می‌دهد.

نتیجه‌گیری

تنوع ژنتیکی محدود و عدم وجود اشکال وحشی طبیعی، یک مشکل عمده در پرورش کلزا است. شناخت خوب از دامنه تنوعی که بر یک ویژگی مشخص تأثیر می‌گذارد، درک درستی از مجموعه ژن‌های موجود را فراهم می‌کند و برای بهبود تنوع از طریق انتخاب ضروری است (45). چنین انتخابی از گیاهان بر اساس تکامل واگرا ژنتیکی در بسیاری از محصولات موفقیت آمیز بوده است. از طرفی میزان محتوا و همچنین ترکیب اسیدهای چرب بذر به شدت تحت تأثیر اثر متقابل ژنوتیپ در محیط است. بنابراین تلاش‌های اصلاحی زمانی از دقت بالا برخوردار خواهند بود که مطالعات ژنتیکی به همراه درک اهمیت اثر متقابل ژنوتیپ در محیط در برنامه‌های طولانی مدت اصلاح گیاهان زراعی با استفاده از آزمایشات مزرعه‌ای تکرار شده و در چند محیط انجام شود (46). چنین تلاش‌هایی در نهایت امکان دستکاری ژن‌های خاص در گونه B. napus برای مهندسی هدفمند متابولیکی در تجمع محتوا و ترکیبات مختلف در جهت مصارف مختلف تغذیه ای و صنعتی فراهم می‌کند. این مهندسی هدفمند از یک طرف می‌تواند به گونه‌ای طراحی شود که روغن کلزا با اسید اروسیک بالا برای اهداف صنعتی مانند تولید بیودیزل تولید کند چرا که اسید اروسیک و مشتقات آن از مواد اولیه مهم تجدید پذیر برای صنعت اولئوشیمی هستند. از طرف دیگر با تولید کلزا دارای ارزش تغذیه‌ای با محتوای اسید لینولنیک و لینولئیک بیشتر به حفظ سلامتی انسان کمک کند. علاوه بر این، تکنیک‌های اصلاحی ممکن است برای استفاده از تنوع ژنتیکی موجود در ترکیب پروتئین و اصلاح آن به سمت کریسفرین بالاتر یا محتوای ناپین بالاتر به کار گرفته شود.