BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
URL: http://ncmbjpiau.ir/article-1-1416-en.html
Comparison of spring and autumn Artemisia aucheri
extracts in in inhibition of HSV- 1 virus replication
Mahsa Zamanian1, Zahra Noormohammadi1
Zohreh Sharifi*2,Tahmineh Akbarzadeh3 ,Farahnaz Bineshian4 ,
1. Department of Biology, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
2. Blood Transfusion Research Center, High Institute for Research and Education in Transfusion Medicine, Tehran, Iran
3. Department of Medicinal Chemistry, Faculty of Pharmacy, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran
4. Department of Parasitology and Mycology, Faculty of Medicine, Semnan University of Medical Sciences, Semnan, Iran.
Abstract
Aim and Background: The use of plants as medicine has always been considered. In the present study, the effect of aqueous extract collected in spring and autumn of Artemisia aucheri on the survival of HSV- 1 virus-infected cells was investigated.
Materials and Methods: In this study, the effect of aqueous extract of Artemisia aucheri in spring and autumn on the survival of Vero cell line after HSV- 1 infection at different times and concentrations was compared using TCID50 and MTT methods. The effect of aqueous extract of Artemisia aucheri at concentrations of 25, 50, 75, and 100 mg / ml on Vero cell line infected with HSV- 1 virus was performed for 24 hours in DMEM medium containing 2% (FBS) and then a dose of 50% Tissue Culture Infectious Dose(TCID50) was determined. Cell viability was also assessed by MTT assay at 2-, 0, 4, 8, and 24 hours.
Results: The dose of 50% TCID50 with different dilutions of spring and autumn aqueous extracts of Artemisia aucheri was determined on Vero cells infected with (MOI = 0.1) HSV- 1 virus by inverted microscope and compared by MTT method. Concentrations of 50, 75, µg/ml and 100 µg/ml of spring extract and concentrations of 50 and 75 µ g / ml of autumn extract significantly reduced viral infection. Among them, spring extract with a concentration of 75 µ g / ml showed the highest viral inhibition and cell survival. Also, a significant difference was observed between spring and autumn aqueous extracts of Artemisia aucheri on cell survival (r = 0.97, P =0.0002).
Conclusion: The results indicated that the spring aqueous extract of Artemisia aucheri has a significant anti-HSV- 1 antiviral effect compared to the autumn aqueous extract of Artemisia aucheri (A = 0.0001) (P = 0.0001).
Keywords: HSV- 1, Artemisia aucheri aqueous extracts, MTT assay, TCID50, Iau Science .
|
Corresponding author: Blood Transfusion Research Center, High Institute for Research and Education in Transfusion Medicine, Tehran, Iran Email: z.sharifi@ibto.ir |
مقایسه دو عصاره آبی بهاره و پاییزه آرتمیزیا اوشری
در مهار تکثیر ویروس 1HSV-
مهسا زمانیان1، زهرا نور محمدی1، زهره شریفی*2، تهمینه اکبرزاده3، فرحناز بینشیان4
1.گروه زیست شناسی، واحد علوم و تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
2. مرکز تحقیقات انتقال خون، موسسه عالی تحقیقات و آموزش در پزشکی انتقال خون، تهران، ایران
3. گروه شیمی دارویی، دانشکده داروسازی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران
4. گروه انگل شناسی و قارچ شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی سمنان، سمنان، ایران.
چکیده
سابقه و هدف: استفاده از گیاهان بهعنوان دارو همیشه مورد توجه بوده است. در مطالعه حاضر، اثر عصاره آبی جمعآوری شده در فصل بهار و پاییز آرتمیزیا اوشری ((Artemisia aucheri بر بقای سلولهای آلوده به ویروس 1HSV- بررسی شد.
مواد و روشها: در این مطالعه، اثر عصاره آبی جمعآوری شده آرتمیزیا اوشری در فصلهای بهار و پاییز بر روی بقای سلولیVero پس از آلودگی با ویروسHSV- 1 در زمانها و غلظتهای مختلف با استفاده از دو روش TCID50 و MTT مورد مقایسه قرار گرفت. اثر عصاره آبی آرتمیزیا اوشری با غلظت 25 ،50، 75 و100 میگروگرم بر میلیلیتر بر روی رده سلولی Vero آلوده به ویروس HSV- 1 طی مدت 24 سـاعت در محیط DMEM حاوی 2% (FBS) انجام گرفت و سپس دوز 50 درصد آلودگی سلول(TCID50) تعیین شد. همچنین زندهمانی سلولی توسط تست MTT در ساعتهای 2 قبل از آلودگی با ویروس 1HSV- ، 0، ،8 و24 بررسی شد .
یافتــهها: تعیین دوز 50 درصد آلودگی سلول (TCID50) با رقتهای مختلف عصاره آبی بهاره و پاییزه آرتمیزیا اوشری بر روی سلولهای Vero آلوده با (1/0MOI=) ویروس 1 HSV-با میکروسکوپ اینورت انجام شد و با روش MTT مقایسـه شد. غلظتهای 50، 75 و 100 میکروگرم بر میلیلیتر عصاره فصل بهار و غلظتهای50 و 75 میکروگرم بر میلیلیتر عصاره فصل پاییز بهطور قابل توجهی عفونت ویروس1HSV- را (از ۱۰۸ به ۱۰۶)کاهش داد. که در این میان عصاره بهاره با غلظت 75 میکروگرم بر میلیلیتر بیشترین مهار ویروسی و میزان بقای سلولی را نشان داد. همچنین اختلاف معناداری بین دو عصاره آبی بهاره و پاییزه آرتمیزیا اوشری بر روی بقای سلول مشاهده شد (97/0r = ، 0002/0 (P=.رگرسیون دو روش انجام شده (TCID50وMTT ) نشان داد که همبستگی بین نتیجه عصاره بهاره و پاییزه وجود دارد.
نتیجهگیری: نتایج نشان داد که کاهش تیتر ویروس در عصاره آبی بهاره آرتمیزیا اوشری در مقایسه با عصاره آبی پاییزه آرتمیزیا اوشری بهطور معنیداری 1HSV- )0001/0 (P= بیشتر بود که حاکی از مؤثر بودن عصاره در کاهش تیتر ویروسی است و میتوان نتیجه گرفت که عصاره بهاره آرتمیزیا اوشری برای درمان تبخال مؤثر است.
واژگان کلیدی: HSV- 1 ، عصاره آبی آرتمیزیا اوشری، MTT assay ،، TCID50، Iau Science .
|
ـــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ نویسنده مسئول: مرکز تحقیقات انتقال خون، موسسه عالی تحقیقات و آموزش در پزشکی انتقال خون، تهران، ایران پست الکترونیکی: z.sharifi@ibto.ir تاریخ دریافت: 03/03/1400 تاریخ پذیرش: 16/04/1400 |
از شایعترین بیماریهای عفونی مسری در سراسر جهان که از طریق بزاق آلوده منتقل میشود، ویروس هرپس سیمپلکس نوع 1 (تبخال دهانی) است (1). ویروس پنهان شده میتواند بهطور مکرر سبب عفونت شود (2).
مطالعه بر روی اثر گیاهان بومی هر منطقه در جلوگیری از عفونتها مانند ویروس تب خال دارای اهمیت است و ارزش اقتصادی فراوانی دارد. بنابراین در قدم اول لزوم بررسی تستهای اولیه و پایهای جهت بررسی اثر ضدویروس بر روی سلول با عصاره گیاهی مورد تحقیق ضروری بهنظر میرسد.
از طرف دیگر محققین بر آن هستند که با استفاده از روشهای درمانی متفاوت، عوارض شدید داروهای سنتتیک را با استفاده از گیاهان دارویی با عوارض کمتر بهبود بخشند. گیاهان بهدلیل داشتن تاننها، فلاونوئیدها و آلکالوئیدها که خاصیت ضدویروسی دارند مورد توجه قرار گرفتهاند (3). درمنه (آرتمیزیا) (Artemisia) یک تیره بزرگ و متنوع از گیاهان است که بین 200 تا 400 گونه از خانواده گل مرواریدAsteraceae)) دارد. درمنه شامل گیاهان علفی و بوتههای مقاوم است که بهدلیل ترکیبهای شیمیایی قدرتمند در روغنهای اساسی شناخته شدهاند. گونههای درمنه در آب و هوای معتدل هر دو نیمکره، بهطور معمول در زیستگاههای خشک یا نیمه خشک رشد میکنند. گونههای قابل توجه عبارتند از: شپشک معمولی ( A. vulgaris) ، مریم گلی (A. tridentate) ، A. annua (مریم گلی) ،افسنطین ) A. absinthium) ،ترخون ) A. dracunculus) و چوب جنوب ) (A. abrotanum (4).
یک بررسی جامع از گونههای مختلف آرتمیزیا را با دامنه وسیع از فعالیتهای بیولوژیکی شامل ضد مالاریا، ضد سمی، ضد باکتریایی، ضد قارچ ، ضد انگل وآنتیاکسیدان نشان داده است. برخی از فعالیتهای بسیار مهم دارویی از این جنس آرتمیزیا کشف شده است، بهویژهArtemisinin ، که ترپنوئیدها، فلاونوئیدها، کومارینها، کافئینوکلینیک اسیدها، استرولها و استیلنها کلاسهای اصلی فیتوکامپوژنهای جنس را تشکیل میدهند (5) همچنین ماده جدید از گونه سیبری آرتمیزیا در درمان سرطان بهنام تترا هیدرو فوران مؤثر شناخته شد (6). از این میان پلیفنولهای اسید چرب که در برگ چای سبز هم موجود است، از عوامل مؤثر بر ضد ویروسی HSV میتواند باشد (7،8). در مطالعهای از بخشهای فعال حاوی تانن عصاره Cornus Canadensis برای جلوگیری از جذب ویروس 1HSV- استفاده شد (9). آرتمیزینین، ماده مؤثره گیاه آرتمیزیا، اثر مهاری بر رشد توکسوپلاسما گوندی داشته است (10). همچنین خاصیت ضد انگلی عصاره آرتمیزیا اوشری بهاره و پاییزه بر روی ماکروفاژها علیه انگل لیشمانیا مطالعه شده است (11).
خاصیت ضد لیشمانیایی عصاره آرتمیزیا نیز بعنوان یکی ازداروهای گیاهی herbal medicine (HM) بررسی شده است (12،13). اثر مهاری عصاره آبی و فراکشن کلروفرم از قسمتهای هوایی گیاه بلغاری Artemisia chamaemelifolia Vill. (Asteraceae) در برابر تکثیر سویه BA HHV نوع 2 (حساس به آسیکلوویر) وسویه DD (مقاوم به آسیکلوویر) در شرایط in vitro بررسی شده است (14).
در این مطالعه، اثرهای ضد ویروسی عصاره آبی گیاه Artemisia aucheri با هدف مقایسه بین دو عصاره آبی بهاره و پاییزه آرتمیزیا اوشری در تعیین بقای رده سلولی Vero آلوده به ویروس 1HSV- با استفاده از روشهای TCID50و MTT بررسی شده است.
مواد و روشها
جمعآوری گیاه آرتمیزیا اوشری و تهیه عصاره
این مطالعه تجربی در آزمایشگاه ویروس شناسی مرکز تحقیقات سازمان انتقال خون ایران انجام پذیرفت حدود. 100گرم اندامهای هوایی گیاه بهاره و 100 گرم از اندامهای هوایی گیاه پاییزه Artemisia aucheri از منطقه سمنان در طی دو بار در سال (۱۳۹۹) جمعآوری شد و طبق پروتکل مقاله Zamanian و همکاران 2021 عصاره گیاه آبی گیاه آرتمیزیا اوشری به روش مایع- مایع تهیه شد و روی رده سلولی Vero کشت داده شده و آلوده به ویروس 1HSV-، برای مطالعهها اثر داده شد (31،15).
سنجش دوز عفونی کشت بافت (TCID50)( Tissue Culture Infectious Dose)
تیتر ویروس با روش سنجش دوز عفونی کشت بافت و فرمول Reed and Muench محاسبه شد. سنجش دوز عفونی کشت بافت یک روش وابستهبه اثر سیتوپاتیک (Cytopathic effect) (CPE) است. تکثیر ویروسها باعث اثر سیتوپاتیک میشوند. مهار اثر سیتوپاتیک نشانگر، فعالیت ضد ویروسی است. بهطور خلاصه، سلولهای Vero در محیط کشت (DMEM ؛Gibco) همراه با 10٪ سرم جنین گاو (FBS) و 1٪ پنیسیلین/استرپتومایسین در فلاسک و در دمای 37 درجه سانتیگراد و 5 درصد2CO انکوبه میشود. پس از رسیدن سلولها به تراکم 85٪، سلولها با استفاده از 2٪ تریپسین جدا میشوند و در پلیت 96 خانه به تعداد 104 برای 24 ساعت کشت داده شد. کشت سلول با غلظتهای لگاریتمی ویروس و عصاره با غلظتهای 25 تا 100میکروگرم در میلیلیتر مخلوط شدو بهمدت 7 روز تا ظاهر شدن اثر سیتوپاتیک انکوبه شد و با استفاده از میکروسکوپ معکوس سلولها مورد ارزیابی قرار گرفت. مقادیر سنجش دوز عفونی کشت بافت با استفاده از روش Reed and Muench محاسبه شد. در نتیجه، نبود اثر سیتوپاتیک بهعنوان شاخصی از فعالیتهای ضد ویروسی عصارهها در نظر گرفته شد و 3 چاهک برای کنترل ویروس (کنترل مثبت) و 3 چاهک برای کنترل داروی آسیکلوویر و همچنین کنترل محیط و سلولها (کنترل منفی) بهعنوان شاهد در این آزمایش قرار گرفتند (16).
روش روش رنگسنجی برای ارزیابی فعالیت متابولیک سلول MTT) (
در روش رنگ سنجی(colorimetric assay for assessing cell metabolic activity)، پس از تیمار سلولها بهمدت 24 ساعت جهت انجام تست رنگسنجی ،محیط رویی خارج گردید و سلولها توسط محلول نمکی بافر فسفات (PBS )شستشو شده و مقدار µl 100 محلول mg/mL MTT 5) رقیق شده در PBS) به هر چاهک اضافه شد و پلیت بهمدت چهار ساعت در دمای0C37 و تاریکی انکوبه گردید. پس از آن محلول رویی هر چاهک خارج شده و بهمقدار µl 100 ایزوپروپانل به هر چاهک اضافه شده و بهمدت 15-20 دقیقه در دمای 0C37 انکوبه گردید و سپس جذب نوری آن در nm 570 خوانده شد و بقای سلولی، محاسبه گردید. درصد بقای سلولی بهصورت (مقدار جذب نوری گروه کنترل/ مقدار جذب نوری گروه تیمار شده) × 100 محاسبه شد. تمامی آزمایشها بهصورت مستقل سه بار تکرار شد (17).
آزمایش رنگسنجی با سه بار تکرار انجام شد و دادهها بهصورت میانگین± انحراف معیار بیان شده است. تجزیه و تحلیل دادهها با روش آنالیز واریانس یکطرفه با استفاده از نرمافزار IBM SPSS Statistics 25 محاسبه شد و تمام بررسیها سطح معناداری آزمونها 05/0> P در نظر گرفته شد.
یافتهها
اثرهای غلظتهای عصارههای گیاهی بر روی دوز عفونی کشت سلول( (TCID50
اثر عصاره آبی بهاره و پاییزه آرتمیزیا اوشری بر روی ویروس 1HSV- با 1/0 MOI =در کشت سلولهای Vero با میکروسکوپ اینورت ارزیابی و آلودگی و تکثیر ویروس HSV- 1 با غلظتهای متفاوت عصارهها در سلولهای Vero تعیین شد.
فعالیت ضد ویروسی با استفاده از غلظتهای 25 تا 100 µg/ml عصاره آبی فصل بهار و پاییز گیاه آرتمیزیا اوشری همزمان با تلقیح ویروس1/0 MOI =1HSV- بهمدت 24 ساعت انجام شد. تیتری از ویروس است که با روش 50 درصد دوز عفونی کننده کشت سلولی (TCID50) تعیین گردید جدول 1.
جدول 1. کاهش تیتراسیون ویروسیHSV- 1 (اثرهای غلظتهای عصارههای گیاهی بر روی دوز عفونی کشت سلول (TCID50
|
|
کاهش لگاریتم تیتر ویروس با (TCID50) |
زمان (ساعت) |
|||||||||
|
|
تیمار با µg/ml25 |
تیمار با µg/ml50 |
تیمار با µg/ml75 |
تیمار با µg/ml100 |
کنترل ویروس |
||||||
|
|
پاییزه |
بهاره |
پاییزه |
بهاره |
پاییزه |
بهاره |
پاییزه |
بهاره |
|||
|
07/0±5/6 |
02/0±3/6 |
03/0±6/5 * |
02/0±7/5* |
02/0±5/5 |
06/0±4/4* |
40/0±6/1 |
51/0±7/5 * |
07/0±8/7 |
24 |
||
* p<0001/0
در این مطالعه، کاهش لگاریتم تیتر ویروسی در غلظتهای آزمایش شده با عصارههای گیاهی در مقایسه با کنترل ویروس که از 8/7 به حدود 4/4 کاهش مییابد.
همانطور که در جدول 1 نشان داده شده است ، پنج مورد استخراج (عصاره آبی فصل بهار آرتمیزیا اوشری در غلظت 50،75 و µg/ml 100 و در عصاره فصل پاییز 50 و µg/ml 75) بهطور قابلتوجه و معنیداری (01/0 p<) عفونت ویروسی را کاهش داد. که در این میان عصاره بهاره µg/ml75 بیشترین مهار ویروسی 104را نشان داد.
دادهها بهصورت SD از سه آزمایش مستقل است. آزمون ANOVA یکطرفه و مقایسههای چندگانه برای تجزیه و تحلیل آماری استفاده شد.
غلظتهای مختلف عصارههای آبی بهاره و پاییزه آرتمیزیا اوشری بر روی سلول آلوده به ویروس 1HSV-
روش MTT با 3بار تکرار بر روی سلول آلوده به ویروس 1HSV- در سه سری جداگانه انجام شد و اثر سیتوپاتیک بعد از 24 ساعت، پایینترین میزان زنده مانی سلول با ویروس HSV- 1 را نشان داد. )نمودار1(.
در روش MTT میزان بقای سلولی نسبتبه گروه کنترل سلول و داروی آسیکلوویر µg/ml50 در غلظتهای µg/ml75 عصاره آبی بهاره و پاییزه آرتمیزیا اوشری تفاوت معناداری داشت. 0002/0 p= و بقای سلولی در کنترل ویروس به پایینترین مقدار خود با میانگین 32/14% رسید (جدول 2).
میانگین بقای سلولی بهدست آمده نسبتبه گروه کنترل سلول و داروی آسیکلوویر با گروه کنترل ویروس معادل 2/4% در 24 ساعت بعد از انکوباسیون بود، در صورتیکه در رقت µg/ml75 بهاره بالاترین بقای سلولی% 7/66 و برای عصاره پاییزه در همین غلظت بالاترین بقا%6/57 بود و سلولهای vero بهعنوان معیار کنترل سلولی در نظر گرفته شد (جدول2) و همانطوریکه در نمودار 2 مشاهده میشود میزان بقای سلولی غلظت µg/ml75 عصاره آبی بهاره و پاییزه آرتمیزیا اوشری نسبتبه گروه کنترل ویروس تفاوت معناداری داشت (001/0. p<).
غلظتهای مختلف عصاره های آبی بهاره و پاییزه آرتمیزیا اوشری به سلول Vero اضافه شد و درصد سلولهای زنده بعد از 24 ساعت بهروش MTT بررسی شد. نتایج بر اساس 3 بار تکرار مستقل برای هر تست و به صورت میانگین ± انحراف معیار نشان داده شده است (جدول 2).
همبستگی بین دو گروه بهاره و پاییزه عصاره آبی آرتمیزیا اوشری
براساس نتایج بهدست آمده از رگرسیون بقای سلولی، میزان همبستگی چشمگیری از نوع خطی، مثبت و معنادار بین دو گروه عصاره موجود است و ضریب همبستگی معنیداری بین روشهای MTT و TCID50 در عصاره آبی آرتمیزیا اوشری وجود داشت (97/0 r = ، 0002/0 (P=.
نمودار 1. مقایسه غلظتهای مختلف عصارههای آبی بهاره و پاییزه آرتمیزیا اوشری بر روی سلول آلوده به ویروس 1HSV- با روشMTT طی 24 ساعت.
جدول 2. تفاوت میزان بقای سلولهایVero پس از آلودگی با ویروس 1HSV- با بررسی اثر ضد ویروسی عصاره آبی بهاره و پاییزه آرتمیزیا اوشری بهروش MTT
|
P-value |
در صد سلول زنده پس از مجاورت با عصاره آبی 24 ساعت بعد با آلودگی سلول با ویروس |
P-value |
در صد سلول زنده پس از مجاورت با عصاره آبی 8 ساعت بعد با آلودگی سلول با ویروس |
P-value |
در صد سلول زنده پس از مجاورت با عصاره آبی 4 ساعت بعد با آلودگی سلول با ویروس |
P-value |
در صد سلول زنده پس از مجاورت با عصاره آبی همزمان با آلودگی سلول با ویروس |
P-value |
در صد سلول زنده پس از مجاورت با عصاره آبی 2ساعت قبل از آلودگی سلول با ویروس |
عصاره آبی آرتمیزیا اوشری |
ساعت / غلظت (µg/ml) |
|
*02/0 |
2/49±6/5 |
*004/0 |
4/69±2/1 |
148/0 |
6/92±1/1 |
759/0 |
9/88 ±4/5 |
019/0* |
1/97 ±9/2 |
بهاره |
25 |
|
2/51±1/6 |
4/83±7/3 |
7/78±3/9 |
9/87 ±3/4 |
6/91 ±3/4 |
پاییزه |
|
|||||
|
975/0 |
4/51±1/8 |
00/1 |
9/73±4/6 |
*000/0 |
3/87±3/1 |
069/0 |
8/84 ±0/5 |
062/0 |
0/91 ±7/2 |
بهاره |
50 |
|
8/51±7/7 |
9/73±3/2 |
3/77±2/1 |
4/87 ±8/3 |
2/93 ±7/2 |
پاییزه |
|
|||||
|
496/0 |
7/66±0/1 |
362/0 |
4/84±7/3 |
*000/0 |
6/92±1/1 |
205/0 |
9/95 ±1/4 |
676/0 |
2/96 ±9/3 |
بهاره |
75 |
|
6/57±6/8 |
9/81±4/7 |
3/81±1/2 |
5/89 ±8/1 |
6/93 ±9/3 |
پایزه |
|
|||||
|
*003/0 |
4/57±2/1 |
917/0 |
5/77±2/2 |
678/0 |
5/83±7/1 |
324/0 |
7/95 ±0/3 |
967/0 |
9/94 ±0/6 |
بهاره |
100 |
|
1/46±2/1 |
2/77±0/4 |
5/81±3/7 |
8/91 ±4/6 |
1/97 ±2/5 |
پاییزه |
|
P-valu* گمتر از 05/0
Mean±SD دادهها بهصورت میانگین ± انحراف معیار از دو آزمون مستقل بیان شده است.
بحث
هرپس HSV- 1 یکی از شایعترین بیماریهای عفونی در انسان است با دو نوع عفونت معرفی میشوند: 1) عفونت دهان با ویروس هرپس سیمپلکس نوع 1HSV- 2) عفونت تناسلی با نوع دوم)2HSV-) (1). از میان داروهای پیشنهادی برای درمان هرپس، Acyclovir بهطور گستردهای بهعنوان داروی انتخابی مورد استفاده قرار میگیرد (18). یک مشکل عمده در ارتباط با استفاده از آسیکلوویر، توسعه سویههایHSV مقاوم به دارو بهویژه در بیماران ایدزی است (19). در پی یافتن داروهای ضد هرپسی، گیاهان دارای تانن، فلاونویید و آلکالویید ویژگیهای ضد ویروسی دارند (20).
در این پژوهش اثر ضد ویروسی آرتمیزیا که بومی ایران است، بر روی ویروس هرپس سیمپلکس تیپ یک بررسی میشود.
بهنظر میرسد راهکار درمانی گیاهی جایگزین برای مهار ویروس 1HSV- با استفاده از عصاره گیاهی بهجای داروی روتین (اسیکلوویر) با توجهبه طبیعی بودن این ترکیب نسبتبه داروهای سنتتیک که دارای عوارض کمتری باشد. بههمین علت ارزیابی عصاره گیاهی آرتمیزیا اوشری بر ویروس 1HSV- با بررسی تفاوت اثر ضد ویروسی گیاه در فصول مختلف سال از اهمیت بالایی برخوردار است.
هدف از این مطالعه ارزیابی عصاره گیاهی آرتمیزیا اوشری در برداشت محصول در فصول مختلف بر مهار ویروس 1HSV- بود.
در این مطالعه با روش MTT جهت تعیین بقای رده سلولی Vero آلوده به HSV- 1 تیمار شده با غلظتهای مختلف عصاره آبی بهاره و پاییزه آرتمیزیا اوشری در زمانهای مختلف مورد ارزیابی و مقایسه قرار گرفتند. یافتههای بهدست آمده نشان داد که غلظتها بهصورت وابستهبه زمان میتواند سبب افزایش بقای سلولی Vero آلوده بهHSV- 1 گردد و این در حالی بود که نتایج حاصل ازمقایسه TCID50 با روش MTT مورد مطالعه، یکدیگر را تأیید کردهاند و میزان همبستگی بین گروهها بالا بود.
در مطالعه ما، عصاره آبی فصل بهار آرتمیزیا اوشری در غلظت µg/ml 50، 75و 100 و عصاره فصل پاییز µg/ml 50 و 75 بهطور قابلتوجهی عفونت ویروسی را کاهش داد. که در این میان عصاره بهاره µg/ml 75 بیشترین مهار ویروسی را نشان داد که در تأیید تست MTT با غلظت µg/ml 75 بهاره عصاره آبی آرتمیزیا اوشری با بالاترین بقای سلولی % 7/66 و در همین غلظت برای عصاره پاییزه (%6/57) بود.
نتایج مطالعههای حاضر در این پژوهش با سایر مطالعههای انجام گرفته دیگر همخوانی دارد. در سال 2019 در مطالعههای Angelova بالاترین اختلاف در تیتر ویروس تحت درمان و کنترل (در ساعت 4 بعد برای سویه DD و در ساعت 6 برای سویه BA برای 2HSV-) پس از اولین تماس ویروس با عصاره آرتمیزیا اندازهگیری شدکه نشان از این داشت که عصاره آبی آرتمیزیا بیشتر از فراکشن کلروفرمی در مهار تیتر ویروسی اثر داشت. در مطالعههای ما تأثیر عصاره بهاره از عصاره تهیه شده در فصل پاییز آرتمیزیا اوشری مؤثرتر نتیجه داد (14) .
یکی از سؤالهای مهم این ا ست که کدام روش آزمایشگاهی برای آغاز تشخیص یک داروی طبیعی جایگزین مناسب ا ست؟ مطالعاههای Hosseini در 2014 نشان داد که استفاده از رنگ سنجی MTT و رنگآمیزی تریپانبلو میتوانند روشهای مناسبی در ارزیابی بقای سلولی باشد ولی رنگآمیزی با تریپانبلو در اولویت نسبتبه روش MTT قرار نمیگیرد (21، 22). و روش MTT نسبتبه روش تریپانبلو از حساسیت بیشتری برخوردار است (23)، نتایج تحقیقات پروژه ما نیز نشان از تأیید حساسیت روش MTT داشت. در مطالعه سال 2002 روش رنگسنجی با روش رادیو اکتیو مورد مقایسه قرار گرفته بود که نتایج حاصله دارای همبستگی و حساسیت قابلقبول بود ولی روش رنگ سنجی بهدلیل کم خطر بودن و سهولت پیشنهاد گردید (24). بنابر گزارشهای محققین، روش MTT روشی دقیق و سریع در تعیین حساسیت دارویی در طی پروسه درمان است و مناسب بودن، هزینه کم و سهولت انجام کار سبب کاربرد فراوان این روش شده است (25) و در آزمایشهای ما نیز زمان صرف شده برای روش MTT کمتر بوده و سهولت بیشتری نسبتبه روش TCID50 داشت.
در مطالعههای Rasouli در سال 2020 هم از مقایسه دو روش تریپانبلو و MTT برای تأیید آنتیلیشمانیا بودن Achillea santolina essential oil (ASEO) استفاده شد (13). در مطالعهها در صد بقا سلولهای Vero در حضور رقهای لگاریتمی ویروس 1HSV- در سال 2021، بقا در حضور ویروس نسبتبه کنترل کاهش یافت و اختلاف دو روش تریپانبلو و MTT در ویروس بدون رقت تا رقت 3-10 بیشتر آشکار بود (15).
در تحقیقات Moradi در سال 2018، پنجاه و چهار گیاه دارویی متعلقبه 36 خانواده مختلف با توانایی ضد ویروسی ثبت شد که 27 گیاه بهطور جداگانه به خانوادههای خاصی از گیاهان تعلق داشت و پتانسیل درمانی گیاهان دارویی در برابر بیماریهای رایج ویروسی ذکر شده در منطقه اعلام شد. از تلفیق گیاهان Sambucus nigra ، Caesalpinia pulcherrima و Hypericum connatum که دارای فعالیتهای خاص ضد ویروسی در ریشه کن کردن عفونت ویروسی پیچیده بر روی مدلهای حیوانی تجربی به اثبات رسید، نتایج امیدوار کنندهای بهدست آمد (26) و نیز مشابه نتایج مطالعههای ما، فعالیت مهار ویروسی عصاره آبی آرتمیزیا اوشری بر روی ویروس 1HSV- مشهود بود.
فارماکودینامیکی طب سنتی چینی (TCM) نیز در مورد HSV- 1 در مطالعههای Li در سال 2018 بهعنوان یک منبع بالقوه برای درمان1HSV- با فعالیتهای ضدویروسی مستقیم (جلوگیری از اتصال ویروس / جذب / نفوذ / همانند سازی) یا غیرمستقیم (کاهش حساسیتبه 1HSV- یا تنظیم اتوفاژی) عمل کرد (27). نتایج ارائه شده در مطالعههای Lavoie و همکارانش در سال 2017 از فعالیت ضدویروسی عصاره Cornus canadensis در طب سنتی آمریکای بومی استفاده شد (9).
طی مطالعهای با درمان موضعی و خوراکی Zanqueta و همکاران در سال 2019 نشان داد که اسیدهای فنولیک (اسیدهای کلروژنیک) و لاکتونهای سسکوئیترپن (پارتنولید) CHE(crude hydroethanolic extract) یعنی ترکیب شیمیایی یک عصاره هیدرواتانولی خام Tanacetum parthenium در برابر عفونت HSV- 1 مؤثر است و نتایج تجویز موضعی آن با آسیکلوویر قابل مقایسه بود (28)، در مطالعه حاضر نیز نتایج 75 میکروگرم بر میلیلیتر عصاره آبی بهاره آرتمیزیا اوشری با داروی آسیکلوویر در مهار تیتر ویروسی معنیدار بود 001/0. P=
در تحقیقات Pizzo در سال 2020، فعالیت عصارههای غنی از پلیفنول هسته پسته با پوسته پوسته شده طبیعی (NPRE) (Pistacia vera L.) روی همانندسازی ویروس هرپس سیمپلکس نوع (1HSV- ) در سل لاین Vero برای ارزیابی سمیت سلولی و فعالیت ضدویروسی استفاده شدکه دارای فعالیت مهاری قابل توجهی در برابر HSV- 1 بود (29). در این پروژه نیز مهار ویروسی 1HSV- توسط عصاره آبی آرتمیزیا اوشری در سلولهای Vero با دو روش TCID50 و MTT مشهود بود.
مطالعه Rahiminejad در سال 2018 نشان داد عصاره هیدروالکلی A. absinthium فعالیت ضد لشمانیایی قابلتوجهی در برابر پروماستیگوتها و آماستیگوتها در غلظتهای مختلف پس از 48 و 72 ساعت نشان دارد (12). در پروژه ما نیز اثر 24 ساعت عصاره آبی آرتمیزیا اوشری را بر ضدویروس 1HSV- مورد تأیید قرار گرفت (12).
مطالعه Ali, A.N.M و همکاران در2020 نشان داد که اثرهای سیتوتوکسیک عصاره آرتمیزیا اوشری وابستهبه دوز بود. این herbal medicine (HM) از طریق القای پراکسیداسیون لیپید غشا و آپوپتوز، اثرهای سمیت سلولی را علیه سلولهای HT29 سرطان کلون اعمال میکند (30).
در مطالعههای KarimiPour در سال 2020 نیز IC50 (نصف غلظت مهار کننده) بعد از 24 ساعت برای عصاره بهاره آرتمیزیا اوشری µg/ml 119و عصاره پاییزه آرتمیزیا اوشری µg/ml136 بر روی ماکروفاژها علیه انگل لیشمانیا محاسبه شد (11). که نتایج آن مشابه مطالعه ما بود و نشان از حساسیت بیشتر عصاره آبی بهاره نسبتبه عصاره آبی پاییزه آرتمیزیا اوشری دارد و از نظر آماری معنیدار بود (97/0 r = ، 0002/0 .(P=.
از محدودیتهای مطالعه حاضر، دسترسیبه اطلاعات و پرداخت هزینه مقالهها و متغییرهای ناخواسته (گونه جمعآوری شده از یک منطقه محدود بود) و لذا در این حیطه هنوز ضرورت انجام پژوهش وجود دارد.
نتیجهگیری
پژوهش کنونی بیان میدارد، که عصاره حاصل از دو فصل بهار و پاییز آرتمیزیا اوشری تا حد زیادی با یکدیگر همبستگی داشته و با توجهبه حساسیت بیشتر عصاره آبی فصل بهاره آرتمیزیا اوشری، نسبتبه عصاره آبی فصل پاییزه آرتمیزیا اوشری میتوان نتیجه گرفت که در بررسی نحوه عملکرد عصاره آبی حاصل از گیاه فصل بهاره آرتمیزیا اوشری در مهار رده سلولی Vero آلوده به 1HSV- مؤثرتر عمل کرده و میتواند با تحقیقهای بیشتر در درمان هرپس سیمپلکس نوع 1جایگزین داروی سنتتیک پیشنهاد شود.
سپاسگزاری
در اجرای این پروژه تحقیقاتی که در مرکز تحقیقات سازمان انتقال خون ایران انجام گردیده است از مؤسسه عالی طب انتقال خون نهایت قدردانی و سپاس را داریم.
منابع
1. De Oliveira, A., et al., Inhibition of herpes simplex virus type 1 with the modified green tea polyphenol palmitoyl-epigallocatechin gallate. Food and chemical toxicology, 2013. 52: p. 207-215.
2. Hill, C., et al., Epidemiology of herpes simplex virus types 2 and 1 amongst men who have sex with men attending sexual health clinics in England and Wales: implications for HIV prevention and management. Eurosurveillance, 2009. 14(47): p. 19418.
3. Özçelik, B., M. Kartal, and I. Orhan, Cytotoxicity, antiviral and antimicrobial activities of alkaloids, flavonoids, and phenolic acids. Pharmaceutical biology, 2011. 49(4): p. 396-402.
4. Adewumi, O.A., V. Singh, and G. Singh, Chemical composition, traditional uses and biological activities of artemisia species. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 2020. 9(5): p. 1124-1140.
5. Bora, K.S. and A. Sharma, The genus Artemisia: a comprehensive review. Pharmaceutical Biology, 2011. 49(1): p. 101-109.
6. Mohamed, T.A., et al., A new Tetrahydrofuran sesquiterpene skeleton from Artemisia sieberi. Journal of the Chinese Chemical Society.
7. Xi, J., et al., Characterization of polyphenols from green tea leaves using a high hydrostatic pressure extraction. International Journal of Pharmaceutics, 2009. 382(1-2): p. 139-143.
8. Dix, R., L. Pereira, and J. Baringer, Use of monoclonal antibody directed against herpes simplex virus glycoproteins to protect mice against acute virus-induced neurological disease. Infection and immunity, 1981. 34(1): p. 192-199.
9. Lavoie, S., et al., Chemical composition and anti-herpes simplex virus type 1 (HSV- 1) activity of extracts from Cornus canadensis. BMC complementary and alternative medicine, 2017. 17(1): p. 1-12.
10. Sarciron, M. and A. Gherardi, Cytokines involved in Toxoplasmic encephalitis. Scandinavian Journal of Immunology, 2000. 52(6): p. 534-543.
11. KarimiPourSaryazdi, A., et al., In-vitro and in-vivo comparative effects of the spring and autumn-harvested Artemisia aucheri Bioss extracts on Leishmania major. Journal of ethnopharmacology, 2020. 257: p. 112910.
12. Rahiminejad, A., et al., The In Vitro Effect of Hydroalcoholic Extract of Artemisia absinthium on the Growth of Leishmania major (MRHO/IR/75/ER) in Peritoneal Macrophages from BALB/c Mice. Jundishapur J. Microbiology, 2018. 11(11).
13. Ayrom, F., S. Rasouli, and B. Shemshadi, In Vitro Antileishmanial Activity of Achillea santolina Essential Oil against Leishmania infantum Promastigote by Methyl Thiazole Tetrazolium (MTT) and Trypan Blue Colorimetric Methods. Archives of Razi Institute, 2020.
14. Angelova, P., et al., ANTIHERPES VIRUS ACTIVITY OF EXTRACTS FROM ARTEMISIA CHAMAEMELIFOLIA VILL. Comptes rendus de l’Académie bulgare des Sciences, 2019. 72(11).
15. Zamanian, M., et al., Comparison of MTT and Trypan Blue methods in determining the survival of Vero cell line in HSV- 1 infection. Scientific Journal of Iran Blood Transfus Organ, 2021. 18(1): p. 18-26.
16. Smither, S.J., et al., Comparison of the plaque assay and 50% tissue culture infectious dose assay as methods for measuring filovirus infectivity. Journal of virological methods, 2013. 193(2): p. 565-571.
17. Burton, J.D., The MTT assay to evaluate chemosensitivity, in Chemosensitivity. 2005, Springer. p. 69-78.
18. Moradi, M.-T., M. Rafieian-Kopaei, and A. Karimi, A review study on the effect of Iranian herbal medicines against in vitro replication of herpes simplex virus. Avicenna journal of phytomedicine, 2016. 6(5): p. 506.
19. Andrei, G., et al., Heterogeneity and evolution of thymidine kinase and DNA polymerase mutants of herpes simplex virus type 1: implications for antiviral therapy. The Journal of infectious diseases, 2013. 207(8): p. 1295-1305.
20. Daikoku, T., et al., Polyphenols including catechin from green tea with in vitro antiviral activity exhibited anti-herpes simplex virus activity but not anti-influenza virus activity in mice. Journal of Traditional Medicines, 2011. 28(2): p. 63-72.
21. Hosseini, F., M. Reza Sam, and N. Jabbari, Radiosensitivity of radioresistant colorectal cancer cells after treatment with docosahexaenoic acid and irradiation. Tehran University Medical Journal, 2014. 72(3): p. 139-146.
22. Bellamakondi, P.K., et al., In vitro cytotoxicity of caralluma species by MTT and trypan blue dye exclusion. Asian J Pharm Clin Res, 2014. 7(2): p. 17-9.
23. Shokrgozar, M., et al., Comparison of MTT and Trypan blue colorimetric methods for determining the cytotoxicity of calprotectin on human stomach cancer cells under laboratory conditions. Kowsar Med J, 2007. 12(2): p. 127-37.
24. Heidari, M., et al., Comparative measurement of in vitro T-2 toxin cytotoxicity using three different cytotoxicity assays. Toxicology mechanisms and methods, 2003. 13(2): p. 153-157.
25. Fotakis, G. and J.A. Timbrell, In vitro cytotoxicity assays: comparison of LDH, neutral red, MTT and protein assay in hepatoma cell lines following exposure to cadmium chloride. Toxicology letters, 2006. 160(2): p. 171-177.
26. Akram, M., et al., Antiviral potential of medicinal plants against HIV, HSV, influenza, hepatitis, and coxsackievirus: a systematic review. Phytotherapy Research, 2018. 32(5): p. 811-822.
27. Li, W., et al., Traditional Chinese medicine as a potential source for HSV- 1 therapy by acting on virus or the susceptibility of host. International journal of molecular sciences, 2018. 19(10): p. 3266.
28. Benassi-Zanqueta, É., et al., Evaluation of anti-HSV- 1 activity and toxicity of hydroethanolic extract of Tanacetum parthenium (L.) Sch. Bip.(Asteraceae). Phytomedicine, 2019. 55: p. 249-254.
29. Musarra-Pizzo, M., et al., In vitro anti-HSV- 1 activity of polyphenol-rich extracts and pure polyphenol compounds derived from pistachios kernels (Pistacia vera L.). Plants, 2020. 9(2): p. 267.
30. Ali, A.N.M., N.A.-H.A.A. Saeed, and H.A. Omear, The Anticancer Properties of Artemisia aucheri Boiss Extract on HT29 Colon Cancer Cells. Journal of gastrointestinal cancer, 2020: p. 1-7.
31. Zamanian M.,et al. Antiviral effect of Artemisia aucheri aqueous extract on UL46 and US6 genes of HSV- 1.Antiviral Therapy,Accepted 2021
Received: 2021/09/11 | Accepted: 2021/09/1 | Published: 2021/09/1
| Rights and permissions | |
 |
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License. |
